中國荷斯坦牛PIN1 基因?qū)Ξa(chǎn)奶性狀的遺傳效應(yīng)分析

林 珊 ，楊宇澤，劉 林，李艷華，韓 博，許令娜，張俊楠，麻 柱，張勝利，孫東曉*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.北京市畜牧總站，北京 100107；3.北京奶牛中心，北京 100192）

產(chǎn)奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率是奶牛的主要生產(chǎn)性狀，屬于數(shù)量性狀，由微效多基因控制[1]。與傳統(tǒng)的以表型數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的遺傳評估相比，標(biāo)記輔助選擇可以利用DNA 水平的分子信息，從而獲得更快的遺傳進(jìn)展。Meuwissen 于2001 年第一次提出基因組選擇（Genomic Selection，GS）[2]。自2009 年始，美國、加拿大等奶業(yè)發(fā)達(dá)國家陸續(xù)將GS 技術(shù)應(yīng)用于奶牛育種[3-5]，我國從2012 年開始在全國范圍內(nèi)開展荷斯坦青年公?；蚪M遺傳評估工作[6-7]?；蚪M選擇可實(shí)現(xiàn)青年公牛的早期選擇，極大縮短世代間隔，加快遺傳進(jìn)展，節(jié)約育種成本[2,8]。Zhang 等[9]研究表明，在基因組選擇所用的全基因組SNP 芯片中加入遺傳效應(yīng)較大的基因信息可提高基因組育種值估計(jì)準(zhǔn)確性。因此，鑒定奶牛重要性狀功能基因具有重要意義。

作者前期對8 頭來自同胞或半同胞家系的極端高低乳脂乳蛋白率的荷斯坦公牛進(jìn)行了全基因組重測序，通過生物信息學(xué)分析鑒定到17 個產(chǎn)奶性狀候選功能基因[10]。其中，肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶基因（Peptidylprolylcis/transisomerasesNIMA-interacting1，PIN1）參與乳脂、乳蛋白合成代謝相關(guān)通路，包括甘油三酯代謝、甘油磷脂代謝以及mTOR 信號通路，且位于產(chǎn)奶量和乳蛋白量性狀的QTL 顯著區(qū)間[11]。牛PIN1基因定位于7 號染色體上，全長12 255 bp（ARS-UCD1.2），編碼肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶，能夠特異性催化磷酸化的絲/蘇氨酸-脯氨酸基序[12]，可參與調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡[13]、乳腺細(xì)胞增殖[14]、乳脂和乳脂蛋白相關(guān)通路PI3K/AKT/β-catenin 中多個關(guān)鍵蛋白的調(diào)控[15]。本研究以PIN1基因?yàn)檠芯繉ο?，基于北京地區(qū)中國荷斯坦牛群體，進(jìn)一步研究其多態(tài)性及其對產(chǎn)奶性狀的遺傳效應(yīng)，以期為中國荷斯坦牛的分子標(biāo)記輔助選擇提供基因信息。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 本研究以北京首農(nóng)畜牧綠荷牛業(yè)的40個公牛家系的987 頭中國荷斯坦母牛為實(shí)驗(yàn)群體，牛只具有完整的系譜信息和規(guī)范的 DHI（Dairy Herd Improvement）測定記錄，包括第1 泌乳期記錄947 條和第2 泌乳期記錄655 條，描述性統(tǒng)計(jì)量見表1 和表2。表型數(shù)據(jù)包括產(chǎn)奶量、乳脂率、乳脂量、乳蛋白率和乳蛋白量5 個性狀，均由北京奶牛中心提供。

表1 中國荷斯坦牛試驗(yàn)群體的第1 泌乳期5 個產(chǎn)奶性狀表型值描述性統(tǒng)計(jì)

表2 中國荷斯坦牛試驗(yàn)群體的第2 泌乳期5 個產(chǎn)奶性狀表型值描述性統(tǒng)計(jì)

1.2 基因組DNA 的提取 中國荷斯坦母牛的基因組DNA 提取采用血液基因組 DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）40 頭公牛的凍精基因組提取采用優(yōu)化的高鹽法進(jìn)行提取[16]。提取后DNA 采用 NannoDrop2000 分光光度計(jì)（Thermo Scientific，Hudson，DE，美國）和1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度和純度，合格的DNA 置于1.5 mL 離心管，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 候選基因的多態(tài)性檢測 根據(jù)GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）中牛PIN1基因（GenBankNo.AC_000165.1）的全部編碼區(qū)以及上下游調(diào)控區(qū)2 000 bp，利用Primer5.0 設(shè)計(jì)9 對引物，擴(kuò)增片段長度為471～839 bp（表3）。利用NanoDrop2000 分光光度計(jì)（ThermoScientific，Hudson，DE，美國）分別測定40頭公?；蚪MDNA 的濃度并將其稀釋為50 ng/μL，吸取1μL 混池后PCR 擴(kuò)增測序以檢測基因的多態(tài)性。PCR反應(yīng)體系為25μL：10 pmol/μL 上、下游引物各1.25 μL，2× Taq Master Mix 12.5 μL，混池基因組DNA（50～100 ng/μL）2 μL，ddH2O 8 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94℃5min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物以1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因有限公司進(jìn)行雙向測序?；跍y序結(jié)果，利用Chromas 和DNAMan6.0 軟件鑒定多態(tài)位點(diǎn)及突變類型。利用靶向測序基因型（Genotyping By Target Sequencing，GBTS）技術(shù)對987 個個體進(jìn)行SNP 基因型檢測。

1.4 關(guān)聯(lián)分析 本研究采用 SAS 9.2 軟件中的 MIXED過程對實(shí)驗(yàn)群體的中國荷斯坦母牛產(chǎn)奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率5 個產(chǎn)奶性狀和SNP 位點(diǎn)基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，共利用2 827 頭牛個體信息，采用動物模型如下：

Y=μ+hys+b×M+G+a+e

其中，y 為個體產(chǎn)奶性狀（產(chǎn)奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率）表型值，μ 為總體均值，hys 為場年季效應(yīng)，b 為協(xié)變量 M 的回歸系數(shù)，M 為產(chǎn)犢月齡效應(yīng)，G 為基因型，a 為個體隨機(jī)加性效應(yīng)，e 為隨機(jī)殘差效應(yīng)。多重比較采用Bonferroni 法進(jìn)行矯正。

加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)和替代效應(yīng)的計(jì)算公式如下：

a=（AA-BB）/2；d=AB-（AA+BB）/2；α=a+d（q-p）

其中，a 為加性效應(yīng)，d 為顯性效應(yīng)，α 為等位基因替代效應(yīng)；AA、AB、BB 為相應(yīng)基因型產(chǎn)奶性狀最小二乘均值。

表3 用于PNI1 基因混池測序的9 對PCR 擴(kuò)增引物序列信息

1.5 組織表達(dá)譜分析 為進(jìn)一步檢測PIN1基因的潛在功能，本研究進(jìn)行了組織表達(dá)譜分析，包括乳腺、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴和胃。選擇3 頭泌乳期荷斯坦母牛，采集3 頭牛的8 種組織，液氮保存待用。利用Trizol 試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，美國）提取每頭母牛每個組織的總RNA，使用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)（Thermo Scientific，Hudson，DE，美國）和1.0% 凝膠電泳檢測RNA 的濃度和質(zhì)量。利用PrimerScriptH RT 試劑盒（TaKaRa 生物技術(shù)有限公司，大連）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)NCBI 網(wǎng)站PIN1的cDNA 序列（NM_001034632.3）設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子引物，PCR 產(chǎn)物長度為252 bp，上、下游引物序列分別為：CATCACTAATGCCAGCCAGT 和CTGAACTGTGAGG CCAGAGA。

采用羅氏熒光定量PCR 儀（Roche，Penzberg，德國）檢測PIN1基因的mRNA 相對表達(dá)量，反應(yīng)體積為15 μL：cDNA 模板2 μL，上、下游引物（10 mmol/L）各0.375 μL，蒸餾水4.75 μL，SYBR Green 混合物7.5 μL。PCR 條件：95℃ 10 min；95℃ 10 s，58℃ 10 s，72℃ 10 s，45 個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。定量PCR 使用3 個生物學(xué)重復(fù)和3 個技術(shù)重復(fù)，以GAPDH（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase）基因?yàn)閮?nèi)參，用2-ΔΔCt方法對基因相對表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[17]。

2 結(jié)果

2.1PIN1基因多態(tài)性鑒定結(jié)果 以40 頭公牛的基因組混池DNA 為模板，利用9 對引物對PIN1基因分段PCR 擴(kuò)增并進(jìn)行PCR 產(chǎn)物直接測序，結(jié)果在內(nèi)含子2鑒定到1 個G/A 突變，命名為 g.14432394G＞A（圖1）。SNP 位點(diǎn)的等位基因G、A 的頻率分別為0.479 7 和0.520 3，基因型AA、AG 和GG 的頻率分別為0.233 0、0.493 4 和0.273 6。卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示，該SNP 位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)（P=0.716 8，表4）。

圖1 中國荷斯坦牛PIN1 基因的SNP 位點(diǎn)測序結(jié)果

2.2PIN1基因與產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果 SNP 位點(diǎn)g.14432394G＞A 與5 個產(chǎn)奶性狀（產(chǎn)奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率）的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表5。在第1 泌乳期，g.14432394G＞A 與產(chǎn)奶量、乳脂量乳、蛋白量和乳蛋白率均達(dá)到顯著（P=0.049 3）或極顯著關(guān)聯(lián)（P=0.000 1～0.001 9），與乳脂率關(guān)聯(lián)不顯著（P=0.616 9）；第2 泌乳期，SNP 位點(diǎn)g.14432394G＞A 與產(chǎn)奶量、乳脂率、乳脂量和乳蛋白率達(dá)到顯著或極顯著關(guān)聯(lián)（P=0.000 1～0.010 4），與乳蛋白率關(guān)聯(lián)不顯著（P=0.369 9）。

PIN1基因等位基因加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)和替代效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果見表6。SNP 位點(diǎn) 7:g.14432394G＞A 對產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量的加性效應(yīng)或等位基因替代效應(yīng)在第1 和第2 泌乳期均達(dá)到顯著或極顯著，而乳蛋白率僅在第1 泌乳期達(dá)到顯著。即每個A 等位基因替代C等位基因會導(dǎo)致產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率的減少。該位點(diǎn)對乳脂率的加性效應(yīng)或等位基因替代效應(yīng)在第1 和第2 泌乳期均不顯著。

表4 PNI1 基因SNP 位點(diǎn)7:g.14432394G＞A 的等位基因頻率、基因型頻率及哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)

表5 PNI1 基因SNP 位點(diǎn)7:g.14432394G＞A 與5 個產(chǎn)奶性狀的遺傳關(guān)聯(lián)分析（最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）

表6 PIN1 基因7:g.14432394G＞A 位點(diǎn)等位基因加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)和替代效應(yīng)檢驗(yàn)

2.3 組織表達(dá)譜分析結(jié)果

2.3.1 總RNA 提取結(jié)果 利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測3 頭泌乳期荷斯坦母牛8 種組織的總RNA，結(jié)果顯示每個泳道均有3 條清晰條帶，基本無降解（圖2），OD260/280均在2.0 左右，OD260/230均在2.0 以上，RNA濃度1 000 ng/μL 左右，符合下一步實(shí)驗(yàn)要求。

PIN1 的cDNA 序列PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物1.5% 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PIN1基因的PCR 產(chǎn)物條帶明亮清晰且單一可用于后續(xù)熒光定量實(shí)驗(yàn)（圖3）。

2.3.2 組織表達(dá)譜分析結(jié)果 通過熒光定量PCR 擴(kuò)增，PIN1基因的mRNA 在乳腺、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴和胃的相對表達(dá)量如圖4 所示。結(jié)果顯示，PIN1基因在乳腺和肝臟組織中表達(dá)量相對較高，表明PIN1可能參與了乳成分的合成。

3 討 論

圖2 荷斯坦牛不同組織中總RNA 的電泳檢測結(jié)果

圖3 PIN1 基因cDNA 的PCR 擴(kuò)增檢測結(jié)果

圖4 PIN1 基因在泌乳荷斯坦牛8 種組織中的表達(dá)量分析

作者前期對極端高低乳脂乳蛋白率中國荷斯坦公牛全基因組重測序的研究鑒定PIN1為影響奶牛乳成分性狀的候選功能基因[10]。本研究對PIN1基因進(jìn)行深入遺傳效應(yīng)分析，結(jié)果證明該基因?qū)χ袊伤固古．a(chǎn)奶量、乳蛋白和乳脂性狀確有顯著影響。

3.1 內(nèi)含子突變對基因調(diào)控作用的影響 前人對基因多態(tài)性的研究多集中在編碼區(qū)和5′翼區(qū)，而忽略了對內(nèi)含子多態(tài)性的研究。近年來，已有研究表明內(nèi)含子具有調(diào)控功能。在玉米上，內(nèi)含子可以增加細(xì)胞ADH1 和CAT 的表達(dá)[18]。在人上，SLC2A9基因內(nèi)含子7 中的1 個SNP（rs734553）與血清尿酸和慢性腎臟疾病的進(jìn)展密切相關(guān)[19]。在奶牛上，ECHS1基因的6 個內(nèi)含子SNPs 與牛奶脂肪酸顯著關(guān)聯(lián)[20]。因此，本研究所發(fā)現(xiàn)的PIN1內(nèi)含子SNP 可能對產(chǎn)奶性狀有潛在調(diào)控功能。

3.2PIN1基因與產(chǎn)奶性狀相關(guān)功能分析PIN1基因參與蛋白質(zhì)分解代謝過程的負(fù)調(diào)控、甘油三酯和甘油磷脂代謝以及mTOR 信號通路，位于產(chǎn)奶量、乳蛋白率、乳蛋白量QTLs 區(qū)間內(nèi)[21-23]。研究表明，PIN1在促進(jìn)脂質(zhì)堆積和炎癥伴隨的纖維化變化的惡化中起關(guān)鍵作用[24]。PIN1的靶蛋白胰島素受體底物1（IRS-1）、AMP 激活的蛋白激酶（AMPK）和乙酰輔酶A 羧化酶1（ACC1）均參與脂質(zhì)積累的過程[24]。本研究中，PIN1在乳腺組中高表達(dá)，而在人癌癥研究中發(fā)現(xiàn)PIN1在乳腺癌患者乳腺中表達(dá)量明顯上升，表明PIN1可能與乳腺細(xì)胞增殖相關(guān)[14]。在體內(nèi)異種移植腫瘤模型中，PIN1過表達(dá)會導(dǎo)致PI3K、AKT 和β-catenin 通路中多個關(guān)鍵蛋白的下調(diào)[15]。其中，PI3K 和β-catenin 是與乳脂乳蛋白合成代謝相關(guān)的通路，可見PIN1對乳汁合成分泌過程有重要作用。

從關(guān)聯(lián)分析結(jié)果可以看出，PIN1基因SNP 位點(diǎn)7:g.14432394G＞A 與產(chǎn)奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率均呈顯著或極顯著關(guān)聯(lián)，同時該位點(diǎn)對產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率性狀的加性效應(yīng)和等位基因替代效應(yīng)顯著，說明不同基因型個體間的差異是可以遺傳的，能將其應(yīng)用于奶牛育種工作。通過傳統(tǒng)的育種方法來進(jìn)行優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶牛的選育是一件長期而艱巨的工作，而在奶牛基因組選擇中加入與產(chǎn)奶性狀相關(guān)的基因，可以更準(zhǔn)確、更早地進(jìn)行選育工作，從而降低生產(chǎn)成本，加快遺傳進(jìn)展[9,25]。

4 結(jié) 論

作者前期的重測序研究將PIN1基因鑒定為奶牛產(chǎn)奶性狀候選功能基因，本研究進(jìn)一步證明，PIN1與奶牛產(chǎn)奶性狀有顯著關(guān)聯(lián)。PIN1基因SNP 位點(diǎn)7:g.14432394G＞A 與產(chǎn)奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率均呈顯著或極顯著關(guān)聯(lián)，且加性效應(yīng)和等位基因替代效應(yīng)顯著?？筛鶕?jù)育種目標(biāo)將PIN1基因及SNP 位點(diǎn)7:g.14432394G＞A 作為遺傳標(biāo)記為中國荷斯坦牛的分子育種提供有價值的基因信息。