腸道微生物及代謝產(chǎn)物對動物腸道免疫的研究進展

鐘奇祺 ，張海波，幸清鳳，關(guān)瑋琨，廖曉鵬，黎力之*，郭冬生*

（1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西省高等學(xué)校硒農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，宜春市功能農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，江西宜春 336000；2.宜春學(xué)院計劃財務(wù)處，江西宜春 336000；3.宜春學(xué)院繼續(xù)教育學(xué)院，江西宜春 336000）

哺乳動物腸道定植約1014個微生物，包括細菌、真菌、病毒等[1]。腸道微生物在營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收過程中發(fā)揮重要作用，并促進機體免疫系統(tǒng)的建立[2]。缺少腸道微生物定植的宿主無法建立功能健全的免疫系統(tǒng)。研究表明，無菌小鼠的多個免疫細胞群均表現(xiàn)出缺陷，如先天淋巴細胞功能受損、產(chǎn)生免疫球蛋白A（IgA）的漿細胞存在功能障礙等[3-4]。健全免疫系統(tǒng)與腸道微生物間的關(guān)系已被證實，如分節(jié)絲狀菌（Segmented filamentous bacteria，SFB）誘導(dǎo)小鼠CD4+T 細胞激活輔助性T 細胞17（Th17 細胞）產(chǎn)生白細胞介素（IL）-17和IL-22，保護宿主免受細菌和真菌感染[5]；脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis，BF）產(chǎn)生特有的抑制性鞘脂類物質(zhì)對機體內(nèi)源性抗原環(huán)境進行補充，維持宿主恒定型自然殺傷T 細胞的穩(wěn)態(tài)平衡[6]。腸道微生物定植的同時，經(jīng)自身轉(zhuǎn)化得到其代謝產(chǎn)物，如短鏈脂肪酸（SCFAs）、次級膽汁酸和離子多糖A（PSA）等。這些代謝產(chǎn)物直接通過黏膜層激活腸上皮細胞受體，如腸上皮細胞G 蛋白偶聯(lián)受體（GPRs）介導(dǎo)的信號通路被啟用后，刺激調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg 細胞）轉(zhuǎn)錄程序，促進抗炎細胞因子合成釋放，提高機體免疫耐受能力。而這樣的代謝產(chǎn)物受體存在于不同的腸上皮細胞中，表明代謝產(chǎn)物廣泛作用于機體免疫過程[7]。因此，腸道微生物及其代謝產(chǎn)物對宿主免疫系統(tǒng)調(diào)控起至關(guān)重要的作用。本文主要綜述了腸道微生物及其代謝產(chǎn)物SCFAs、次級膽汁酸和PSA 對宿主腸道免疫的影響，以期為調(diào)控腸道免疫、治療動物疾病及保障機體健康提供思路和參考。

1 腸道微生物及代謝產(chǎn)物

1.1 腸道微生物的分布 在已鑒定的腸道菌群中，擬桿菌門和厚壁菌門的數(shù)量占腸道菌群總量90% 以上，其中專性厭氧菌數(shù)量約是需氧菌數(shù)量的1 000 倍[8]。由于不同腸段內(nèi)環(huán)境不一樣，腸腔中微生物數(shù)量與組成均有差異。十二指腸中的微生物數(shù)量最少，主要原因是胃酸與膽汁排出后首先進入其中，導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境pH 較低，且過多的腸液和腸段快速蠕動也不利于細菌定植[9]。與十二指腸相比，空腸和回腸中的腸液更少，腸段蠕動速度減緩，氧化還原電位降低，促進厭氧菌定植，故空腸和回腸內(nèi)的腸道微生物數(shù)量有所增加[10]。盲腸具有遠端閉塞不通、腸段蠕動速度緩慢和pH 呈弱堿性等特點，是細菌定植的主要場所，其中優(yōu)勢菌群為雙歧桿菌（Bifidobacterium）、腸桿菌（Enterobacteriaceae）和腸球菌（Enterococcus）[9]。

1.2 腸道微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物 動物腸道無法直接消化吸收的飲食成分，經(jīng)腸道微生物作用后，轉(zhuǎn)化為宿主代謝中的功能性補充物質(zhì)[1]。微生物代謝產(chǎn)物分為3 類：第一類經(jīng)腸道微生物直接對食物成分進行消化或發(fā)酵產(chǎn)生，如SCFAs[11]。SCFAs 由小腸厭氧微生物發(fā)酵結(jié)構(gòu)性碳水化合物生成，具有促進腸道黏液分泌、提供結(jié)腸肌細胞能量等作用[12]。第二類由宿主產(chǎn)生后經(jīng)腸道微生物修飾后的代謝產(chǎn)物，如次級膽汁酸[2]。次級膽汁酸由初級膽汁酸經(jīng)腸內(nèi)7-α/β脫羥基細菌解離、轉(zhuǎn)化而來，有助于動物構(gòu)建腸道環(huán)境穩(wěn)態(tài)[13]。第三類為腸道微生物自生合成的代謝產(chǎn)物，如PSA[14]。PSA 主要由BF 產(chǎn)生，是一種莢膜多糖，通過激活Toll 樣受體2（TLR2）信號通路誘導(dǎo)Treg 細胞產(chǎn)生具有抗炎作用的IL-10，抑制胃腸道炎癥的發(fā)生[15]。綜上所述，微生物可以通過其代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)宿主胃腸道免疫系統(tǒng)的正常生理功能（表1）。

2 腸道微生物對免疫細胞和免疫球蛋白的影響

2.1 腸道微生物對分泌型球蛋白A（sIgA）分泌的影響腸道微生物通過依賴T 細胞和非依賴T 細胞2 種方式調(diào)控sIgA 的產(chǎn)生（圖1）[22]。依賴T 細胞的sIgA 產(chǎn)生主要發(fā)生在派爾集合淋巴結(jié)中，其通過B 細胞與負載抗原的DCs 相互作用后產(chǎn)生sIgA[23]。捕獲抗原的DCs 刺激CD4+T 細胞增殖分化為濾泡輔助性T（Tfh）細胞，Tfh 細胞主要以CD40 配體和IL-21 作為信號，誘使B細胞表達胞嘧啶核苷脫氨酶（AID），促進B 細胞分化為IgA+B 細胞，進而分泌大量sIgA[24]。非依賴T 細胞的sIgA 產(chǎn)生主要在腸黏膜固有層和孤立淋巴濾泡中。腸道菌群可通過觸發(fā)腸上皮細胞中TLRs 直接刺激DCs和濾泡樹突狀細胞產(chǎn)生增殖誘導(dǎo)配體（APRLI）和B 細胞的活化因子（BAFF），誘導(dǎo)B 細胞中的AID 表達和IgA 類抗體轉(zhuǎn)換，提高B 細胞轉(zhuǎn)化為IgA+B 細胞的速率，顯著增強sIgA 合成能力[24]。

圖1 腸道微生物對sIgA 分泌的影響[22]

表1 腸道微生物產(chǎn)生的黏膜免疫調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物

腸黏膜固有層中IgA+漿細胞產(chǎn)生二聚體IgA（dIgA），dIgA 相互聚合形成多聚體IgA（pIgA），隨后與多聚免疫球蛋白受體（pIgR）結(jié)合轉(zhuǎn)運至腸上皮表面頂端，之后dIgA 與pIgR 中的分泌成分從結(jié)合物中分離，形成sIgA[25]。sIgA 接觸腸腔內(nèi)微生物、膳食成分等物質(zhì)后，在這些物質(zhì)表面形成一層外膜，抑制腸腔致病菌直接接觸腸壁，使其無法黏附腸上皮細胞失去定植能力，從而維持機體腸道屏障的完整性，抵御其他病原微生物入侵[22,26]。

2.2 腸道微生物對T 細胞的影響 腸腔內(nèi)特定的共生細菌可以促進T 細胞不同亞群的生成?？乖碳な构逃袑又蠧D8+T 細胞向CD4+T 細胞增殖分化后，CD4+T 細胞又可特異性增殖分化為不同亞群，如Treg 細胞、Tfh細胞和Th17 細胞等。其中，Treg 細胞的增殖分化可以減輕因機體對致病菌的過度免疫反應(yīng)而引起的黏膜損傷，如BF 誘導(dǎo)Treg 細胞增殖分化產(chǎn)生IL-10，保護腸道免受肝螺桿菌（Helicobacter hepaticus）入侵感染[27]。Th17 細胞具有介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用，其與Treg 細胞在功能上具有相互制約的作用。近年來大量研究表明，通過腸道微生物誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg 細胞與Th17 細胞可以維持腸道在免疫耐受與炎癥反應(yīng)之間的平衡，有利于建立腸黏膜免疫穩(wěn)態(tài)[28-31]。

2.2.1 腸道微生物對Treg 細胞增殖分化的影響 Treg細胞來源于胸腺和外周免疫器官，其增殖分化主要受CD25 和叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3（FoxP3）分子調(diào)控。腸道Treg 細胞存在于腸黏膜和淋巴組織中，抑制T 細胞過度反應(yīng)，調(diào)節(jié)自身免疫。外周Treg 細胞（pTreg）聚集于結(jié)腸，常見表達形式為RORγt。無菌小鼠體內(nèi)缺乏RORγt+pTreg 細胞，說明微生物可以誘導(dǎo)產(chǎn)生pTreg 細胞[32]。Atarashi 等[33]將正常人體17 種梭菌混合，定植于無菌小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示pTreg 細胞水平顯著升高，促進IL-10 和細胞毒T 淋巴細胞相關(guān)抗原4 的合成釋放，共同抵御小鼠結(jié)腸炎。研究表明，BF 可以分泌外膜囊泡，通過非典型自噬途徑向免疫細胞傳遞免疫調(diào)節(jié)分子，誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-10，表達FoxP3+細胞，促使CD4+T 細胞向Treg 細胞增殖分化，抑制結(jié)腸炎[34]。

2.2.2 腸道微生物對Th17 細胞增殖分化的影響 Th17細胞的應(yīng)答時間早于其他T 細胞，且其可以在腸道內(nèi)積聚，這表明Th17 細胞的發(fā)育由腸內(nèi)機制調(diào)節(jié)[32]。與此相契合的是，使用抗生素處理后的小鼠或者無菌小鼠，腸內(nèi)Th17 細胞數(shù)量均急劇下降。因此，腸道微生物在調(diào)控Th17 細胞的增殖分化中具有重要作用[29]。研究表明，腸道中SFB 具有鉤狀結(jié)構(gòu)，鉤尖黏附小鼠腸上皮細胞形成內(nèi)吞囊泡，可快速將SFB 的菌體蛋白從腸上皮細胞的頂端運送至基部，直接促使血清淀粉樣A 蛋白（SAA）產(chǎn)生，進而使黏膜固有層中DCs 產(chǎn)生IL-6 和IL-23，誘導(dǎo)Th17 細胞增殖分化[33,35]。同時，Mao 等[36]證明SFB 定植腸道后產(chǎn)生IL-23，刺激固有淋巴細胞（ILCs）與Th17 細胞共同分泌IL-22，間接上調(diào)SAA1和SAA2基因表達，并激活MAPK 通路釋放抗菌肽和β防御素，保證腸道屏障結(jié)構(gòu)與功能的完整性，阻礙病原微生物入侵機體。除SFB 外，腸內(nèi)白色念珠菌（Candida albicans）、鼠檸檬酸桿菌（Citrobacter ratus）及腸出血性大腸桿菌（Escherichia coli O157:H7）等致病菌均可黏附腸上皮促使Th17 細胞分化[37-38]。由此看來，腸道微生物可以通過對腸上皮細胞的黏附作用誘導(dǎo)T 細胞向Th17 細胞增殖分化，對機體炎癥迅速做出反應(yīng)，加強宿主對病原微生物的防御作用（圖2）。

3 腸道微生物代謝產(chǎn)物與腸黏膜免疫

圖2 腸道微生物對Th17 細胞增殖分化的影響

3.1 SCFAs 與腸黏膜免疫 SCFAs 包括乙酸、丙酸、丁酸等，SCFAs 不僅是微生物本身的主要能量來源，還為腸上皮細胞提供能量。此外，SCFAs 還能抑制組蛋白去乙酰酶（HDACs）活性，促使腸上皮細胞緊密連接，參與調(diào)節(jié)機體免疫功能。SCFAs 通過抑制HDACs 活性影響Treg 細胞發(fā)育。HDAC9 的抑制作用使FoxP3 表達增加，促使Treg 細胞增殖分化，增強Treg 細胞介導(dǎo)的結(jié)腸炎抑制作用[39]。研究表明，SCFAs 與游離脂肪酸受體2（FFAR2）特異性結(jié)合后減弱腸道中性粒細胞的趨化作用，降低脂多糖刺激下中性粒細胞產(chǎn)生的促炎細胞因子水平[40]。Zhou 等[28]研究發(fā)現(xiàn)脂多糖刺激巨噬細胞后，丁酸能限制促炎細胞因子在結(jié)腸固有層中合成與分泌，降低腸道炎癥的發(fā)生幾率，同時結(jié)腸隱窩存在丁酸代謝，防止高濃度丁酸鹽對隱窩底部干細胞產(chǎn)生毒害效應(yīng)，維護動物腸黏膜免疫細胞的更新能力。

SCFAs 通過完善腸上皮細胞屏障功能維持黏膜免疫。Wrzosek 等[41]研究發(fā)現(xiàn)，無菌小鼠接種產(chǎn)生SCFAs 的泰氏桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron）和糞便桿菌（Faecalibacterium），能有效誘導(dǎo)杯狀細胞分化，促進黏液產(chǎn)生，有效阻止致病菌定植腸道，保障腸道健康。SCFAs 還能穩(wěn)定腸上皮細胞連接穩(wěn)定，維護腸道屏障完整。定植長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）產(chǎn)生高水平乙酸，增強腸上皮細胞間相互連接，提高腸道對病原體的防御能力[16]。

3.2 次級膽汁酸與腸黏膜免疫 膽汁酸由肝臟合成儲存于膽囊，動物采食后膽囊收縮，膽汁酸被釋放進入十二指腸，稱為初級膽汁酸[42]。腸道腔內(nèi)乳酸桿菌、雙歧桿菌等利用膽鹽水解酶對初級膽汁酸進行早期解離后，再與具bai基因的梭菌發(fā)生7-α脫羥基反應(yīng)生成次級膽汁酸，包括石膽酸（LCA）、脫氧膽酸（DCA）和熊脫氧膽酸（UDCA）等[18]。研究證明，患炎癥性腸?。↖BD）的小鼠體內(nèi)厚壁菌門數(shù)量減少，阻礙膽汁酸早期解離、轉(zhuǎn)化及脫硫過程，顯著降低次級膽汁酸轉(zhuǎn)化率，導(dǎo)致3-OH 硫化膽汁酸積聚腸內(nèi)，加重炎癥反應(yīng)[43]。Den Bossche 等[44]將UDCA 灌胃于葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)IBD 小鼠后，使腸內(nèi)厚壁菌門與擬桿菌門比例恢復(fù)正常，并有效降低小鼠腸道促炎細胞因子（IL-1β、IL-6）水平，加速潰瘍化上皮愈合，表明次級膽汁酸具備一定免疫調(diào)節(jié)作用。此外，研究表明，LCA 與DCA 有效抑制80%腸道白色念珠菌菌絲、芽管及生物膜的形成，阻止其生長繁殖，維持動物腸道健康[45]。Jason 等[19]試驗證明，LCA 和DCA 可增強腸內(nèi)7-α脫羥基細菌所分泌抗生素的活性，解除外源抗生素治療艱難梭菌后產(chǎn)生的環(huán)狀二肽抑制其他菌群生長，阻止艱難梭菌異常增殖所導(dǎo)致的腸黏膜免疫極化現(xiàn)象出現(xiàn)。同時，次級膽汁酸作為膽汁酸家族一員，也具備激活法尼醇X 受體及G 蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5 通路的功能，發(fā)揮維持腸道穩(wěn)態(tài)及黏膜屏障完整性的作用[18]。綜上所述，適宜濃度的次級膽汁酸對機體腸黏膜免疫建立具有重要意義。

3.3 PSA 與腸黏膜免疫 PSA 為囊狀兩性離子多糖，主要由BF 產(chǎn)生，常見于結(jié)腸黏液層，通過激活DCs和Treg 細胞合成分泌抗炎細胞因子，調(diào)控宿主免疫系統(tǒng)功能。一方面，PSA 依賴腸壁通透性進入固有層，被DCs 內(nèi)化吸收后將抗原呈遞至CD4+T 細胞，導(dǎo)致其分泌IL-10，誘使CD45+細胞釋放IL-17A，抑制腸道T 細胞活性，尤其是Th17 細胞，繼而阻止炎癥反應(yīng)發(fā)生，保護罹患結(jié)腸炎小鼠的生理健康[31]。另一方面，DCs 細胞表面的TLR2 也能被PSA 激活，促使T 細胞釋放IL-10[20-21]。此外，PSA 還能刺激CD4+T 細胞向FoxP3CD4+T 細胞或FoxP3-CD4+Tr1 細胞方向分化，與細胞表面TLR2 特異性結(jié)合，促進IL-10 的合成，緩解結(jié)腸炎[15]。綜上所述，PSA 通過直、間接方式作用于CD4+T 細胞，促進IL-10 分泌，抑制Th17 細胞過度免疫應(yīng)答，輔助動物抵御腸道疾病（圖3）。

圖3 PSA 對腸黏膜免疫的影響

4 結(jié) 語

綜上所述，腸道微生物定植后調(diào)節(jié)sIgA 分泌及T細胞增殖，完善動物腸道免疫功能，同時產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物（SCFAs、次級膽汁酸和PSA 等），在維持腸道穩(wěn)態(tài)、輔助動物抵御疾病方面具有重要作用。腸道微生物及其代謝產(chǎn)物對動物腸道免疫的影響已被大量研究和闡釋，但菌群種類及定植過程復(fù)雜，現(xiàn)有研究大多為孤立、單一角度的驗證，仍不足以解釋菌群與腸道免疫間復(fù)雜的動態(tài)關(guān)系。因此，腸道微生物及其代謝產(chǎn)物對宿主腸道免疫系統(tǒng)作用機制有待全面深入探索，相關(guān)研究也將為豐富機體腸內(nèi)外疾病的防治理論提供參考依據(jù)。