鎘誘導不同自噬效應與鈣離子調控自噬的作用分析

戴舒雅， 周陽， 施海峰， 顧杰

(江蘇大學 生命科學研究院， 鎮(zhèn)江 212013)

鎘作為環(huán)境中普遍存在的重金屬污染物，可通過多種途徑進入人體。長期鎘暴露導致體內的鎘含量積累，破壞肝、腎等器官的結構和功能，對機體的生殖、免疫和神經(jīng)等系統(tǒng)造成不同程度的損傷[1]?，F(xiàn)有的研究結果揭示鎘的生物學毒性機制主要是由鎘誘導內氧化應激，增加氧化壓力，損傷DNA，促進細胞凋亡[2]。目前，自噬也被認為是鎘生物學毒性的重要機制之一。

自噬是真核細胞內一種進化保守的自我消化機制，是負責將受損的細胞器、錯誤折疊的蛋白及其他大分子物質等運送至溶酶體降解并再利用的過程。在哺乳動物細胞中，根據(jù)細胞質物質到達溶酶體的途徑不同，自噬可分為3種類型：微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)及分子伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy, CMA)。一般情況下自噬是細胞的一種自我保護機制，是調節(jié)細胞代謝、維持細胞穩(wěn)態(tài)的主要途徑之一。自噬效應的發(fā)生取決于自噬流過程是否完成。自噬流，即自噬的完整動態(tài)過程，包括自噬體形成、自噬體與溶酶體融合及后續(xù)內含物的降解和回收[7]。LC3-II是研究細胞自噬的一個重要標志物，LC3-II的形成與自噬的發(fā)生有關，但磷脂酰乙醇胺修飾的LC3-II水平升高只是反應自噬信號的發(fā)生。而溶酶體與自噬體的融合及降解(p62蛋白降解)是自噬流完成的關鍵步驟，是最終決定自噬效應的標志[8]。因此，對自噬的研究有必要結合LC3-II的形成和P62蛋白變化情況。

研究表明，鎘處理WI38(肺上皮成纖維細胞)、WLR38可誘導細胞自噬、抑制細胞凋亡從而緩解鎘引起的毒性損傷[9]。也有研究認為，在MES-13、NEK-52E(大鼠腎小管上皮細胞)、PC-12(腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞)中，鎘可誘導細胞自噬性死亡。綜上表明，鎘誘導的自噬在不同遺傳背景的細胞會產(chǎn)生不同的生理效應。Ca2+作為一個多功能的信使分子，它能夠調控多種細胞功能，包括增殖、分化、遷移和細胞死亡，自噬體以Ca2+敏感的方式參與并與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，是細胞自噬效應中一個重要的調節(jié)物質[14]。但Ca2+在鎘誘導的自噬過程中的作用目前尚不明確。因此，本文概述當前鎘與自噬關系的研究現(xiàn)狀，以及鈣在自噬中的作用，探究鎘誘導不同細胞的自噬效應機制及與鈣離子作用的內在聯(lián)系。

1 鎘誘導和抑制自噬調控細胞存活

許多關于鎘誘導細胞凋亡的研究中，都表明自噬是細胞存活和凋亡的關鍵點。Hitomi研究發(fā)現(xiàn)鎘處理RMC(大鼠腎小球系膜細胞)可誘導ATG16基因的表達，促進細胞自噬，并維持了細胞的生存能力，而沉默該基因后，則增加了鎘引起的細胞凋亡[15]。在PC-12細胞中，鎘誘導ROS產(chǎn)生，通過引發(fā)自噬抑制了細胞的凋亡[16]。在NRK52E腎臟細胞中，鎘誘導細胞凋亡，同時引發(fā)自噬信號及自噬流完成，自噬抑制劑CQ與鎘共處理，則加重了細胞的凋亡[8]。上述研究認為在鎘暴露條件下，自噬是細胞應激適應和保護機制。然而，也有研究認為鎘激活自噬也是誘導細胞死亡的原因。Son認為，鎘經(jīng)ROS-LKB1-AMPK信號途徑誘導的自噬是導致小鼠表皮細胞JB6細胞毒性的主要原因[17]。Gu發(fā)現(xiàn)，在腎小球系膜細胞中，鎘通過ROS-GSK-3β和Ca2+-ERK自噬途徑誘導細胞自噬性死亡，導致腎毒性[9]。

Meng等人探究鎘誘導WRL-68細胞自噬的機制中發(fā)現(xiàn)，鎘誘導自噬，激活溶酶體功能依賴于自噬小體與溶酶體的融合。鎘與自噬的抑制劑共處理，自噬流被抑制，溶酶體活性明顯降低。結果表明鎘不僅可以促進WRL-68細胞的自噬，還能通過激活溶酶體功能刺激自噬的成熟和降解[18]。Lee等人認為鎘可干擾自噬的不同階段，破壞腎近端小管細胞的自噬作用[12]。在Liu等人對鎘誘導細胞(rPT)凋亡與自噬的研究中發(fā)現(xiàn)，鎘暴露導致原代大鼠近端腎小管上皮細胞(rPT)和小鼠腎小管上皮細胞(mRTEC)中LC3-II和P62蛋白的累積，促進內質網(wǎng)鈣離子釋放，抑制了自噬體與溶酶體的融合，阻斷自噬流，抑制了自噬，促進細胞凋亡[19-20]。上述結果表明，在不同遺傳背景細胞中，鎘誘導的細胞自噬抑制或促進死亡。而在一些細胞中鎘抑制自噬體與溶酶體的融合，導致自噬流阻斷,從而促進細胞凋亡。

2 鎘對溶酶體的影響

溶酶體作為細胞內重要的“消化”器官，其腔內是一個酸性環(huán)境，pH約為4.5～5.0，低于細胞溶質(pH 7.2)，這也是溶酶體發(fā)揮功能的重要因素之一。溶酶體內腔包含多種離子通道來維持溶酶體內部的酸性環(huán)境，如H+對保持溶酶體酸性水解酶活性起重要作用；鈣離子負責囊泡轉移；K+調節(jié)溶酶體膜電位和溶酶體內Ca2+平衡；Cl-作為陰離子調節(jié)溶酶體膜電位[21-22]。已有研究發(fā)現(xiàn)，鎘處理WRL-68細胞，增強了細胞溶酶體的酸性，促進了自噬[18]。鎘處理Neuro-2a細胞后，Cd抑制該細胞自噬體-溶酶體融合，降低溶酶體功能及溶酶體相關膜蛋白，抑制溶酶體蛋白水解，改變溶酶體pH，導致自噬清除缺陷并導致細胞死亡。Cd誘導TFEB核轉位及TFEB靶基因的表達，與溶酶體功能受損、損害自噬流密切相關。而通過TFEB過表達，則恢復了溶酶體相關膜蛋白的表達水平和溶酶體pH，抵抗了鎘誘導的毒性[23]。綜上表明，鎘在不同細胞中引起不同的自噬效應，其內在的機制可能是鎘對各細胞內溶酶體酸性及與自噬小體融合的影響不同，進而影響溶酶體功能的發(fā)揮。

3 鈣離子在鎘影響自噬中的作用

3.1 鈣與自噬

自噬主要在內質網(wǎng)(ER)的表面觸發(fā)自噬膜的形成，通過細胞骨架相關的運動，自噬體以Ca2+敏感的方式參與，并與溶酶體融合，形成自噬溶酶體[24]。參與調控自噬的mTOR信號通路和Beclin-1/Bcl-2通路都被認為與各種Ca2+信號通路相互作用[25]。實驗證實胞質Ca2+信號可激活自噬，Ca2+來源途徑以及許多下游效應分子被認為參與其中[26]，如Ca2+/鈣調素激酶激酶(CaMKkKβ或CaMKKβ)是AMPK的上游激活劑，它可以通過抑制mTORC1來誘導自噬[27]；AMPK可以繞過對mTORC1的抑制，而通過磷酸化自噬啟動ATG1激酶ULK1來刺激自噬[28]；Ca2+介導的Calpain激活被認為是自噬流的一個關鍵抑制因子[3]。細胞質Ca2+濃度升高會刺激自噬作用，而Ca2+螯合劑BAPTA處理細胞不僅可抑制自噬作用，還可以激發(fā)細胞內的Ca2+信號，同時也能對饑餓、氨基酸降解和mTOR抑制做出反應[29]。在脂毒性作用下，肝細胞內鈣離子慢性升高則抑制自噬體與溶酶體之間的融合，從而減弱自噬流，而該現(xiàn)象可被TG(鈣ATP酶抑制劑)逆轉[30]。

溶酶體被認為是細胞內重要的Ca2+庫，細胞Ca2+庫與溶酶體蛋白降解之間存在依賴關系。細胞內Ca2+信號通路是調節(jié)細胞溶酶體酸性的重要途徑之一。Ca2+水平異常會改變溶酶體的酸性，影響溶酶體與自噬體、晚期胞內體及其他細胞器之間的膜融合，影響細胞自噬的發(fā)生[31]。在對溶酶體上陽離子交換通道TRPML1的研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+可經(jīng)TRPML1從溶酶體中釋放。TRPML1的過表達增加自噬，而沉默TRPLM1則降低了HeLa細胞的自噬水平[32]。也有研究認為溶酶體上CACNA1A鈣離子通道活性是溶酶體融合以及細胞自噬所必須的，溶酶體腔內的鈣離子也可通過其電壓門控通道(VGCC)釋放到胞質中，促進SNARE蛋白介導溶酶體與內涵體和自噬體的融合[33]。

3.2 鎘對鈣離子及自噬的影響

Ca2+和ROS是參與調控細胞功能的最具影響力的細胞內信號分子。胞質鈣離子過載產(chǎn)生細胞氧化應激，也是損害細胞功能的重要原因。很多研究者在不同細胞中證實，鎘的細胞毒性都涉及了胞質Ca2+過載和氧化應激，并共同決定細胞功能和命運。鎘誘導胞內鈣離子升高，產(chǎn)生氧化壓力、阻斷了rPT細胞中溶酶體的自噬體融合，導致自噬小體的累積。BAPTA處理后顯著逆轉了鎘誘導的LC3-II和p62蛋白的積累。ROS清除劑NAC處理則可以顯著緩解鎘對自噬流的抑制[20]。Wang等人研究證實，鎘通過PLC-IP3途徑介導ER-Ca2+釋放的增加，導致mRTEC細胞內Ca2+水平上升，產(chǎn)生ROS。同時也顯著增加了LC3-II和p62蛋白的積累，抑制自噬流發(fā)生，引起細胞凋亡。ROS清除劑TCP與鎘共處理，則緩解了鎘對該細胞的毒性作用。鎘通過內質網(wǎng)上IP3R通道釋放鈣離子,提升胞內鈣離子水平，并主要經(jīng)Ca2+-ERK途徑介導MES-13細胞自噬[34]。綜上表明，鎘可以通過PLC-IP3R通路改變細胞內Ca2+濃度，影響細胞溶酶體與自噬體的融合，并產(chǎn)生ROS，進一步影響細胞自噬的發(fā)生；也說明了鎘誘導細胞自噬與細胞內Ca2+濃度異常、氧化應激之間存在著密切關系。

4 結論與展望

鎘作為具有很強生物毒性的重金屬，長期鎘暴露會對人體多個組織和器官造成損傷。鎘對細胞自噬的干擾結果取決于細胞的遺傳背景。鎘可以通過改變細胞溶酶體的酸性誘導或抑制細胞自噬，影響細胞凋亡；鈣作為調節(jié)溶酶體功能和細胞自噬的主要途徑，在細胞自噬發(fā)生的過程中起著重要作用。鎘引起的細胞自噬效應與細胞內鈣離子濃度存在著緊密聯(lián)系，干擾溶酶體生理酸性環(huán)境，從而影響細胞的自噬過程。因此，進一步闡明鎘誘導細胞自噬效應與細胞內鈣離子濃度之間的關系，對研究鎘生物毒性有著重要的意義。