血清淀粉樣蛋白A化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)開發(fā)

周齊洋, 黃建榮, 陳祥, 王春新

(1. 江蘇省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所, 南京 210019； 2. 無錫市人民醫(yī)院, 無錫 214000； 3. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室， 無錫 214122)

人血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A, SAA)是一組由同一基因編碼的多形性蛋白，廣泛地存在于各種脊椎動物中[1-2]。目前為止，共發(fā)現(xiàn)4種蛋白亞型，其中SAA1和SAA2蛋白結(jié)構(gòu)93%一致，在炎癥的急性期顯著上調(diào)；SAA3為假基因，不能轉(zhuǎn)錄和表達(dá)蛋白；SAA4蛋白不參與急性炎癥反應(yīng)。在正常及炎癥狀態(tài)下，SAA1亞型為SAA蛋白的主要組分，決定著總SAA的水平[3]。血清SAA是一種敏感的急性期反應(yīng)蛋白，正常情況下血漿中的含量極少，當(dāng)機(jī)體受到細(xì)菌、支原體等抗原刺激后，在5～6 h內(nèi)迅速升高約1000倍[4]。SAA還與高密度脂蛋白有關(guān)，它能在炎癥期間調(diào)節(jié)高密度脂蛋白的代謝；其降解產(chǎn)物能以淀粉樣蛋白A原纖維的方式沉積在不同的器官中，在慢性炎癥疾病中產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā)癥。也有大量報(bào)道認(rèn)為血清SAA水平可以作為評估和預(yù)測冠心病病情嚴(yán)重程度的敏感標(biāo)志物[5-6]。隨著該標(biāo)志物的廣泛研究和應(yīng)用，其血清含量的檢測方法及性能越來越受到重視。

目前血清SAA的檢測方法主要為散射比濁法及膠乳免疫比濁法，該方法靈敏度較低，有一定的局限性。而化學(xué)發(fā)光免疫分析法因具有化學(xué)發(fā)光的靈敏度高、線性范圍大和重復(fù)性好等優(yōu)勢，已成為體外診斷試劑的主流方法之一。

目前國內(nèi)還鮮有關(guān)于SAA的化學(xué)發(fā)光檢測方法的相關(guān)報(bào)道。本研究旨在采用雙抗夾心法，建立一種高靈敏度、高重復(fù)性、高準(zhǔn)確度的血清SAA化學(xué)發(fā)光檢測方法。研究中使用了生物素-鏈霉親和素信號放大的微孔包被板，將稀釋后的含SAA的血清樣本、生物素化抗體、酶結(jié)合抗體加入至孔內(nèi)，孵育后洗滌去除雜質(zhì)，加入發(fā)光底物，根據(jù)樣本及校準(zhǔn)曲線的光信號值計(jì)算相應(yīng)樣本中SAA的濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

化學(xué)發(fā)光板購于美國Costar公司。血清淀粉樣蛋白A購于上海普欣；血清淀粉樣蛋白A抗體對購于Meridian。150例人血清樣本來自于無錫市人民醫(yī)院；生物素化標(biāo)記試劑購于Thermo Fisher；參比試劑為西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品(上海)有限公司生產(chǎn)的血清淀粉樣蛋白A 測定試劑盒(散射比濁法)。

1.2 儀器

安圖公司產(chǎn)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，型號為LUMO。洗板機(jī)購于英國Anthos公司，型號為Fluido2。平板震蕩儀購于上海漢林，型號為Mix-1500。生化培養(yǎng)箱購于上海坤天實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，型號為SPX-80B。Quawell公司產(chǎn)超微量紫外分光光度計(jì)，型號為Q5000。

1.3 方法

1.3.1 包被板的制備

1)制備生物素化牛血清白蛋白(BSA-Biotin)。取10 mg BSA，加入到1 mL的磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)中，加入1.69 mg生物素(分子量為556.59，間隔臂為22.4 ?)，充分混勻，室溫偶聯(lián)1 h。將標(biāo)記好的生物素化牛血清白蛋白加入到Thermo脫鹽柱中純化脫鹽，用磷酸緩沖液作為洗脫液，去除游離的生物素。

2)包被。用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液將上述Biotin-BSA稀釋成6 μg/mL的包被液，每孔100 μL，4℃過夜。將包被液倒去，用洗液洗滌3次。加入15 μg/mL的鏈霉親和素，每孔100 μL，室溫孵育2 h。倒去孔內(nèi)溶液后加入封閉液(含2% BSA的磷酸緩沖液)，200 μL每孔，室溫孵育2 h。將封閉液傾去，晾干包被板。

1.3.2 生物素化抗體制備與純化

取1 mg包被抗體，用脫鹽柱更換緩沖液為磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)，最后收集到約1 mL的抗體溶液。準(zhǔn)確稱取NHS-LC-LC-Biotin 1 mg至1 mL的磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)中。量取100 μL的NHS-LC-LC-Biotin溶液加入至抗體溶液中，充分混勻，室溫反應(yīng)1 h。

將上述標(biāo)記好生物素的抗體加入到脫鹽柱純化去除雜質(zhì)。收集生物素抗體，測量生物素抗體在280 nm處的吸光度，計(jì)算蛋白回收率為91%。并以HABA試劑檢驗(yàn)偶聯(lián)率為7.2。

1.3.3 酶結(jié)合抗體制備與純化

稱取HRP溶于去離子水中，加入NaIO4(0.1 mol/L)溶液，室溫條件避光攪拌20 min后將反應(yīng)物于4 ℃冰箱中用醋酸鈉溶液(1 mmol/L, pH 4.4)透析過夜，再加入4 μL乙二醇，室溫避光反應(yīng)30 min。加入SAA標(biāo)記抗體，于碳酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 9.5)中4 ℃避光透析過夜，結(jié)合物加入0.1 mL NaBH4，混勻，4 ℃避光反應(yīng)2 h，攪拌狀態(tài)下加入等體積的飽和硫酸銨，4 ℃放置1 h， 5000 r/min離心15 min，棄上清。沉淀用PBS溶解，加入等體積甘油于-20 ℃保存[7]。

1.3.4 校準(zhǔn)品的配制

用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(含2%人血清白蛋白，0.5%的2-氯乙酰胺，pH 7.6的磷酸緩沖液)將SAA抗原稀釋成濃度分別為800、200、50、10、5和0 ng/mL的校準(zhǔn)品溶液，分裝，并于-80 ℃凍存。

1.3.5 生物素化抗體及酶結(jié)合抗體工作濃度的確定

采用棋盤滴定法[8]。以校準(zhǔn)品1信號值較低且校準(zhǔn)品6/校準(zhǔn)品1比值最高時(shí)對應(yīng)的濃度為最佳工作濃度。

1.3.6 反應(yīng)時(shí)間確定

使用優(yōu)化后的酶標(biāo)抗體和生物素標(biāo)記抗體濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以信號值基本接近或達(dá)到最高點(diǎn)，且重復(fù)性較好的反應(yīng)時(shí)間為最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.3.7 實(shí)驗(yàn)原理及步驟

采用雙抗體夾心法測定血清中SAA含量。首先將樣本稀釋400倍，在預(yù)包被了鏈霉親和素的微孔板中，加入50 μL校準(zhǔn)品或稀釋后的血清樣品后，再各加入50 μL生物素化抗體及酶結(jié)合抗體，混合后37 ℃孵育10 min，使生物素化抗體、SAA及酶結(jié)合抗體形成免疫復(fù)合物并與包被板上的鏈霉親和素結(jié)合，洗滌去除未結(jié)合的雜質(zhì)，加入100 μL化學(xué)發(fā)光底物后，用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測，根據(jù)樣本及校準(zhǔn)曲線的光信號值計(jì)算相應(yīng)樣本中SAA的濃度。

1.3.8 方法學(xué)評價(jià)

1)線性范圍。取一份高值血清樣本，用低值樣本稀釋成11個不同濃度，檢測前進(jìn)行400倍稀釋后的濃度分別為822.42、412.84、206.58、104.92、54.08、28.67、15.96、9.60、6.43、4.84和3.25 ng/mL，各重復(fù)3次檢測，取平均值。以樣本濃度為X軸，以發(fā)光值為Y軸繪制曲線，取曲線擬合較好的區(qū)間為本方法的線性范圍。

2)最低檢測限。對校準(zhǔn)品稀釋液重復(fù)檢測20次，計(jì)算20次發(fā)光值的平均值M和標(biāo)準(zhǔn)差SD，將M+2SD帶入校準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得到濃度值即為最低檢測限。

3)準(zhǔn)確度。對高值質(zhì)控品和低值質(zhì)控品分別重復(fù)檢測3次，測量濃度結(jié)果的平均值記為(Mi)，根據(jù)公式(1)分別計(jì)算相對偏差(Bi)

Bi(%)=(Mi-T)/T×100%

(1)

式中：Bi為相對偏差；Mi為測量濃度的平均值；T為標(biāo)定濃度。

4)精密度。取3批試劑盒，分別對高值質(zhì)控品和低值質(zhì)控品重復(fù)檢測10次，計(jì)算CV=平均值/標(biāo)準(zhǔn)差。

5)加速穩(wěn)定性。取同批次3盒試劑盒，置于37 ℃恒溫箱中，分別在第1天、第4天及第7天取樣，在第7天與4 ℃同批次試劑盒同時(shí)檢測，以4 ℃同批次試劑盒為對照，考察質(zhì)控品濃度偏差。

6)方法學(xué)對比。無錫市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科選取覆蓋線性范圍的150例臨床血清，分別用本文方法和西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品(上海)有限公司生產(chǎn)的血清淀粉樣蛋白A 測定試劑盒(散射比濁法)同時(shí)進(jìn)行檢測，并對血清檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 生物素化抗體及酶結(jié)合抗體工作濃度的確定

根據(jù)校準(zhǔn)品1信號值較低且校準(zhǔn)品6/校準(zhǔn)品1比值最高的綜合結(jié)果(表1)，確定生物素化抗體濃度為2 μg/mL，酶結(jié)合物抗體濃度為2 μg/mL。

表1 生物素化抗體和酶結(jié)合抗體工作濃度

2.2 反應(yīng)時(shí)間確定

結(jié)果(表2和表3)表明，孵育10 min，信號值已基本達(dá)到最高值，且重復(fù)性較好，因此確定孵育時(shí)間為10 min。

表2 不同孵育時(shí)間對發(fā)光值的影響

表3 不同孵育時(shí)間對血清重復(fù)性的影響

2.3 線性范圍

當(dāng)試劑在3.25～822.42 ng/mL范圍內(nèi)時(shí)，劑量-反應(yīng)曲線的線性良好，故確定檢測方法的線性范圍為5～800 ng/mL。

2.4 最低檢測限

通過計(jì)算20份校準(zhǔn)品稀釋液的信號值結(jié)果，將M+2SD帶入校準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得到濃度值1.64 ng/mL。故擬定本方法最低檢測限為3 ng/mL。

2.5 準(zhǔn)確度

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高低濃度質(zhì)控品實(shí)測濃度與理論值之間的相對偏差絕對值分別為6.90%和2.83%，表明本方法檢測準(zhǔn)確性較高，見表4。

表4 準(zhǔn)確度檢測結(jié)果

2.6 精密度

3批次試劑盒各對低值質(zhì)控品檢測10次，批內(nèi)變異系數(shù)分別4.8%、4.7%和2.3%，批間變異系數(shù)為4.2%。由此說明本試劑盒檢測結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好(見表5)。

表5 精密度檢測結(jié)果

2.7 加速穩(wěn)定性

檢測結(jié)果(表5)顯示試劑盒在37 ℃放置不同時(shí)間和4 ℃相比，質(zhì)控品濃度偏差均小于10%，說明本試劑穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表6。

表6 加速穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

圖1本法與西門子檢測結(jié)果相關(guān)性

Figure 1 Linear correlation between the prepared method and Siemens kit

2.8 方法學(xué)相關(guān)性的比較

同時(shí)用本法與西門子試劑盒檢測臨床血清150份血清樣本。分析計(jì)算相關(guān)系數(shù)r2=0.98，表明兩種檢測方法相關(guān)性較好(圖1)。

3 討論與結(jié)論

在目前的臨床應(yīng)用中，與C反應(yīng)蛋白 (CRP) 類似，對血清淀粉樣蛋白 A 的檢測，有助于診斷炎癥，同時(shí)檢測 C 反應(yīng)蛋白和血清淀粉樣蛋白 A 能提高對感染的診斷靈敏度[9]，但血清淀粉樣蛋白 A 檢測在診斷發(fā)生病毒感染、腎移植排斥反應(yīng)的患者(特別是進(jìn)行免疫抑制治療的患者)以及用腎上腺皮質(zhì)激素治療的囊性纖維化患者方面，比 C 反應(yīng)蛋白檢測更確鑿[10-11]。隨著科研水平的進(jìn)步，SAA標(biāo)志物與疾病的關(guān)聯(lián)報(bào)道越來越多，其診斷意義也越發(fā)顯得重要。

本研究采用雙抗夾心法原理，通過生物素-鏈霉親和素的信號放大系統(tǒng)對血清淀粉樣蛋白A進(jìn)行定量檢測。首先對重要原材料進(jìn)行標(biāo)記并通過棋盤滴定法確定其工作濃度，并對其反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化；再對建立的方法做了相應(yīng)的性能評估；最后將建立的方法與進(jìn)口試劑盒進(jìn)行臨床樣本測試比對。結(jié)果表明本研究建立的檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確性、精密度以及穩(wěn)定性等均能達(dá)到臨床需求，該方法可為疾病診斷、預(yù)測以及治療效果的判斷提供客觀診斷依據(jù)，同時(shí)也填補(bǔ)了目前國內(nèi)相關(guān)研究的空白。