彈殼接觸DNA的法醫(yī)學研究進展

辛陽

中國刑事警察學院，遼寧 沈陽 110854

在涉槍類犯罪案件中，彈殼是重要的生物物證之一。20世紀中葉，隨著技術(shù)手段的發(fā)展，法醫(yī)DNA 實驗室開始嘗試對傳統(tǒng)生物體液（如血液和唾液）以外的證據(jù)進行檢測，包括與物體短暫接觸后在客體表面留下的DNA，這類證據(jù)被稱為“接觸DNA”。與常規(guī)生物物證相比，接觸DNA 具有微量的特點，DNA 含量常少于100 pg，屬于低拷貝數(shù)（low copy number，LCN）模板[1]。彈殼DNA作為接觸DNA的一種特殊形式，主要來源于裸手裝彈及彈殼回收過程，然而，子彈擊發(fā)產(chǎn)生瞬間高溫高壓氣體以及子彈擊發(fā)過程中產(chǎn)生的劇烈震動和射擊殘留物，使得彈殼上微量DNA 的有效提取和鑒定難度增大[2]。此外，在實際案件中，技術(shù)人員通常無法做到對彈殼接觸DNA 的即刻采集和提取。研究發(fā)現(xiàn)，彈殼上殘留的DNA 回收量隨著采樣時間的延長而逐步下降[3]，環(huán)境因素（濕度和溫度）催化彈殼表面的氧化過程，加速了DNA的降解[4]?！盎旌稀笔菑棜そ佑|DNA鑒定面臨的另一挑戰(zhàn)。MONTPETIT等[5]應(yīng)用改良浸泡法對彈殼接觸DNA 進行研究，發(fā)現(xiàn)約40%的子彈和彈殼樣本在提高DNA 回收率的同時出現(xiàn)了DNA混合分型，其中97.4%的樣本中包含裝彈者的DNA，而2.6%的樣本檢測到非裝彈者的未知來源DNA。另有研究[6]發(fā)現(xiàn)，無論裝彈者是否刻意接觸子彈，一旦擊發(fā)后的彈殼被其他個體回收，DNA 混合分型中所包含的回收者的等位基因平均數(shù)均大于裝彈者，這是因為相比于擊發(fā)前，擊發(fā)后彈殼表面遺留的接觸DNA 不受高溫高壓氣體等因素的影響，反而更易保留在彈殼上，該結(jié)果提示彈殼接觸DNA 間接轉(zhuǎn)移發(fā)生速度遠比預料的快。而實際案例中犯罪團伙常多人合用槍支彈藥，造成“二次接觸”甚至“三次接觸”的DNA混合，使彈殼接觸DNA的檢測變得更加復雜?？偟膩碚f，實際檢案中所涉及的彈殼接觸DNA常兼具法醫(yī)物證疑難檢材的微量、降解和混合三大問題。因此，規(guī)范采集、及時檢測和預防污染是涉槍類案件中彈殼接觸DNA成功提取的關(guān)鍵因素。

1 彈殼接觸DNA檢測的影響因素

1.1 個體細胞脫落差異及與槍彈接觸方式

不同個體細胞脫落情況存在差異，因此，與彈殼接觸后留下的DNA 量有較大不同。研究發(fā)現(xiàn)，從彈殼上提取到易脫落者的DNA 最高量約是難脫落者的50 倍[2]，總的來說，根據(jù)表皮粗糙程度，男性個體比女性個體普遍脫落更多的細胞或DNA[7]。除此之外，與槍彈的接觸時間和力度也決定了彈殼接觸DNA 的含量。有研究[8]認為，最后上彈的彈殼表面殘留的DNA含量最高，這是由于在上彈過程中，所要求的裝彈壓力隨著子彈數(shù)量的增加而增加，因此個體與子彈表面的摩擦力隨之增大。呂曉革等[6]應(yīng)用92 式手槍9 mm子彈，比較不同接觸方式下?lián)舭l(fā)前后彈殼接觸DNA的分型效率，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過擊發(fā)過程后，裸手裝卸子彈非刻意接觸組所遺留的DNA 分型有明顯的位點丟失現(xiàn)象（n=10，P<0.001），而刻意接觸組（接觸時間長、力度大及涂抹唾液）位點丟失現(xiàn)象明顯少于非刻意接觸組，其中以涂抹唾液組的DNA 檢出率最高。以上研究提示，人體細胞脫落差異和與槍彈接觸方式直接決定了彈殼上接觸DNA 的含量，是影響DNA 檢出率的最主要因素。

1.2 彈殼和槍支的物理性質(zhì)

彈殼接觸DNA 的提取也受到子彈的材質(zhì)、大小和槍支類型的影響。彈殼根據(jù)材質(zhì)一般可分為銅殼、鎳殼、鋼殼鍍銅、鋼殼涂漆和非金屬等，其中以黃銅彈殼最為常見。研究[9]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用擦拭法、膠帶粘取和真空超濾法采集的擊發(fā)前后的鎳彈殼接觸DNA 含量遠大于銅彈殼（未擊發(fā)時P=0.000，擊發(fā)后P=0.004）。CERVANTES-CERVANTES 等[10]認為，該現(xiàn)象來源于銅芯中銅離子催化還原反應(yīng)導致氧自由基生成，促進了DNA 的氧化損傷和降解。而MORENO 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，當使用螯合劑去除反應(yīng)體系中的銅離子后，彈殼接觸DNA擴增結(jié)果明顯改善，說明銅離子主要是抑制PCR反應(yīng)，而并非對DNA造成不可逆損傷。JANSSON等[2]通過對11 種槍支與彈藥組合的研究，發(fā)現(xiàn)彈殼材料和槍支類型對彈殼接觸DNA 含量有顯著影響，當使用相同類型的槍支（來復槍和Zastava M57）時，涂漆彈殼（coated cartridge）的等位基因峰值高度比黃銅彈殼低6倍，而用獵槍發(fā)射的塑料霰彈接觸DNA的含量最高，推測原因可能是在擊發(fā)過程中，與金屬外殼相比，塑料表面的溫度較低。該研究表明，不同材質(zhì)彈殼接觸DNA 的提取率為塑料彈殼>鎳彈殼>銅彈殼>涂漆彈殼。而使用的槍支類型對DNA回收率的影響甚至更高，同樣的黃銅子彈，用手槍（如Zastava M70）射擊時，彈殼接觸DNA 的回收量約是沖鋒槍射擊時的15 倍，推測這可能是不同槍支擊發(fā)時子彈瞬時加速度和槍管內(nèi)溫度的不同造成。目前，子彈大小與彈殼接觸DNA 含量的關(guān)系尚無定論。但MILNTHORP等[12]研究發(fā)現(xiàn)，選擇不同的DNA 收集方法，可提高不同規(guī)格子彈的DNA 回收率，其中膠帶粘取法更適用于9 mm 子彈，但對于更大的子彈，應(yīng)用浸泡法可回收更多的DNA。

1.3 子彈擊發(fā)

既往研究發(fā)現(xiàn)，子彈擊發(fā)過程可明顯降低彈殼接觸DNA的檢出率。JANSSON 等[2]發(fā)現(xiàn)，從未發(fā)射的子彈（黃銅，9 mm 瑞典軍用彈藥m/39B）中提取的DNA量比用格洛克17 式手槍（Glock 17）擊發(fā)后的子彈高10 倍。MONTPETIT 等[5]和THANAKIATKRAI 等[13]的研究證實，即使在極低外界溫度下，擊發(fā)子彈仍可造成可回收DNA 的量降低約30%，這可能是子彈擊發(fā)瞬間產(chǎn)生高溫造成了DNA分解或?qū)NA更緊密地黏附在子彈表面而不易提取。另外，火器發(fā)射后金屬彈殼膨脹及半自動或自動火器彈殼的機械作用均可造成子彈和槍膛接觸，這種擊發(fā)壓力也可能清除彈殼上的DNA。除此之外，也有研究[14]發(fā)現(xiàn)，擊發(fā)后的彈殼接觸DNA 出現(xiàn)大片段擴增不良，并伴隨常規(guī)STR 試劑盒中易受PCR 抑制的牙釉蛋白基因（Amelogenin）擴增受阻，說明該DNA 分型失敗也可能來自PCR 擴增過程受到抑制。目前，射擊殘留物是較明確的彈殼接觸DNA 擴增抑制物之一[2]。射擊殘留物是指射擊時通過彈膛和彈殼體間隙逸出并附著在彈殼體表面的槍彈底火藥燃燒生成的煙垢、未完全燃燒的火藥顆粒、微量金屬屑及槍支潤滑劑等，其主要成分包括未燃燒的火藥，硝酸鉀（KNO3）和硫酸鉀（K2SO4）燃燒產(chǎn)生的金屬氧化物及鹽類，底火藥燃燒產(chǎn)生的氯化鉀（KCl）和三硫化二銻（Sb2S3），以及彈頭摩擦產(chǎn)生的金屬粉末等，這些物質(zhì)對PCR 均有抑制作用[15]。郭磊等[16]應(yīng)用雙拭子法對子彈全部外表面和火藥殘留較少部分分別進行提取，發(fā)現(xiàn)后者基因型的檢出率為24.44%，高于前者（16.67%），說明擊發(fā)產(chǎn)生的射擊殘留物對彈殼接觸DNA的鑒定有較大影響。

2 彈殼接觸DNA的檢驗與鑒定

考慮到彈殼接觸DNA 的鑒定常受到微量和PCR抑制物的影響，研究人員開始嘗試對彈殼接觸DNA的采集、提取、濃縮、純化以及擴增等步驟進行改良，附表1 列出了近年來國內(nèi)外彈殼接觸DNA 鑒定相關(guān)的主要方法學研究[1，3，5，8，12-13，17-20]。然而，考慮到不同實驗室所采用的DNA 提取方法和分析試劑盒存在差異，加之對彈殼接觸DNA 鑒定成功的判定標準不同，故很難客觀地比較不同方法的效率。綜合各種方法，彈殼接觸DNA鑒定的成功率為6%～26%[5，8]。

2.1 彈殼接觸DNA的采集

擦拭法是目前采集接觸DNA 常用的方法之一，包括一步擦拭法、兩步擦拭法（包括第一步濕拭子+第二步干拭子和第一步濕拭子+第二步濕拭子）、裂解液擦拭法和微拭子擦拭法等[1]。瑞典國家法醫(yī)中心（Swedish National Forensic Centre，SNFC）研究[2]發(fā)現(xiàn)，相比于傳統(tǒng)棉簽，植絨尼龍拭子有利于DNA 釋放，從而獲得更高的DNA 回收率。應(yīng)用尼龍拭子擦拭結(jié)合Chelex-100 法提取，彈殼接觸DNA 檢出率得到明顯改善，彈殼和子彈上的DNA（0.001 ng/μL）回收率分別從11.1%和16.0%提升至28.6%和43.3%。同時，有效的DNA 分型圖譜數(shù)量也從5%增加到8%。DIELTJES 等[8]在傳統(tǒng)擦拭法的基礎(chǔ)上，采用浸泡和擦拭相結(jié)合的方法從證據(jù)樣本中采集生物成分。即在Qiagen Buffer ATL 緩沖液中直接浸泡30 min 后進行擦拭，隨后將拭子和浸出液于85 ℃孵育10 min，并在56 ℃下與蛋白酶K 共孵育1 h，隨后使用PowerPlex?16 BIO、IdentifilerTM或MiniFilerTM試劑盒進行擴增。在2009—2013 年的涉槍類案件中，應(yīng)用該方法分別在彈殼、槍彈和彈頭獲得7.1%、10.1%和29.5%的DNA分型成功率。隨后，TROY等[17]對浸泡法進一步改良，在浸泡的同時加入超聲降解法，與傳統(tǒng)的雙拭子法相比，該方法的DNA 回收率明顯提升。為了最大程度地降低彈殼表面銅離子對DNA 檢測的干擾，2015年，WAN 等[18]開發(fā)了膠帶粘取法收集彈殼接觸DNA。該方法與濕拭子擦拭法相比，可將暴露在DNA 溶液中的銅離子含量降至最低，同時也被證實是DNA 降解率最低的方法。該研究同時發(fā)現(xiàn)，與濕拭子擦拭法相比，膠帶粘取法可從黃銅彈殼中獲得更高的DNA 產(chǎn)量，但在鍍鎳槍彈上兩種方法沒有差異。另外，在最近的研究中，針對銅離子對彈殼接觸DNA 鑒定的干擾，BILLE 等[3]在商品化漂洗溶液Qiagen Buffer ATL緩沖液中加入銅離子螯合劑胎牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）和三肽甘氨酸-甘氨酸-組氨酸（Gly-Gly-His，GGH）的混合液，使平均DNA 回收量從200 pg 提高至14 ng，并成功獲得所有樣本的DNA分型。與以水為溶劑的傳統(tǒng)兩步擦拭法相比，DNA平均降解指數(shù)（degradation index，DI）由1.9 降至1.0～1.4。同時，研究人員在該漂洗溶液的基礎(chǔ)上進行浸潤擦拭法改良，分別采用兩輪4 次反復浸潤配合海綿和棉簽拭子擦拭收集。與兩步擦拭法相比，該方法有效提升了DNA 回收量（從49 pg 提高至143 pg，P=0.000 9），并顯著改善了GlobalFilerTM試劑盒各STR 位點的平均相對熒光單位（relative fluorescence unit，RFU；P=0.000 3），為銅彈殼表面接觸DNA的采集提供了參考。相反，PRASAD 等[9]最近的研究結(jié)果表明，與傳統(tǒng)擦拭法和膠帶粘取法相比，近年新興的真空過濾法對于擊發(fā)前后的鎳彈殼和銅彈殼接觸DNA 采集沒有顯著優(yōu)勢，對于擊發(fā)后的銅彈殼接觸DNA 采集效率更是遠低于傳統(tǒng)擦拭法和膠帶粘取法。由于該方法基于真空負壓作用下洗脫液的瞬間抽離，推測可能在洗脫DNA 的同時也脫落了射擊殘留物從而干擾了后續(xù)DNA擴增反應(yīng)。

2.2 彈殼接觸DNA的提取和純化

由于上述采集過程，特別是浸泡法常造成樣本溶液體積大、DNA 純度低且混有PCR 抑制物等問題，因此難以進行后續(xù)DNA擴增。目前，大多數(shù)研究使用傳統(tǒng)有機溶劑法和硅基質(zhì)法（Silica-based，主要包括硅珠和硅膠膜），多種基于硅珠和硅膠膜的商品化試劑盒已被開發(fā)，包括QIAamp DNA Mini 試劑盒、QIAamp DNA Investigator 試 劑盒、PrepFilerTMForensic DNA Extraction 試劑盒、EZ1 DNA Investigator 試劑盒以及DNA IQTMSystem 等。由于不同試劑盒所適用的分析過程和儀器不同，尚無法對以上方法的提取效率進行比較。HORSMAN-HALL 等[1]認為，使用有機溶劑法的DNA 提取效率遠低于以DNA IQTMSystem 為基礎(chǔ)的3 種改良方法。然而，MOTTAR 等[19]和RAY 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，與使用QIAamp DNA Investigator 試劑盒相比，兩步擦拭法（第一步裂解液潤濕拭子+第二步干拭子）與有機溶劑純化法協(xié)同提取獲得最多與裝彈者一致的DNA 分型。類似的，TROY 等[17]觀察到有機溶劑法比使用EZ1 DNA Investigator試劑盒獲得更高的DNA 產(chǎn)量，同時具有較高的RFU 和較好的峰高平衡。這種差異可能因為兩實驗分別采用了乙醇沉淀法和短片段（相對分子質(zhì)量30 000）分子篩來進行DNA 溶液濃縮。DNA 擴增效果直接取決于加入擴增體系的模板量，VAN OORSCHOT 等[22]證實DNA 的提取步驟可導致約76%的DNA損失。因此，對全部DNA提取物進行濃縮后擴增是目前彈殼接觸DNA 檢驗的另一種推薦方法。MONTPETIT 等[5]應(yīng)用EZ1 DNA Investigator試劑盒對DNA提取物濃縮后擴增，分別在26%的擦拭樣本和34.7%的浸泡樣本中獲得了成功分型，該結(jié)果相對于DIELTJES等[8]浸泡提取后加入最大體積的DNA 提取物（成功率為6.9%）具有顯著提升。FAN 等[23]使用微透析濃縮法，將前一步得到的上清液應(yīng)用微孔離心過濾裝置Microcon? Centrifugal Filters洗滌濃縮，效果明顯優(yōu)于Chelex-100 法，該濃縮方法也被許多國內(nèi)研究采納。此外，也有研究對PCR直接擴增法進行了嘗試。直接擴增法省去了DNA提取過程，比傳統(tǒng)方法更經(jīng)濟快捷，靈敏度更高。THANAKIATKRAI 等[13]使用5 μL 0.1% TritonTMX-100 濕潤彈殼配合植絨尼龍拭子進行兩步擦拭法從鋁彈殼中采集DNA，發(fā)現(xiàn)直接擴增法與標準的DNA提取 和DNA IQTMSystem 或Prep-n-GoTMBuffer 純化的DNA 樣本相比，提取成功率顯著提升，其中應(yīng)用GlobalFilerTM試劑盒和IdentiFilerTMPlus 試劑盒對樣本直接擴增，可分別獲得77%和90%的有效DNA 分型圖譜，而經(jīng)標準的DNA 提取方法的樣本僅獲得4%的DNA 分型圖譜。采用直接擴增法、DNA IQTM提取法和預稀釋法（磷酸鹽緩沖溶液）對擊發(fā)后的彈殼接觸DNA 進行檢測，分別獲得了平均等位基因數(shù)11.1（7.9～13.9）、5.6（3.0～7.7）和2.3（0.2～4.0）。而從3種不同口徑的槍支（Glock Model 19、AK47和Tavor T-21）的9 mm、7.62 mm 和5.56 mm 口徑子彈獲得的有效等位基因個數(shù)沒有明顯差異。除此之外，一些非標準提取和純化方法也被證實能有效獲得DNA分型，PRINZ等[20]應(yīng)用質(zhì)譜儀裂解緩沖液純化DNA后，應(yīng)用過濾捕獲裝置對樣本進行濃縮，發(fā)現(xiàn)該DNA 提取方法適用于擊發(fā)和未擊發(fā)的彈殼STR 分析。該方法可獲得與蛋白酶K DNA 純化法相似的DNA 含量，同時也捕獲了檢測樣本蛋白質(zhì)成分的能力，在未來多組學的生物物證分析中具有更大潛力。

PRASAD等[24]的研究證實，使用Qiagen Buffer ATL組織裂解緩沖液浸泡方式進行DNA 提取并不影響擊發(fā)后的9 mm 口徑帕拉貝魯姆手槍銅彈殼（9 mmP）和0.22 寸口徑長來復槍鎳彈殼（.22 Long Rifle，.22LR）的彈痕紋理細節(jié)，提示可以進行生物提取后的彈道比對。因此，當復雜槍擊案現(xiàn)場存在兩名以上持槍者或多名中彈者時，結(jié)合彈道學和微量物證學分析，彈殼接觸DNA 鑒定亦可為犯罪現(xiàn)場重建提供參考。國內(nèi)曾報道1 例根據(jù)彈殼接觸DNA 判斷子彈彈著點的案例[25]。現(xiàn)場對疑似彈著點進行棉線擦拭和Chelex-100 法提取DNA，Amicon? Ultra Centrifugal Filters 純化擴增，分別在沙發(fā)腿2 處和東墻墻壁3 處獲得與子彈擊中兩人一致的分型，并且根據(jù)子彈表面DNA 殘留量在彈著點的下降規(guī)律判斷彈著點先后順序，彈殼接觸DNA 鑒定憑借個體特異性優(yōu)勢完美彌補了微量物證的不足之處。

2.3 彈殼接觸DNA的擴增和分型

彈殼接觸DNA 擴增存在微量和抑制物等諸多不定因素，目前多數(shù)相關(guān)研究應(yīng)用的是基于毛細管電泳檢測的PCR 擴增試劑盒，如PowerPlex? 16 HS、Iden?tiFilerTMPlus、MiniFilerTM、GlobalFilerTM和PowerPlex?Fusion等，具有靈敏度更高和抗抑制性更強等特點[26]。考慮到微量降解問題，MiniFilerTM試劑盒被證實更適用于彈殼接觸DNA的擴增。HORSMAN-HALL等[1]應(yīng)用兩步擦拭法對彈殼上的DNA 采集進行比較，發(fā)現(xiàn)盡管在常規(guī)裝彈接觸過程中，使用MiniFilerTM和Power?Plex? 16 BIO 試劑盒獲得的有效等位基因之間差異無統(tǒng)計學意義，但當個體在上彈之前與彈殼刻意接觸時，使用MiniFilerTM試劑盒的等位基因擴增成功率為22%，高于PowerPlex? 16 BIO 的7%，而所有樣本經(jīng)IdentifilerTM試劑盒擴增均未見有效分型。值得注意的是，MiniFilerTM試劑盒和PowerPlex? 16 BIO試劑盒擴增的樣本中均存在一定比例的混合分型。MONTPETIT等[5]推薦50 pg 以上的DNA 樣本使用IdentifilerTMPlus試劑盒，而低于50 pg使用MiniFilerTM試劑盒。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，也有學者嘗試應(yīng)用大規(guī)模并行測序（massively parallel sequencing，MPS）技術(shù)對彈藥或彈殼中的低模板量線粒體DNA 進行檢測。值得一提的是，HOLLAND 等[27]發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)體系中加入螯合劑0.5 mol/L 乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）可以最大程度地提高產(chǎn)量，同時降低銅離子對擴增的干擾，提示在用于彈殼接觸DNA 提取的浸泡溶液中加入EDTA有望提高回收率。

3 彈殼接觸DNA檢測的挑戰(zhàn)和展望

目前，盡管彈殼接觸DNA 的研究眾多，但為了盡可能確定單一因素對DNA 提取效率和鑒定結(jié)果的影響，多數(shù)實驗選擇了單一個體刻意接觸或唾液涂抹等方式模擬檢材，甚至在預實驗時對子彈表面進行了清理。同時，由于不同研究者對成功分型的定義存在差異，也使得多種DNA 提取和純化方式的效率難以比較。值得注意的是，許多有效提取和純化方法的統(tǒng)計學差異僅在未擊發(fā)的子彈中觀察到，這意味著在實際案例中，彈殼接觸DNA 鑒定的成功率將遠低于文獻報道。另外，微量DNA 分型圖譜常帶來混合分型風險。PRASAD 等[9]根據(jù)澳大利亞悉尼地區(qū)STR 數(shù)據(jù)庫常規(guī)分析標準（175 RFU）進行分析時，僅有3 例樣本出現(xiàn)混合分型，而使用確認閾值（80 RFU）分析時，發(fā)現(xiàn)2 例擦拭樣本、6 例膠帶粘取樣本、1 例真空抽濾樣本和1 例PCR 直接擴增樣本出現(xiàn)了drop-in 的混合分型現(xiàn)象。這提示我們，彈殼接觸DNA 分型的分析在確定貢獻者的數(shù)量以及隨機變異、判斷等位基因的drop-out和drop-in等方面面臨挑戰(zhàn)。目前，多種概率基因分型（probabilistic genotyping）方法（例如半連續(xù)和全連續(xù)）為混合彈殼接觸DNA 樣本的分析解釋提供了更多效力，但實際案件中彈殼接觸DNA 的混合分型，特別是低組分個體的基因分型，仍需結(jié)合其他物證和相關(guān)證據(jù)謹慎使用。