糖環(huán)修飾的腺苷類似物的合成及其抗腫瘤活性研究

朱慧敏，曾萬波，張 偉，李 東，徐 亮*(1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300350；.軍事醫(yī)學(xué)研究院 毒物藥物研究所 抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850；3.北京解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心心臟大血管外科，北京 100853)

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康,抗腫瘤藥物的研發(fā)一直是研究熱點(diǎn)。腺苷是人體內(nèi)天然存在的內(nèi)源性核苷分子，具有良好的安全性，臨床已用于心律失常、心絞痛、心肌梗死等疾病的治療。近年研究發(fā)現(xiàn)，腺苷及其類似物還具有潛在的抗腫瘤活性[1]，可能與激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶A(Adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)[2]有關(guān)。

AMPK是生物體能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，腫瘤細(xì)胞的能量代謝途徑已成為治療腫瘤的潛在靶點(diǎn)[2]。正常細(xì)胞主要依靠線粒體的氧化磷酸化為細(xì)胞供能，而大多數(shù)腫瘤細(xì)胞則依賴有氧糖酵解，這種現(xiàn)象被稱之為“Warburg” 現(xiàn)象，Brandon F等[1,3]研究發(fā)現(xiàn)，AMPK激活能夠促進(jìn)分解代謝途徑，抑制合成代謝途徑，并通過缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)和腫瘤抑制基因p53降低腫瘤細(xì)胞糖酵解水平，抑制Warburg現(xiàn)象，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。王欽加[4]研究發(fā)現(xiàn)，AMPK激活可以抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑的異?；罨?，同時(shí)可通過乙酰輔酶A陽離子化酶(ACC)磷酸化促進(jìn)能量代謝并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

腺苷類化合物普遍半衰期短，不能有效穿過血腦屏障，胃腸道吸收差[5-7]?；谙佘漳负私Y(jié)構(gòu)的修飾與改造是尋找效果更好、毒性更低、底物選擇性更好的新型抗腫瘤藥物的重要手段[8]，例如8-氯環(huán)磷酸腺苷及其代謝產(chǎn)物8-氯腺苷均具有良好的抗腫瘤活性，目前都已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[9-10]。通過對(duì)8-氯腺苷親脂衍生化和脂質(zhì)體制劑手段的雙重結(jié)合，可改善藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性，并增加抗腫瘤活性和生物利用度[11]。通過取代的吡啶雜環(huán)替換糖基所得到的3-去氮腺苷類似物，具有良好的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性[8]。2氮雜-ε-腺苷(la)增強(qiáng)了腺苷分子的親脂性，在小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織上表現(xiàn)出有效的抗腫瘤活性[12]。本研究以腺苷為先導(dǎo)結(jié)構(gòu)，以增加親脂性和結(jié)構(gòu)多樣化為目的，選擇糖環(huán)羥基為修飾位點(diǎn)，通過2′ 和3′ 羥基取代成環(huán)以及共酯化的修飾策略，設(shè)計(jì)了一系列具有較好親脂性的化合物，測(cè)試了這些化合物對(duì)MCF-7腫瘤細(xì)胞的抑制活性，并通過AutoDock Vina計(jì)算機(jī)分子對(duì)接模擬，探討了優(yōu)選化合物與AMPK的作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1儀器 DF-101S型恒溫加熱磁力攪拌器和SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵，均購自鞏義市予華有限責(zé)任公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；GL-9406型手提紫外分析儀(海門市其林貝爾儀器制造公司)；JNM-ECS400型核磁共振譜儀(日本電子株式會(huì)社)；Agilent Technologies LC/MS 1200 series-6130 Quadrupole液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent Technologies 公司)；Milli-O超純水系統(tǒng)[美國密理博(Millipore)公司]；Ealise T-SR正置熒光顯微鏡(日本尼康株式會(huì)社)；1A1003型電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；SpectraMax MS型酶標(biāo)儀(美國塞默飛世爾科技有限公司)。

1.2試藥 腺苷、3-甲氧基苯甲醛、3-甲基苯甲醛、對(duì)甲基苯甲醛、3-氟苯甲醛、3-氯苯甲醛、3-溴苯甲醛、無水氯化鋅、超干四氫呋喃、乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、異丁酸酐、甲醇鈉、稀硫酸和無水吡啶，均購自安耐吉有限公司；甲苯、乙酸乙酯、石油醚和二氯甲烷，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水甲醇(西隴科學(xué)股份有限公司)；柱層析硅膠(煙臺(tái)德信生物科技有限公司)；薄層層析板GF254(煙臺(tái)信德化學(xué)有限公司)；生理鹽水(石家莊四藥有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液(PBS)，均購自Gibco公司；胎牛血清、二甲基亞砜和氘代氯仿，均購自Sigma公司；乙二胺四乙酸(Amresco公司)。

1.3細(xì)胞 MCF-7乳腺癌細(xì)胞，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞資源中心提供。

2 方法

2.1化合物的合成 合成路線見圖1，部分方法參考文獻(xiàn)[13-15]方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 目標(biāo)化合物5a～5f和6a～6d的合成路線Fig.1 Synthesis route of target compounds 5a-5f and 6a-6d

化合物2即(2R,3R,4R,5R)-2-(乙酰氧基甲基)-5-羥基四氫呋喃-3,4-二基二乙酸酯的合成 取化合物1(1 g，0.003 7 mol)，加入無水吡啶10 mL，再加入乙酸酐(2.24 mL,0.002 4 mol)，室溫下攪拌24 h后，薄層色譜檢測(cè)反應(yīng)完全，加入乙醇1 mL去除過量的乙酸酐，抽真空濃縮，用30 mL甲苯洗滌，重復(fù)3次，旋干呈黃色油狀物，P2O5真空干燥得到化合物2(2.10 g,產(chǎn)率為99.0%)，為白色粉末。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δH：5.98(d,J=0.6 Hz,1H)，5.25～5.16(m，2H),4.33～4.22(m,2H),4.06～3.97(m,1H),2.08～1.99(m,12H);MS(m/z)：319.10[M+H]+。

化合物3即(2R,3R,4R,5R)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3，4-二乙酸二酯的合成 在室溫和氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將化合物2(0.355 g，0.001 1 mol)和腺嘌呤(0.161 g，0.001 2 mol)加入到氯化錫(0.62 g，0.002 4 mol)中，再將混合物滴加到無水乙腈30 mL中，得到淺黃色溶液，攪拌18 h后，減壓蒸餾。在冰浴攪拌條件下逐滴加入碳酸鈉(0.69 g，0.006 5 mol)，反應(yīng)直到氣泡停止，得到白色沉淀物。減壓蒸餾后剩余白色粉末，將其用熱氯仿重復(fù)萃取，濃縮，得到淺黃色油狀物(0.539 g)。進(jìn)行柱色譜分離(氯仿-甲醇=95∶5)，得到化合物3(0.29 g,產(chǎn)率為67.1%)，為無色油狀物。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δH：8.32(s,1H)，8.12(s,1H)，7.37(s,2H)，6.16(d，J=5.5 Hz，1H)，5.99(t，J=5.7 Hz，1H)，5.58(dd，J=5.9，4.7 Hz，1H)，4.41～4.33(m，1H)，4.31(dd,J=5.1,3.8 Hz,1H)，4.19(dd，J=11.7,5.5 Hz,1H)，2.07(s,2H)，1.98(d,J=11.1 Hz,7H)；MS(m/z):384.13[M+H]+。

化合物4即(2R,3R,4R,5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(羥甲基)四氫呋喃-3，4-二醇的合成 取化合物3(100 mg，0.000 25 mol)，加入12.5 mL的甲醇鈉溶液，用稀硫酸調(diào)節(jié)pH值至5.5。通過硅藻土過濾除去所得的白色沉淀物，并用無水甲醇洗滌；用硫酸鎂干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)合并濾液和洗滌液，得到無色粉末(0.071 g,產(chǎn)率為100%)。從水中重結(jié)晶，在P2O5上真空干燥，得到化合物4(0.02 g,產(chǎn)率為33.3%)，為無色針狀物。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：8.36(s,1H),8.14(s,1H),7.37(s,2H),5.88(d，J=6.2 Hz,1H),5.50～5.41(m，2H)，5.21(d,J=4.5 Hz，1H),4.62(td,J=6.3,4.9 Hz,1H),4.15(td,J=4.8，2.9 Hz,1H),3.97(q,J=3.4 Hz,1H),3.68(dt,J=12.1,4.1 Hz,1H),3.56(ddd，J=11.7，7.3,3.6 Hz,1H);MS(m/z):268.10[M+H]+。

化合物5a即2′，3′-O-p-甲氧基芐叉腺苷(6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-(3-甲氧基苯基)四氫呋喃[3，4-d][1，3]二噁酚-4-基)甲醇的合成 取化合物4(1 g,0.003 7 mol)，加入2 mL的超干四氫呋喃，加入無水氯化鋅(3.5 g，0.257 mol)，4 mL 3′-甲氧基苯甲醛，常溫?cái)嚢?4 h后，薄層色譜法檢測(cè)反應(yīng)完全，停止反應(yīng)。加入20 mL乙酸乙酯，滴加6 mL碳酸氫鈉飽和溶液后過濾。用乙酸乙酯30 mL提取濾液中的有機(jī)相，重復(fù)3次，再用100 mL水洗滌有機(jī)相。抽真空濃縮得淡黃色油狀物，進(jìn)行柱色譜分離(50%～100%，乙酸乙酯/石油醚)，得到白色固體5a(1.16 g，產(chǎn)率為80.2%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：8.38(d，J=2.6 Hz，1H)，8.17(d，J=2.2 Hz，1H),7.37(q，J=9.7，8.8 Hz，4H)，7.16～7.10(m,1H),7.03(dd，J=19.7，9.7 Hz,1H)，6.29(dd，J=4.9，3.0 Hz，1H)，6.01(s,1H)，5.52～5.47(m,1H),5.09(d，J=6.3 Hz，1H)，4.36(t，J=3.8 Hz,1H)，3.64～3.52(m，3H),1.90(s，3H);相對(duì)分子質(zhì)量為385.38，MS(m/z)：386.15[M+H]+。

化合物5b即(6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-(間甲苯基)四氫呋喃并[3，4-d][1，3]二氧代-4-基)甲醇的合成 取化合物4(1 g，0.003 7 mol)，加入2 mL的超干四氫呋喃，加入無水氯化鋅(3.5 g，0.257 mol)，4 mL 3′-甲基苯甲醛。常溫?cái)嚢?4 h后，薄層色譜法檢測(cè)反應(yīng)完全，停止反應(yīng)。加入20 mL乙酸乙酯，滴加6 mL碳酸氫鈉飽和溶液，過濾。用乙酸乙酯30 mL提取濾液中的有機(jī)相，重復(fù)3次，再用100 mL水洗滌有機(jī)相。抽真空濃縮得淡黃色油狀物，進(jìn)行柱色譜分離(50%～100%,乙酸乙酯/石油醚)；得到白色固體5b(0.75 g，產(chǎn)率為54.3%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：8.35(d,J=2.6 Hz，1H)，8.13(d，J=2.2 Hz，1H)，7.31(m，4H)，6.26(dd，J=19.7，9.7 Hz，1H)，5.96(s，1H)，5.46(dd，J=4.9，3.0 Hz，1H)，5.28(m，2H)，5.04(dd，J=6.3,3.3 Hz 1H)，4.33(m，1H)，3.58(m，3H),1.70(s，3H)；MS(m/z)：370.17 [M+H]+。

化合物5c即(6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-(對(duì)甲苯基)四氫呋喃[3,4-d][1，3]二氧醇-4-基)甲醇的合成 取化合物4(1 g,0.003 7 mol)，加入2 mL的超干四氫呋喃，加入無水氯化鋅(3.5 g，0.257 mol)，4 mL對(duì)甲基苯甲醛，常溫?cái)嚢?4 h后，薄層色譜法檢測(cè)反應(yīng)完全，停止反應(yīng)。加入20 mL乙酸乙酯，滴加6 mL碳酸氫鈉飽和溶液，過濾。用乙酸乙酯30 mL提取濾液中的有機(jī)相，重復(fù)3次，再用100 mL水洗有機(jī)相。抽真空濃縮得淡黃色油狀物，進(jìn)行柱色譜分離(50%～100%，乙酸乙酯/石油醚)；得到白色固體5c(0.95 g，產(chǎn)率為65.9%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δH: 8.38(d，J=2.6 Hz，1H)，8.27(d，J=2.2 Hz，1H)，7.37(q，J=9.7，8.8 Hz，4H),7.31～7.25(m，1H)，6.37(dd，J=19.7，9.7 Hz，1H)，6.29(dd，J=4.9，3.0 Hz,1H)，6.01(s，1H)，5.52～5.47(m,1H)，5.07 (dd，J=6.5，2.3 Hz，1H)，4.36(t，J=3.8 Hz，1H)，3.64～3.52(m，3H)，2.0(s，3H);MS(m/z)：370.14[M+H]+。

化合物5d即(6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-(3-氟苯基)四氫呋喃[3,4-d][1，3]二噁酚-4-基)甲醇的合成 取將化合物4(1 g,0.003 7 mol)，加入2 mL的超干四氫呋喃，加入無水氯化鋅(3.5 g，0.257 mol)，4 mL 3′-氟苯甲醛，常溫?cái)嚢?4 h后，薄層色譜法檢測(cè)反應(yīng)已完全，停止反應(yīng)。加入20 mL乙酸乙酯，滴加6 mL碳酸氫鈉飽和溶液，過濾。用乙酸乙酯30 mL提取濾液中的有機(jī)相，重復(fù)3次，再用100 mL水洗有機(jī)相。抽真空濃縮得淡黃色油狀物，進(jìn)行柱色譜分離(50%～100%,乙酸乙酯/石油醚)；得到白色固體5d(1.25 g，產(chǎn)率為89.4%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：8.40 (s，1H)，8.16 (s，1H)，7.61～7.40(m，4H)，7.47～7.35(m，1H)，6.30 (d,J=2.8 Hz，1H)，6.01(s，1H)，5.50 (dd,J=6.5，2.8 Hz，1H)，5.32(t,J=5.5 Hz，1H)，5.07 (dd，J=6.5，2.3 Hz，1H)，4.34 (dt，J=8.7，5.2 Hz，3H)，3.56(t,J=3.8 Hz,1H)，3.51(m，3H);MS(m/z):374.12[M+H]+。

化合物5e即(6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-(3-氯苯基)四氫呋喃并[3，4-d][1，3]二氧代-4-基)甲醇的合成 取化合物4(1 g,0.003 7 mol)，加入2 mL的超干四氫呋喃，加入無水氯化鋅(3.5 g,0.257 mol)，4 mL 3′-氯苯甲醛，常溫?cái)嚢?4 h后，薄層色譜法檢測(cè)反應(yīng)已完全，停止反應(yīng)。加入20 mL乙酸乙酯，滴加6 mL碳酸氫鈉飽和溶液，過濾。用乙酸乙酯30 mL提取濾液中的有機(jī)相，重復(fù)3次，再用100 mL水洗有機(jī)相。抽真空濃縮得淡黃色油狀物，進(jìn)行柱色譜分離(50%～100%，乙酸乙酯/石油醚)；得到白色固體5e(1.15 g,產(chǎn)率為78.5%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH： 8.34 (s，1H)，8.13 (s，1H)，7.61(q，J=9.7，8.8 Hz，3H)，7.52～7.47(m，1H)，7.37(dd，J=19.7，9.7 Hz，1H)，6.19(dd，J=4.9，3.0 Hz，1H)，6.01(s，1H)，5.51 (dd，J=6.5，2.8 Hz，1H)，5.21(s，1H)，5.08 (dd，J=6.6，2.4 Hz，1H)，4.34 (td，J=5.1，2.4 Hz，1H)，3.52 (tt，J=11.5，6.4 Hz，2H);MS(m/z):390.09[M+H]+。

化合物5f即(6-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-(3-溴苯基)四氫呋喃[3，4-d][1，3]二噁酚-4-基)甲醇的合成 取化合物4(1 g,0.003 7 mol)，加入2 mL的超干THF，加入無水氯化鋅(3.5 g,0.257 mol)，4 mL 3′-溴苯甲醛，常溫?cái)嚢?4 h后，薄層色譜法檢測(cè)反應(yīng)已完全，停止反應(yīng)。加入20 mL乙酸乙酯，滴加6 mL碳酸氫鈉飽和溶液，過濾。用乙酸乙酯30 mL提取濾液中的有機(jī)相，重復(fù)3次，用100 mL水洗有機(jī)相。抽真空濃縮得淡黃色油狀物，進(jìn)行柱色譜分離(50%～100%,乙酸乙酯/石油醚)；得到白色固體5f(0.98 g,產(chǎn)率為60.4%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δH：8.51(s，1H)，8.24(s,1H)，7.37(m，6H)，6.30(d，J=4.9，3.0 Hz，1H)，6.01(s,1H)，5.52～5.47(m,1H)，5.08(m，1H)，4.40(t，J=3.8 Hz，1H),3.56(m,2H)；MS(m/z):434.02[M+H]+。

化合物6a即(2R,3R,4R,5R)-2-(乙酰氧基甲基)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3，4-二乙酸二酯的合成 取化合物4(1 g，0.003 7 mol)，加入10 mL無水吡啶，再加入1.12 mL乙酸酐，攪拌16 h后，薄層色譜法檢測(cè)反應(yīng)已完全,加入冰冷的無水乙醇，停止反應(yīng)。抽真空濃縮得淡黃色油狀物，進(jìn)行柱色譜分離(50%～100%，乙酸乙酯/石油醚)；得白色固體6a(1.46 g,產(chǎn)率為99.1%)。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δH：8.32(s,1H)，8.12(s，1H)，7.37(s，2H)，6.16(d,J=5.5 Hz,1H)，5.99(t,J=5.7 Hz,1H)，5.58(dd,J=5.9,4.7 Hz,1H),4.41～4.33(m，1H),4.31(dd，J=5.1,3.8 Hz,1H),4.19(dd,J=11.7，5.5 Hz，1H),2.07(s，2H),1.98(d，J=11.1 Hz,7H)；MS(m/z)：394.14[M+H]+。

化合物6b即(2R,3R,4R,5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((丙酰氧基)甲基)四氫呋喃-3，4-二丙酸二酯的合成 取化合物4(1 g，0.003 7 mol)，加入10 mL無水吡啶，再加入1.53 mL丙酸酐，攪拌6 h后，薄層色譜法檢測(cè)反應(yīng)已完全,加入冰冷的無水乙醇，停止反應(yīng)。抽真空濃縮得淡黃色油狀物，進(jìn)行柱色譜分離(50%～100%,乙酸乙酯/石油醚)；得白色固體6b(1.47 g,產(chǎn)率為90.0%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δH：8.35 (s,1H)，8.17 (s,1H),7.43 (s,2H),6.20 (d,J=5.3 Hz,1H),6.04 (t,J=5.6 Hz,1H),5.66 (t,J=5.4 Hz,1H),4.42 (dd,J=11.7,3.7 Hz,1H),4.36 (q,J=4.6 Hz,1H)，4.26 (dd，J=11.8，5.3 Hz，1H)，2.45～2.38 (m,2H),2.35～2.28(m,4H),1.07 (t,J=7.5 Hz,3H)，0.99(td,J=7.4,5.7 Hz,6H)；MS(m/z)：436.19[M+H]+。

化合物6c即(2R,3R,4R,5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤基)-5-(丁酰氧基)甲基四氫呋喃-3，4-二丁酸酯的合成 取化合物4(1 g，0.003 7 mol),加入10 mL無水吡啶，再加入1.94 mL丁酸酐，攪拌6 h后，薄層色譜法檢測(cè)反應(yīng)已完全,加入冰冷的無水乙醇，停止反應(yīng)。抽真空濃縮得淡黃色油狀物，進(jìn)行柱色譜分離 (30%～100%,乙酸乙酯/石油醚)；得白色固體6c(1.47 g，產(chǎn)率為82.1%)。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δH：8.31 (s,1H)，8.12 (s,1H)，7.37(s,2H)，6.16 (d,J=5.3 Hz,1H),6.02 (t,J=5.6 Hz,1H),5.67～5.60(m,1H),4.38 (dd,J=11.8，3.7 Hz,1H),4.32(q,J=4.7 Hz,1H),4.22 (dd,J=11.7,5.2 Hz,1H)，2.43～2.15 (m,5H),1.56 (d,J=7.3 Hz,1H),1.56～1.48(m,1H)，1.46 (qd，J=7.3,5.6 Hz，4H)，1.20(s,1H),0.89 (d，J=7.4 Hz，2H)，0.85 (s,1H)，0.88～0.74 (m,6H)；MS(m/z):478.23[M+H]+。

化合物6d即(2R,3R,4R,5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤基)-5-(異丁酰氧基)甲基四氫呋喃-3，4-二基雙(異丁酸)的合成 取化合物4(1 g，0.003 7 mol)，加入10 mL無水吡啶，再加入1.96 mL異丁酸酐，攪拌6 h后，薄層色譜法檢測(cè)反應(yīng)已完全,加入冰冷的無水乙醇，停止反應(yīng)。抽真空濃縮得淡黃色油狀物，進(jìn)行柱色譜分離(30%～100%,乙酸乙酯/石油醚)；得白色固體6d(1.43 g,產(chǎn)率為80.0%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δH：8.33 (s,1H)，8.15 (s,1H)，7.38 (s,2H),6.20 (d,J=5.0 Hz，1H)，6.02 (t,J=5.4 Hz,1H),5.68 (t,J=5.3 Hz,1H),4.41～4.36 (m,2H),4.28 (dd，J=13.2,6.2 Hz,1H),2.62 (dt,J=14.1,7.1 Hz,1H)，2.57～2.53 (m,1H),1.14 (d,J=7.0 Hz,7H)，1.05 (ddd，J=13.4，7.0，4.2 Hz,14H)；MS(m/z)：478.32[M+H]+。

2.2抗腫瘤細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞培養(yǎng)：以RPMI-1640(含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清，10 g·L-1雙抗)為培養(yǎng)基，將傳代至少3次以上、處于對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞種板培養(yǎng)，具體種板條件為：96孔板，細(xì)胞密度為1×104個(gè)·孔-1，將培養(yǎng)板置于溫度為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，沿孔板底部邊緣處輕輕吸除培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，待給藥[16]。

給藥：細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL含有不同濃度藥物的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中陰性對(duì)照組為RPMI-1640培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清，10 g·L-1雙抗)，陽性對(duì)照組為含5 g·L-1DMSO的生理鹽水，置于溫度為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照[17]。

細(xì)胞染色及細(xì)胞活性測(cè)試：將給藥后24 h的培養(yǎng)板取出，每孔分別加入10 μL MTT染色劑，輕輕振搖，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h；取出后，吸出培養(yǎng)板中上層清液，加入100 μL DMSO，置于搖床中，轉(zhuǎn)速調(diào)至110 r·min-1，時(shí)間為15 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長處的吸光度值A(chǔ)，計(jì)算各樣品的細(xì)胞活性，細(xì)胞活性=樣品吸光度值A(chǔ)÷陰性對(duì)照組吸光度值A(chǔ)×100%，每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔。

2.3分子對(duì)接 利用PYMOL2.3.4軟件對(duì)受體蛋白(PDB Code：4CFF)進(jìn)行去水、去配體等操作，采用AutoDockTools軟件對(duì)受體蛋白進(jìn)行加氫、平衡電荷等修飾，用Grid程序下的Grid Box命令打開Grid Option工具對(duì)受體蛋白進(jìn)行處理，配體結(jié)合口袋的大小由各個(gè)方向上格點(diǎn)的數(shù)量和格點(diǎn)間距共同決定，因此調(diào)整蛋白每個(gè)方向上格點(diǎn)的數(shù)量，結(jié)合口袋的中心以及格點(diǎn)的間距，先將格點(diǎn)間距設(shè)為1，再調(diào)整結(jié)合口袋體積使預(yù)對(duì)接的分子在其最伸展的狀態(tài)下也能在盒子內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)，口袋中心即設(shè)定為結(jié)合位點(diǎn)中心，并將受體蛋白和配體小分子分別轉(zhuǎn)化為pdbqt格式[18]。

3 結(jié)果與討論

3.1化合物的合成分析 所有化合物都經(jīng)過核磁共振氫譜、質(zhì)譜分析確證結(jié)構(gòu)。

在合成路線設(shè)計(jì)上，化合物5a～5f需在糖環(huán)2′ 和3′ 羥基位置共成環(huán)以引入親脂性基團(tuán)?？紤]到5′羥基和氨基的反應(yīng)活性與2′ 和3′ 羥基接近，在研究初期，嘗試了采用叔丁氧羰基(BOC)、叔丁基二甲基硅醚(TBDMS)、芐基(Bn)等基團(tuán)首先對(duì)5′ 羥基和氨基進(jìn)行臨時(shí)性保護(hù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些基團(tuán)對(duì)氨基和羥基的選擇性差，副產(chǎn)物多，保護(hù)效率低。而最終采用圖1中的合成路線，不需要保護(hù)5′ 羥基和游離的氨基，能特異性修飾2′和3′羥基位點(diǎn)，并且產(chǎn)率較高。

此外，在糖環(huán)2′和3′羥基共成環(huán)的合成條件選擇上,即從化合物4制備5a～5f的過程中,為了提高反應(yīng)效率，以5a為例，針對(duì)合成條件進(jìn)行了篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無氮?dú)獗Ｗo(hù)反應(yīng)12、24、36 h，產(chǎn)率分別為33.3%、25.5%、18.7%。進(jìn)一步控制反應(yīng)時(shí)間并嘗試氮?dú)獗Ｗo(hù)條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氮?dú)獗Ｗo(hù)有利于提高反應(yīng)收率，這可能是因?yàn)闇p少了醛基在反應(yīng)過程中的氧化副產(chǎn)物。此外，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，不同反應(yīng)時(shí)長也顯示了不同的產(chǎn)率，反應(yīng)12、24、36 h時(shí)，產(chǎn)率分別為45.6%、80.2%、67.3%。最終，化合物5a的反應(yīng)條件選擇使用氮?dú)獗Ｗo(hù)，反應(yīng)24 h。

3.2抗腫瘤細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)分析 實(shí)驗(yàn)采用MCF-7腫瘤細(xì)胞的體外抗增殖模型，測(cè)試了化合物的抗腫瘤活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物4、5a、5b、5c、5d、5e、5f、6a、6b、6c和6d對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50分別為0.52、0.17、0.40、7.13、0.45、0.14、2.6、2.6、481.34、152.84、62.17。2′、3′羥基取代成環(huán)的化合物(5a～5f)活性普遍強(qiáng)于糖環(huán)羥基全酯化取代的化合物(6a～6d)，說明糖環(huán)5′羥基對(duì)抗腫瘤活性具有重要作用，可能與參與體內(nèi)的磷酸化進(jìn)程有關(guān)，不宜進(jìn)行取代性修飾。

化合物5a和5e對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50分別為0.17、0.14 mmol·L-1，優(yōu)于陽性對(duì)照(腺苷，化合物4)，化合物5bIC50為0.40 mmol·L-1，與陽性對(duì)照相當(dāng)。初步的構(gòu)效關(guān)系提示：(1)引入的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，苯環(huán)間位甲基取代化合物(5b，IC50=0.40 mmol·L-1)抗腫瘤活性顯著優(yōu)于對(duì)位(5c，IC50=7.13 mmol·L-1)。(2)芳環(huán)間位鹵素原子取代，氯原子最佳，而當(dāng)為溴原子時(shí)活性有所下降(5f，IC50=2.6 mmol·L-1)，可能是溴原子半徑較大，影響了分子與酶的活性中心的相互作用。

化合物的親水性、疏水性是一個(gè)重要的理化性質(zhì)，一般認(rèn)為油水分配系數(shù)在-2～5之內(nèi)才可能具有成藥性，油水分配系數(shù)為0～2最佳。腺苷的lgP值偏低，經(jīng)ChemDraw軟件計(jì)算為-1.17，而研究設(shè)計(jì)的10個(gè)目標(biāo)化合物的lgP值分別為0.73、1.35、1.35、1.02、1.42、2.6、-1.11、0.85、2.1、1.99，其中5a、5b、5c、5d、5e和6c的lgP值為0～2，均具有良好的親水性、疏水性。結(jié)合抗腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，目標(biāo)化合物抗腫瘤活性增強(qiáng)，可能與改善親脂性而使化合物更容易穿透細(xì)胞膜有關(guān)。研究結(jié)果提示，采用糖環(huán)2′ 和3′ 羥基共修飾策略來增加糖環(huán)上的親脂性可能是提高腺苷類似物抗腫瘤活性的有效修飾方式。

一些研究報(bào)道了不同策略對(duì)腺苷其他位點(diǎn)進(jìn)行的修飾。如Parker W B等[19]將2′ 羥基換成了F原子，保留堿基上有游離氨基和糖環(huán)上3′ 和5′ 羥基，抗腫瘤活性增強(qiáng)。如劉連等[8]去掉腺苷堿基3′ 位的N，保留游離氨基，糖環(huán)替換成其他苯環(huán)取代基，也提高了抗腫瘤效果。這些修飾策略與本研究增加親脂性的思路相互印證，提高腺苷分子親脂性是提高抗腫瘤活性的重要因素，此外，本研究的修飾策略和這些工作可補(bǔ)充結(jié)合，有助于設(shè)計(jì)更多化合物。

3.3分子對(duì)接分析 AutoDock Vina 是由Scripps實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的開源分子對(duì)接軟件，該軟件采用擬牛頓方法進(jìn)行局部優(yōu)化，打分函數(shù)結(jié)合了基于經(jīng)驗(yàn)打分和知識(shí)打分函數(shù)的優(yōu)點(diǎn)，通過計(jì)算受體-配體復(fù)合物的空間效果、排斥作用、氫鍵、疏水相互作用以及分子的靈活性等值綜合打分，評(píng)估其親和力，作為衡量配體是否能與受體分子有效結(jié)合的重要指標(biāo)[20-21]。

以從PDB數(shù)據(jù)庫獲得的AMPK蛋白(PDB Code：4CFF)[20]為受體，將活性最好的化合物5e與AMPK受體蛋白進(jìn)行分子對(duì)接分析，對(duì)接區(qū)域限定為F鏈中的結(jié)合口袋區(qū)，見圖2。結(jié)果顯示，5e與受體的結(jié)合能為-8.6 kcal·mol-1，高于陽性對(duì)照(化合物4，結(jié)合能為-6.3 kcal·mol-1)，提示其較陽性對(duì)照，與靶蛋白相互作用更強(qiáng)。

進(jìn)一步對(duì)5e最優(yōu)構(gòu)象與受體蛋白的結(jié)合模式進(jìn)行了相互作用分析。由圖2A可知，氨基酸殘基Val96、Ser97與5e配體小分子糖環(huán)部位形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Asn144、Glu143、Val24與5e配體小分子堿基部位形成氫鍵相互作用。由圖2B可知，氨基酸殘基Ala156、Met93作用與5e中2′ 和3′ 羥基共成環(huán)引入的苯環(huán)取代基形成疏水相互作用，這些作用共同促使了化合物5e與AMPK受體蛋白更好的結(jié)合。

圖2 5e與AMPK 酶的結(jié)合模式(A)以及與AMPK結(jié)合位點(diǎn)的表面形狀(B)注：圖A中藍(lán)色分子為5e，黃線為氫鍵；圖B中藍(lán)色分子為5e，紅色部分為親水區(qū)域，藍(lán)色部分為疏水區(qū)域。Fig.2 Binding pattern of 5e to AMPK enzyme(A) and surface shape of AMPK binding sites (B)Notes：in Figure A，the blue molecule is 5e，and the yellow line is hydrogen bond.In Figure B，the blue molecule is 5e，the red part is the hydrophilic region，and the blue part is the hydrophobic region.

4 結(jié)論

本文通過糖環(huán)2′和3′羥基成環(huán)以及羥基共成酯的修飾策略，合成了10個(gè)新結(jié)構(gòu)腺苷衍生物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和MS鑒定。體外抗腫瘤活性研究顯示，大多化合物顯示出了良好的抗腫瘤增殖活性，初步證實(shí)，采用糖環(huán)2′ 和3′ 羥基共取代成環(huán)策略來增加糖環(huán)上的親脂性可能是提高腺苷類似物抗腫瘤活性的有效修飾方式。其中活性最好的化合物5e對(duì)MCF-7細(xì)胞的體外抗腫瘤活性IC50為0.14 mmol·L-1，優(yōu)于陽性對(duì)照腺苷。利用分子對(duì)接技術(shù)顯示目標(biāo)化合物5e中2′ 和3′ 羥基共成環(huán)引入的苯環(huán)取代基增加了5e和AMPK的結(jié)合能。本研究可為以腺苷為母體的抗腫瘤化合物的設(shè)計(jì)和合成提供新的思路。