HPLC法測定益腦心顆粒中10種成分及化學(xué)計量的研究

王 鑫，黃美玲，張 松，任曉東，聶振興，陳明會*(.漢中市人民醫(yī)院藥劑科，漢中 7000；.漢中市鐵路中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，漢中 7000；.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，西安 7006)

益腦心顆粒由川芎、制首烏、丹參、郁金、山楂、天麻6味中藥制成，具有平肝熄風(fēng)、活血散瘀的作用，用于治療血瘀肝旺所致的眩暈頭痛等[1-3]。方中川芎有治療心血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等作用[4-5]；丹參中含丹酚酸B、原兒茶醛、丹參素等成分，有改善微循環(huán)、抗凝血等作用[6-7]；何首烏含有二苯乙烯苷類、沒食子酸等成分，具有明顯的抗衰老和保護神經(jīng)等作用[8-11]；天麻含有天麻素、巴利森苷類等成分，具有保護腦、抗暈眩、鎮(zhèn)靜催眠等作用[12-15]；山楂有明顯的抗氧化作用[16-19]；郁金有抗腫瘤、抗炎等作用[20-21]。

由于中藥成分復(fù)雜，具有通過多靶點整體協(xié)同作用的特征，故單成分質(zhì)量控制模式難以全面、科學(xué)地評價其產(chǎn)品質(zhì)量。因此，近年來已廣泛將多指標成分質(zhì)量控制模式應(yīng)用于中藥的質(zhì)量控制中[22]。現(xiàn)行該制劑質(zhì)量標準僅對原兒茶醛進行定量控制，筆者前期曾對該制劑進行了定性研究[23]，目前無對其所含多成分進行定量研究的文獻報道，為了更加全面地評價益腦心顆粒的整體質(zhì)量，本實驗采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法同時測定天麻素、丹參素鈉、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、原兒茶醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、二苯乙烯苷、丹酚酸B 10種成分的含量，建立益腦心顆粒多指標成分評價模式，并采用主成分分析(principal component analysis，PCA)、聚類分析(cluster analysis，CA)等化學(xué)計量學(xué)方法對定量結(jié)果進行分析，為提升益腦心顆粒的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 NexeraXR型島津高效液相色譜儀、SPD-M40A型二極管陣列檢測器、LC/Labsoluion色譜工作站均購自日本島津公司；KQ-100DE型臺式數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；AUW220D型十萬分之一電子分析天平(日本島津公司)；Shim-pack Scepter C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(日本島津公司)。

1.2試藥 乙腈、甲醇(色譜級，美國Honeywell公司)；水為自制超純水；其余藥品均為分析純。天麻素(批號110807-202010，質(zhì)量分數(shù)95.5%，中國食品藥品檢定研究院)；巴利森苷E(編號HP265839，質(zhì)量分數(shù)98%),巴利森苷C(編號HP8265838，質(zhì)量分數(shù)98%)，巴利森苷B(編號HP265837，質(zhì)量分數(shù)98%)，巴利森苷A(編號HP265836，質(zhì)量分數(shù)98%)，丹參素鈉(編號HS034209，質(zhì)量分數(shù)98%)，對羥基苯甲醇(編號HA062812，質(zhì)量分數(shù)98%)，原兒茶醛(編號HP019896，質(zhì)量分數(shù)98%)，二苯乙烯苷(編號HO118401，質(zhì)量分數(shù)98%)，丹酚酸B(批號HA170502，質(zhì)量分數(shù)98%)，均購自寶雞辰光生物技術(shù)有限公司；川芎(批號200604)、制何首烏(批號200921)、丹參(批號200824)、郁金(批號200726)、山楂(批號201022)、天麻(批號201108)，均購自陜西鐸耀中藥飲片有限公司；益腦心顆粒(國藥準字Z20025079，規(guī)格15 g×9袋/盒，批號010001～010015，編號S1～S15，陜西漢王藥業(yè)股份有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Shim-pack Scepter C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：0.1 g·L-1甲酸水溶液溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～8 min，96%～91% A；8～43 min，91%～68% A；43～70 min，68%～50% A)。記錄時間：70 min；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：20℃；檢測波長：220、310 nm；進樣量：10 μL。

2.2混合對照品溶液的配制 分別精密稱取巴利森苷A 6.64 mg、巴利森苷B 5.74 mg、巴利森苷C 10.73 mg、原兒茶醛 9.05 mg 置于50 mL量瓶中，加體積分數(shù)為50%的甲醇至刻度，搖勻，作為A溶液；另再分別精密稱取對照品天麻素7.32 mg、丹參素鈉12.01 mg、對羥基苯甲醇6.62 mg、巴利森苷E 7.03 mg、二苯乙烯苷6.12 mg、丹酚酸B 22.23 mg置于10 mL量瓶中，加A溶液至刻度，搖勻，即得10種成分的混合對照品溶液，作為儲備液。

2.3供試品溶液的制備 取5袋益腦心顆粒內(nèi)容物，研細，混勻，精密稱定5 g，置于具塞錐形瓶中，加入體積分數(shù)為50%的甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率100 W，頻率40 Hz)40 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用體積分數(shù)為50%的甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2.4陰性對照溶液的制備 按處方比例分別制成缺天麻、缺制首烏、缺丹參的模擬制劑，再依據(jù)2.3項下方法制備缺天麻、缺制首烏、缺丹參的陰性對照溶液。

2.5線性關(guān)系考察 分別精密量取儲備液0.01、0.04、0.20、0.40、0.08、1.00 mL，分別置于1 mL量瓶中，加體積分數(shù)為50%的甲醇定容，混勻，即得系列混合對照品溶液，進樣。以各對照品的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(x)、峰面積值為縱坐標(y)，繪制標準曲線，進行線性回歸。線性方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)(r)見表1。結(jié)果表明，10種對照品在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 對照品的線性方程與質(zhì)量濃度范圍及相關(guān)系數(shù)Tab.1 Linear equations and their concentration ranges of the reference substances

2.6專屬性實驗 分別精密量取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL進樣，記錄色譜圖。實驗結(jié)果見圖1，結(jié)果表明陰性對照無干擾，專屬性強。

圖1 HPLC圖注：A.混合對照品；B.供試品；C.天麻陰性對照；D.制何首烏陰性對照；E.丹參陰性對照；1.天麻素；2.丹參素鈉；3.對羥基苯甲醇；4.巴利森苷E；5.原兒茶醛；6.巴利森苷B；7.巴利森苷C；8.巴利森苷A；9.二苯乙烯苷；10.丹酚酸B。Fig.1 HPLC chromatogramsNotes：A.mixed reference substance；B.sample；C.sample without Gastrodiae Rhizoma；D.sample without Polygoni multiflori radix Praeparata；E.sample without Salviae miltiorrhizae radix Et Rhizoma；1.gastrodin;2.danshensu sodium;3.p-hydroxybenzyl alcohol;4.palisenoside E;5.protocatechuic aldehyde;6.palisenoside B；7.palisenoside C；8.palisenoside A；9.stilbene glycoside；10.salvianolic acid B.

2.7精密度實驗 精密吸取供試品溶液(批號010001)，重復(fù)進樣5次，計算得天麻素、丹參素鈉、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、原兒茶醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、二苯乙烯苷、丹酚酸B峰面積的RSD值分別為0.99%、0.95%、1.09%、1.04%、0.97%、0.91%、0.97%、0.91%、0.92%、0.85%，表明儀器的精密度良好。

2.8穩(wěn)定性實驗 精密吸取供試品溶液(批號010001)，在0、2、4、8、12、24 h進樣。計算得天麻素、丹參素鈉、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、原兒茶醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、二苯乙烯苷、丹酚酸B峰面積的RSD值分別為0.94%、0.91%、1.17%、1.12%、1.06%、1.21%、1.09%、1.03%、1.08%、1.11%，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9重復(fù)性實驗 精密稱取樣品(批號010001)6份，分別按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下條件測定，計算天麻素、丹參素鈉、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、原兒茶醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、二苯乙烯苷、丹酚酸B的平均含量與RSD值，結(jié)果見表2，表明該方法重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性實驗結(jié)果Tab.2 Results of repeatability test

2.10加樣回收率實驗 精密稱定益腦心顆粒(批號010001)內(nèi)容物7.5 g，置于具塞錐形瓶中，添加混合對照品溶液10 mL(分別精密稱取對照品：天麻素20.52 mg、丹參素鈉100.00 mg、對羥基苯甲醇8.16 mg、巴利森苷E 9.18 mg、原兒茶醛11.22 mg、巴利森苷B 2.55 mg、巴利森苷C 16.33 mg、巴利森苷A 7.14 mg、二苯乙烯苷61.22 mg、丹酚酸B 418.37 mg置于100 mL量瓶中加體積分數(shù)為50%的甲醇至刻度，搖勻，得混合對照品溶液，質(zhì)量濃度依次為0.196、0.980、0.080、0.090、0.110、0.025、0.160、0.070、0.600、4.100 mg·mL-1)，再按照2.3項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件測定，重復(fù)制樣6份，結(jié)果見表3，表明該方法回收率良好。

表3 加樣回收率實驗結(jié)果Tab.3 Test results of sample recovery

2.11含量測定 精密稱取15批樣品，分別按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下條件測定。天麻素、丹參素鈉、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、原兒茶醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、二苯乙烯苷、丹酚酸B的含量測定結(jié)果見圖1與表4。

表4 15批益腦心顆粒中10種成分的含量測定結(jié)果Tab.4 The results of determination of 10 components in 15 batches of Yinaoxin Granules

2.12色譜條件及制樣方法篩選結(jié)果 對以下項目進行比較：不同品牌的色譜柱，如Shim-pack Scepter C18、Phenomenex/Luna C18、Kromasil C18等，不同規(guī)格，如(150 mm×4.6 mm，5 μm)、(250 mm×4.6 mm，5 μm)、(100 mm×4.6 mm，5 μm)等；不同流動相系統(tǒng)，如甲醇-甲酸水溶液(0.05、0.1、0.15 g·L-1)、乙腈-甲酸水溶液(0、0.05、0.1、0.15 g·L-1)、 乙腈-醋酸水溶液(0.2、0.5、1.0 g·L-1)等；不同柱溫(20、25、30 ℃)；不同流速(0.6、0.8、1.0、1.2 mL·min-1)；不同溶劑(甲醇、水、不同體積分數(shù)的甲醇、不同體積分數(shù)的乙醇)；提取方法(超聲及超聲時間、加熱回流)等。最終選擇色譜柱為Shim-pack Scepter C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相系統(tǒng)為0.1 g·L-1甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫；流速為0.8 mL·min-1；柱溫為20 ℃；選擇體積分數(shù)為50%的乙醇超聲。見2.1項、2.3項及圖2～圖5。

圖2 不同品牌色譜柱HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of different brands of chromatographic columns注：A.檢測波長為220 nm；B.檢測波長為310 nm；a、d.Shim-pack Scepter C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；b、e.Phenomenex/Luna C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；c、f.Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)。1.天麻素；2.丹參素鈉；3.對羥基苯甲醇；4.巴利森苷E；5.原兒茶醛；6.巴利森苷B；7.巴利森苷C；8.巴利森苷A；9.二苯乙烯苷；10.丹酚酸B。Notes：A.the detection wavelength was 220 nm；B.the detection wavelength was 310 nm；a，d.Shim-pack Scepter C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；b，e.Phenomenex/Luna C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；c，f.Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm).1.gastrodin；2.danshensu sodium;3.p-hydroxybenzyl alcohol；4.palisenoside E；5.protocatechuic aldehyde；6.palisenoside B；7.palisenoside C；8.palisenoside A；9.stilbene glycoside；10.salvianolic acid B.

圖3 不同規(guī)格色譜柱HPLC圖(220 nm)注：A.250 mm×4.6 mm，5 μm；B.150 mm×4.6 mm，5 μm；C.100 mm×4.6 mm，5 μm；1.天麻素；2.丹參素鈉；3.對羥基苯甲醇；4.巴利森苷E；5.原兒茶醛；6.巴利森苷B；7.巴利森苷C；8.巴利森苷A；9.二苯乙烯苷；10.丹酚酸B。Fig.3 HPLC chromatograms of different specifications of chromatographic columns (220 nm)Notes：A.250 mm×4.6 mm，5 μm；B.150 mm×4.6 mm，5 μm；C.100 mm×4.6 mm，5 μm；1.gastrodin；2.danshensu sodium;3.p-hydroxybenzyl alcohol；4.palisenoside E；5.protocatechuic aldehyde；6.palisenoside B；7.palisenoside C；8.palisenoside A；9.stilbene glycoside；10.salvianolic acid B.

圖4 不同流動相與不同柱溫HPLC圖(220 nm)

圖5 不同流速、樣品不同處理方法與不同超聲時間HPLC圖注：A.不同流速；B.樣品不同處理方法；C.不同超聲時間；s1.流速為0.6 mL·min-1；s2.流速為0.8 mL·min-1；s3.流速為1.0 mL·min-1；s4.流速為1.2 mL·min-1；t1.樣品處理溶劑為甲醇超聲40 min；t2.樣品處理溶劑為水超聲40 min；t3.樣品處理溶劑為體積分數(shù)50%甲醇，超聲40 min；t4.樣品處理溶劑為體積分數(shù)50%乙醇，加熱回流40 min；u1.樣品處理溶劑為體積分數(shù)50%乙醇，加熱回流30 min；u2.樣品處理溶劑為體積分數(shù)50%乙醇，超聲60 min。Fig.5 HPLC chromatograms of different flow rates，different sample treatment methods and different ultrasonic timesNotes：A.different flow rates；B.different treatment methods of samples；C.different ultrasonic time；s1.the flow rate was 0.6 mL·min-1；s2.the flow rate was 0.8 mL·min-1；s3.the flow rate was 1.0 mL·min-1；s4.the flow rate was 1.2 mL·min-1；t1.the sample treatment solvent was methanol，ultrasonic for 40 min;t2.the sample treatment solvent was water ultrasonic for 40 min；t3.the sample treatment solvent was 50% methanol，ultrasonic for 40 min；t4.the sample treatment solvent was 50% ethanol，heated and refluxed for 40 min；u1.sample treatment solvent was 50% ethanol，heated and refluxed for 30 min；u2.sample was treated with 50% ethanol for 60 min.

2.13化學(xué)計量研究

2.13.1聚類分析 運用SPSS 26.0軟件，以15批益腦心顆粒中10種活性成分的含量為數(shù)據(jù)樣本，采用組間聯(lián)接法，以歐氏距離為測度[24-25]，進行系統(tǒng)CA，結(jié)果見圖6。依據(jù)聚類分析樹狀圖，當類間距離為6時，15批樣品可聚為4類，S3、S13、S8、S6、S5、S15、S7、S9、S10為第Ⅰ類，S1、S11為第Ⅱ類，S2、S12為第Ⅲ類，S4、S14為第Ⅳ類；當類間距離為10時，15批樣品可聚為3類，上述第Ⅰ、Ⅱ類聚為一類，第Ⅲ類聚為一類；第Ⅳ類聚為一類。當類間距離為15時，15批樣品可聚為2類，上述第Ⅰ、Ⅱ類聚為一類，第Ⅲ、Ⅳ類聚為一類；第Ⅳ類聚為一類。

圖6 15批益腦心顆粒聚類分析樹狀圖Fig.6 CA tree diagram of 15 batches of Yinaoxin Granules

2.13.2主成分分析 將15批益腦心顆粒中10種成分的含量導(dǎo)入統(tǒng)計軟件SPSS 26.0 中，進行PCA，計算相關(guān)系數(shù)的特征值和方差貢獻率[24-25]，提取出4種主成分，結(jié)果見圖7和表5。由表5可知，前4種主成分特征值大于1，即3.244、2.518、1.757、1.270，對方差的貢獻率分別為32.439%、25.176%、17.568%、12.698%，累計方差貢獻率為87.881%，大于85%，表明提取前4種主成分即可代表益腦心顆粒10種共有成分87.881%的信息，可以被用于評價益腦心顆粒的質(zhì)量。

圖7 樣品PCA碎石圖Fig.7 PCA scree plot of various samples

表5 主成分方差分析Tab.5 Analysis of variance for PCA

以y1、y2、y3、y4表示表6種4種主成分1、2、3、4作為15批次益腦心顆粒所含10種成分的信息并建立線性方程。

表6 初始因子載荷矩陣Tab.6 Initial factor load matrix

y1=0.531x1+0.483x2-0.46x3-0.453x4+0.167x5-0.021x6+0.121x7+0.087x8+0.079x9-0.056x10；y2=0.023x1+0.127x2-0.025x3+282x4+0.553x5+0.461x6-0.387x7+0.175x8-0.331x9-0.309x10；y3=-0.001x1+0.129x2+0.234x3+0.033x4-0.177x5+0.269x6-0.073x7+0.684x8+0.592x9-0.006x10；y4=-0.023x1-0.32x2-0.339x3-0.138x4+0.121x5+0.339x6-0.258x7+0.005x8+0.062x9+0.75x10。式中各變量為標準化變量。將線性方程與所對應(yīng)主成分的方差貢獻率相乘后再除以累計貢獻率可計算綜合得分，計算綜合得分的方程為y=(32.439y1+25.176y2+17.568y3+12.698y4)/87.881。根據(jù)此方程計算得出的綜合得分與排序見表7。綜合得分越高，表明該批次樣品的質(zhì)量越好。由表7可見，010010批次的質(zhì)量最優(yōu)，其次是010009批次和010006批次，排在最后是010001批次和010011批次。

表7 15批益腦心顆粒的綜合得分Tab.7 Comprehensive score of 15 samples Yinaoxin Granules

3 分析與討論

3.1檢測方法的選擇 使用二極管陣列檢測器對益腦心顆粒樣品進行全波長掃描，結(jié)果顯示各成分的最大吸收波長：天麻素為220、270 nm，丹參素鈉為199、301 nm，對羥基苯甲醇為223、274 nm，原兒茶醛為277、312 nm，巴森利甘A、B、C、E均為220、270 nm，二苯乙烯苷為235、310 nm，丹酚酸B為288、309 nm。因此，將220 nm作為天麻素、對羥基苯甲醇及巴森利甘A、B、C、E的檢測波長，將310 nm作為丹參素鈉、原兒茶醛、二苯乙烯苷、丹酚酸B的檢測波長。采用梯度洗脫，選擇不同品牌的色譜柱，如Shim-pack Scepter C18、Phenomenex/Luna C18、Kromasil C18等進行比較，選擇不同規(guī)格的色譜柱，如(150 mm×4.6 mm，5 μm)，(250 mm×4.6 mm，5 μm)、(100 mm×4.6 mm，5 μm)等進行比較，選擇不同流動相系統(tǒng)，如甲醇-甲酸水溶液(0.05、0.1、0.15 g·L-1)，乙腈-甲酸水溶液(0、0.05、0.1、0.15 g·L-1)，乙腈-醋酸水溶液(0.2、0.5、1.0 g·L-1)等，選擇不同柱溫(20、25、30 ℃)，不同流速(0.6、0.8、1.0、1.2 mL·min-1)進行比較。最終確定檢測色譜條件：色譜柱Shim-pack Scepter C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相系統(tǒng)乙腈-0.1 g·L-1甲酸水溶液；柱溫20 ℃；流速0.8 mL·min-1，在該條件下目標峰分離度良好。因為天麻含有天麻素、對羥基苯甲醇及巴森利甘A、B、C、E等成分，所以制備陰性對照時需要剔除天麻；二苯乙烯苷僅在制首烏中存在，制備陰性對照時需要去除制首烏；丹參中含有丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B，故制備陰性對照時需要去除丹參。益腦心顆粒中天麻為生藥粉入藥，對溶劑(甲醇、水、不同體積分數(shù)的甲醇、不同體積分數(shù)的乙醇)及提取方法(超聲及超聲時間、加熱回流)等進行比較，結(jié)果選擇體積分數(shù)為50%的乙醇超聲40 min提取，得到較理想的目標峰信息。

3.2化學(xué)計量學(xué)研究 CA結(jié)果顯示聚類為兩大類，不同批次益腦心顆粒中10種成分的含量差異可能與益腦心顆粒生產(chǎn)所用原藥材的種屬來源、產(chǎn)地、采收季節(jié)、生長年限、加工炮制方式等因素有關(guān)。PCA結(jié)果顯示前4種主成分特征值大于1(分別為3.244、2.518、1.757、1.270)，對方差的貢獻率分別為32.439%、25.176%、17.568%、12.698%，累計方差貢獻率達87.881%，大于85%，表明提取前4種主成分即可代表益腦心顆粒10種共有成分87.881%的信息；綜合得分表明，編號為010010、010009和010006的樣品質(zhì)量較好。因此，2項分析可以用于評價益腦心顆粒的質(zhì)量。

總之，本實驗采用HPLC 梯度洗脫法測定了益腦心顆粒中天麻素、丹參素鈉、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、原兒茶醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、二苯乙烯苷、丹酚酸B的含量，該方法操作簡單，易于實施，準確性、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，專屬性強，并對含量測定結(jié)果進行了PCA和CA，提示藥品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)加強對原藥材源頭的質(zhì)量控制和對藥品生產(chǎn)過程參數(shù)的優(yōu)化。本研究亦為全面提升該產(chǎn)品的質(zhì)量，保證該藥品質(zhì)量與臨床療效的一致性提供科學(xué)依據(jù)。