HPLC法測定和肝利膽顆粒中7種成分的含量

王健芬，張枝雪，尹興章(保山市食品藥品檢驗檢測中心，保山 678000)

和肝利膽顆粒是以金錢草、茵陳、板藍(lán)根、枳殼(炒)、柴胡(制)、黃芩、梔子、五味子8味藥材提取制成的顆粒劑，具有清熱利濕、疏肝理氣之功效，臨床上主要用于治療急性黃疸型肝炎、慢性肝炎活動期和急慢性膽囊炎。茵陳的活性成分綠原酸具有抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫的作用；枳殼的活性成分柚皮苷和新橙皮苷具有抗炎、抗氧化[1-2]等作用；黃芩中的黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素具有抗炎[3]、抗流感病毒[4]等作用；梔子的活性成分梔子苷可調(diào)節(jié)與炎癥疾病相關(guān)的免疫細(xì)胞的功能，使促炎/抗炎細(xì)胞因子間的動態(tài)平衡得以恢復(fù)，并起到改善異常信號通路及信號通路之間相互干擾的作用。和肝利膽顆?，F(xiàn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第7冊(WS3-B-1358-93)[5]，該標(biāo)準(zhǔn)項下僅有2個化學(xué)鑒別反應(yīng)，未對其有效成分進行含量測定。此外，由云南騰藥制藥股份有限公司生產(chǎn)的和肝利膽顆粒執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ05112017，該標(biāo)準(zhǔn)項下除了增加薄層鑒別外，還增加了黃芩苷的含量測定項，用以質(zhì)量控制。中藥材的成分比較復(fù)雜，用中藥材制成的中成藥則是各種藥材的各種成分交織在一起，達到所預(yù)期的功效，同時測定中成藥中的多個成分來控制藥品質(zhì)量是一種有效的手段。本研究參考有關(guān)文獻[6-20]，建立同時測定和肝利膽顆粒中茵陳的主要成分綠原酸的含量、梔子的主要成分梔子苷的含量、枳殼的主要成分柚皮苷和新橙皮苷的含量以及黃芩的主要成分黃芩苷、漢黃芩苷和黃芩素的含量的高效液相色譜方法，為和肝利膽顆粒的質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Mettler Toledo XPE205型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；科導(dǎo)SK25 10LHC型超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；A2S-10-BE超純水機(美國艾科浦國際有限公司)；Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。

1.2試藥 綠原酸對照品(批號110753-201817，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.8%)，梔子苷對照品(批號110749-201718，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.6%)，柚皮苷對照品(批號110722-201714，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.4%)，新橙皮苷對照品(批號111857-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%)，黃芩苷對照品(批號110715-201821，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.4%)，漢黃芩苷對照品(批號112002-201702，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%)，黃芩素對照品(批號111595-201808，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.9%)，均購自中國食品藥品檢定研究院。和肝利膽顆粒：陜西東泰制藥有限公司，批號0k01 0971017；通化斯威藥業(yè)股份有限公司，批號200602；云南騰藥制藥股份有限公司，批號20200972、200583、200215。乙醇、磷酸為分析純，均購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；乙腈為色譜純(德國Merck公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性 流動相：以乙腈為流動相A，3 mL·L-1磷酸溶液為流動相B，按表1中的程序進行梯度洗脫；色譜柱：資生堂MGⅡ(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：240 nm(檢測梔子苷)、283 nm(檢測柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素)和329 nm(檢測綠原酸)；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。依次對2.2項下的對照品溶液、2.3項下的供試品溶液進行測定，記錄高效液相色譜圖，見圖1。由圖可見，在供試品色譜圖中所測定的7個色譜峰成分的分離度均大于1.5；理論塔板數(shù)按7個峰計算均不低于3 000。且在該實驗條件下，陰性對照溶液對測定無干擾，專屬性好。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2對照品溶液制備 精密稱取綠原酸對照品、梔子苷對照品、柚皮苷對照品、新橙皮苷對照品、黃芩苷對照品、漢黃芩苷對照品和黃芩素對照品各適量，用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇分別制成每1 mL含綠原酸0.388 0 mg、梔子苷0.821 4 mg、柚皮苷0.402 1 mg、新橙皮苷0.366 4 mg、黃芩苷0.738 2 mg、漢黃芩苷0.411 9 mg、黃芩素0.303 5 mg的對照品儲備液。再精密量取綠原酸對照品儲備液1 mL、梔子苷對照品儲備液1 mL、柚皮苷對照品儲備液2 mL、新橙皮苷對照品儲備液3 mL、黃芩苷對照品儲備液4 mL、漢黃芩苷對照品儲備液2 mL、黃芩素對照品儲備液1 mL置于同一20 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇至刻度，作為對照品溶液。

2.3供試品溶液制備 將和肝利膽顆粒研細(xì)，精密稱取1.5 g(無糖型取約0.5 g)，加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇50 mL，稱質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按和肝利膽顆粒處方比例及制備工藝分別配制缺茵陳、缺梔子、缺枳殼和缺黃芩的陰性樣品溶液，按上述溶液制備方法，制備陰性對照溶液。

2.4線性關(guān)系考察 精密量取2.2項下綠原酸對照品儲備液5 mL、梔子苷對照品儲備液5 mL、柚皮苷對照品儲備液10 mL、新橙皮苷對照品儲備液15 mL、漢黃芩苷對照品儲備液10 mL、黃芩素對照品儲備液5 mL，并精密稱定黃芩苷15.48 mg置于同一50 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇至刻度，作為混合對照品儲備液。依次精密吸取混合對照品儲備液1、2、4、6、8、10 mL分別置于10 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇稀釋至刻度。將上述溶液分別注入液相色譜儀，按照2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜峰的峰面積。以進樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、對照品色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)線性回歸后，結(jié)果見表2。

表2 7種成分的線性關(guān)系Tab.2 Calibration curves of the 7 components

2.5精密度實驗 精密吸取同一對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，測定峰面積。計算得綠原酸、梔子苷、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷和黃芩素的平均峰面積分別為583、623、682、1 039、5 223、1 481、1 506，RSD值分別為0.22%、0.08%、0.05%、0.11%、0.12%、0.07%、0.19%(n=6)，表明儀器精密度良好。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖注：A、B、C.對照品；D、E、F.樣品；G.缺茵陳陰性樣品；H.缺梔子陰性樣品；I.缺枳殼陰性樣品；J.缺黃芩陰性樣品；1.綠原酸；2.梔子苷；3.柚皮苷；4.新橙皮苷；5.黃芩苷；6.漢黃芩苷；7.黃芩素。Fig.1 HPLC chromatogramsNotes：A，B，C.reference substances；D，E，F(xiàn).samples；G.negative sample without Artemisia capillaris Thunb；H.negative sample without Gardeniae fructus；I.negative sample without Aurantii fructus；J.negative sample without Scutellariae radix；1.chlorogenic acid；2.geniposide；3.naringin；4.neohesperidin；5.baicalin；6.wogonoside；7.baicalein.

2.6穩(wěn)定性實驗 取2.3項下制備的供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h按照2.1項下色譜條件和方法注入液相色譜儀。計算得綠原酸、梔子苷、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷和黃芩素峰面積的平均值分別為389、517、715、824、5 285、1 093、1 337，RSD值分別為0.15%、0.23%、0.12%、0.18%、0.18%、0.19%、0.26%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性實驗 稱取供試品樣品6份，按2.3項下方法制備供試品溶液，測得綠原酸、梔子苷、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷和黃芩素的平均含量為0.420、1.115、1.380、1.426、4.886、0.995、0.876 mg·g-1，RSD值分別為0.61%、0.47%、0.80%、0.48%、0.27%、0.59%、0.56%(n=6)。

2.8回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品(批號200583)約0.75 g,共6份，分別置于錐形瓶中，精密加入綠原酸、梔子苷、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷和黃芩素適量。按2.3項下方法制備溶液，按2.1項下色譜條件測定，計算回收率。結(jié)果見表3。

表3 7種成分的回收率(n=6)Tab.3 Recovery rates of the 7 compounds (n=6)

2.9樣品含量測定 取和肝利膽顆粒適量，按2.3項下方法制備溶液，按2.1項下色譜條件測定樣品中綠原酸、梔子苷、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷和黃芩素的含量。結(jié)果見表4(其中200583批次樣品測定次數(shù)為6次，其他幾個批次樣品的測定次數(shù)為3次)。

表4 樣品含量測定結(jié)果 (mg·g-1)Tab.4 Results of content determination of various constituents (mg·g-1)

3 結(jié)果與討論

3.1檢測波長的選擇 經(jīng)紫外光譜測定，綠原酸、梔子苷、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷和黃芩素的最大吸收波長分別為329、230、283、284、278、278、270 nm。柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷的最大吸收波長比較接近，黃芩素的最大吸收波長雖然在270 nm，但其在283 nm波長處也有較大吸收且樣品無干擾，故本實驗最終選定檢測波長為283 nm測定柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷和黃芩素。綠原酸和梔子苷分別選用329、230 nm最大吸收波長作為測定波長。

3.2樣品測定結(jié)果分析 5批樣品中綠原酸、梔子苷、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷和黃芩素的含量差異略大，是因為各個生產(chǎn)廠家的生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品規(guī)格有差異。由通化斯威藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的和肝利膽顆粒為無糖型，規(guī)格為每袋8 g；由云南騰藥制藥股份有限公司生產(chǎn)的和肝利膽顆粒為有糖型，規(guī)格為每袋12 g；由陜西東泰制藥有限公司生產(chǎn)的和肝利膽顆粒也是有糖型，規(guī)格為每袋25 g。因此，在計算每克的含量時，計算結(jié)果差異略大。

綜上所述，本研究建立了測定和肝利膽顆粒中綠原酸、梔子苷、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷和黃芩素含量的高效液相色譜法，具有可操作性、穩(wěn)定性及代表性。該方法既能控制和肝利膽顆粒的質(zhì)量，又能有效監(jiān)測其安全性，為和肝利膽顆粒的安全用藥提供控制依據(jù)。