枳實(shí)飲片質(zhì)量控制方法的優(yōu)化

劉 靜，吳怡青，張 雪，趙苑伶，劉 妍，陳 揚(yáng)，李芝奇，趙崇軍，馬志強(qiáng)*(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102)

枳實(shí)為我國的大宗藥材之一，來源于蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種或甜橙(CitrussinensisOsbeck)的干燥幼果，具有破氣消積、化痰散痞的功效，主要用于治療積滯內(nèi)停、痞滿脹痛、大便不通、痰阻氣滯等癥[1]。枳實(shí)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，臨床應(yīng)用歷史悠久且廣泛，在《傷寒雜病論》中，枳實(shí)被應(yīng)用于19首經(jīng)方，占經(jīng)方總數(shù)的7.3%，其中大承氣湯、小承氣湯、四逆散、麻子仁丸、枳實(shí)芍藥散、排膿散等皆為臨床常用方[2]。現(xiàn)代藥效學(xué)研究表明，枳實(shí)主要有改善腸燥便秘[3]、促進(jìn)胃腸動(dòng)力[4]、護(hù)肝[5-6]、升壓、抗休克[7]、改善心臟血流[8-9]、加快新陳代謝和脂質(zhì)代謝[10]等藥理作用，發(fā)揮這些藥理作用的有效成分為黃酮苷類和生物堿類。其中辛弗林為《中國藥典》中規(guī)定的須同時(shí)做定性鑒別和含量測定的指標(biāo)性成分[1]。以藥效作用為導(dǎo)向[11]，必須完善黃酮苷類和生物堿類成分的分析檢測體系。

能否高效地分析、檢測生物堿和黃酮苷類成分，直接決定了能否科學(xué)、客觀地評(píng)價(jià)枳實(shí)的藥材質(zhì)量，經(jīng)查閱藥典及有關(guān)枳實(shí)質(zhì)量控制的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)：①目前，已有的測定辛弗林含量的方法為，選用C18色譜柱，以甲醇-磷酸二氫鉀溶液(取磷酸二氫鉀0.6 g，十二烷基磺酸鈉1.0 g，冰醋酸1 mL，加水溶解并定容至1 000 mL)(50∶50)為流動(dòng)相，檢測波長為275 nm[1,12-15]。筆者經(jīng)過嘗試發(fā)現(xiàn)，使用該方法時(shí)由于流動(dòng)相組成較復(fù)雜，致使色譜柱和液相系統(tǒng)壓力高，有時(shí)會(huì)使實(shí)驗(yàn)中斷；使用后不易沖洗干凈，容易折損色譜柱和儀器的使用壽命；且十二烷基磺酸鈉為離子表面活性劑,會(huì)使流動(dòng)相產(chǎn)生泡沫，從而造成基線不穩(wěn)、出峰時(shí)間不穩(wěn)定、峰形差等問題。另外，該方法還有流動(dòng)相配制過程繁瑣，檢測時(shí)間較長等缺點(diǎn)。②辛弗林的薄層色譜鑒別多采用正丁醇-冰醋酸-水系統(tǒng)[1,16]、氯仿-甲醇-氨水系統(tǒng)[17-18]，但采用這2個(gè)展開系統(tǒng)時(shí)辛弗林斑點(diǎn)成點(diǎn)性不好，分離度欠佳。③此外，雖然對(duì)橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷4種黃酮苷的定量研究較為成熟[19-22]，但定性研究目前尚無報(bào)道。因此，為了能夠?yàn)橐?guī)范枳實(shí)藥材質(zhì)量提供科學(xué)、快速、簡便、直觀的檢測方法，本研究開發(fā)出了新的辛弗林定性、定量分析方法及4種黃酮苷的定性鑒別方法，新建立的方法分離度好，專屬性強(qiáng)，克服了原有方法的缺陷，彌補(bǔ)了已有方法的不足，可為枳實(shí)的質(zhì)量評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters e2695型高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；十萬分之一電子分析天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司]；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；FW100型高速萬能粉碎機(jī)(北京科偉永興儀器有限公司)；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；ZF-7型暗箱三用紫外線分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；定量毛細(xì)管、展開槽均購自華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠；硅膠G板(批號(hào)20170220，青島海洋化工廠)；聚酰胺薄板(批號(hào)2019042，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠)。

1.2試藥 橙皮苷(批號(hào)CHB180418)、新橙皮苷(批號(hào)CHB180316)、柚皮苷(批號(hào)CHB180729)、蕓香柚皮苷(批號(hào)CHB180917)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在98%以上，均購自成都克洛瑪生物科技有限公司；辛弗林(批號(hào)DSTDX002001，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%)，N-甲基酪胺鹽酸鹽(批號(hào)DSTDJ026801，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于95%)，均購自成都德思特生物科技有限公司；枳實(shí)(酸橙)對(duì)照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)120936-201606)；19批枳實(shí)飲片由北京中醫(yī)藥大學(xué)楊瑤珺教授鑒定為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的干燥幼果，來源信息詳見表1；乙腈、乙酸銨為色譜純，購自美國賽默飛世爾科技有限公司；其他試劑均為分析純。

表1 枳實(shí)飲片來源信息Tab.1 Source information of the decoction pieces of Aurantii Fructus

2 方法與結(jié)果

2.1薄層色譜鑒別

2.1.14種黃酮苷對(duì)照品和供試品溶液的制備 精密稱取橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷對(duì)照品，加入甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為1.02、1.04、1.24、1.64 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。吸取上述對(duì)照品溶液各2 μL點(diǎn)樣，吸取上述對(duì)照品溶液各1.5 μL混合點(diǎn)樣于聚酰胺薄層板上的同一點(diǎn)。

稱取枳實(shí)中粉約0.1 g，置于50 mL錐形瓶中，加入25 mL甲醇，超聲(40 kHz，500 W)處理40 min，靜置，取上清液5 μL點(diǎn)樣。

2.1.22種生物堿對(duì)照品和供試品溶液的制備 精密稱取辛弗林、N-甲基酪胺對(duì)照品，加入甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為1.17、0.75 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，各吸取2 μL點(diǎn)樣。

精密稱取枳實(shí)中粉0.2 g，加入體積分?jǐn)?shù)為30%的甲醇溶液25 mL，超聲(40 kHz，500 W)處理45 min，同法再提取1次，合并2次的過濾液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為30%的甲醇溶液定容至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液10 μL作為高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法供試品溶液。剩余藥液蒸干，加入15 mL甲醇溶解，吸取10 μL點(diǎn)樣。

2.1.3展開、顯色及檢視 依據(jù)薄層色譜(《中國藥典》2020年版通則0502)，按2.1.1項(xiàng)下方法，吸取相應(yīng)量的4種黃酮苷的對(duì)照品溶液與供試品溶液點(diǎn)于同一塊聚酰胺薄層板上，以石油醚-氯仿-丙酮-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸(1∶13∶3∶3∶2∶1.2)為展開劑，上行展開，取出晾干，噴以質(zhì)量濃度為0.1 g·mL-1的三氯化鋁乙醇溶液，在365 nm紫外光下檢視。同法，按2.1.2項(xiàng)下點(diǎn)樣量，吸取2種生物堿的對(duì)照品溶液和供試品溶液點(diǎn)于同一塊硅膠G板上，以氯仿-甲醇-丙酮-體積分?jǐn)?shù)25%的氨水-三乙胺(3∶3∶3∶0.9∶0.15)為展開劑進(jìn)行展開，取出晾干，噴質(zhì)量濃度為0.005 g·mL-1的水合茚三酮溶液，并于烘箱中105 ℃加熱至顯色。

在19批供試品的色譜中，在與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，均顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖1和圖2。

圖1 19批枳實(shí)飲片中4種黃酮苷成分薄層色譜結(jié)果注：Ⅰ～Ⅳ分別為橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷對(duì)照品；Ⅴ為混合對(duì)照品；Ⅵ為枳實(shí)對(duì)照藥材；數(shù)字1～19表示編號(hào)S1～S19的枳實(shí)飲片。Fig.1 TLC results of 4 flavonoid glycosides in 19 batches of the decoction pieces of Aurantii FructusNotes:Ⅰ-Ⅳ respectively represents hesperidin，neohesperidin,naringin,narirutin reference substances;Ⅴ as the mixed reference substances.Ⅵ as standard medicinal materials;Numbers 1-19 respectively represents the serial numbers S1-S19 the decoction pieces of Aurantii Fructus.

圖2 19批枳實(shí)飲片中辛弗林、N-甲基酪胺薄層色譜結(jié)果注：Ⅰ為混合對(duì)照品，上、下2個(gè)斑點(diǎn)分別為辛弗林、N-甲基酪胺所顯示的紫紅色斑點(diǎn)；Ⅱ?yàn)殍讓?shí)對(duì)照藥材；數(shù)字1～19表示編號(hào)為S1～S19的枳實(shí)飲片。Fig.2 TLC results of synephrine and N-methyltyramine in 19 batches of the decoction pieces of Aurantii FructusNotes:Ⅰ was mixed reference substances，the upper and lower spots were purplish red spots of synephrine and N-methyltyramine，respectively；Ⅱ was standard medicinal materials;Numbers 1-19 respectively represents serial numbers S1-S19 the decoction pieces of Aurantii Fructus.

2.1.4薄層色譜結(jié)果分析 由圖1、圖2可見，圖中斑點(diǎn)均勻，成點(diǎn)性良好，分離度好，無其他成分干擾，Rf值均在0.2～0.8范圍內(nèi)，表明本研究所開發(fā)的6種成分薄層色譜方法符合《中國藥典》的要求，可應(yīng)用于枳實(shí)飲片的定性鑒別中。由圖1可見，枳實(shí)飲片大致可分為兩類，S17、S15、S14、S11、S1枳實(shí)飲片的色譜條帶與Ⅵ枳實(shí)(酸橙)對(duì)照藥材及其余批次枳實(shí)飲片色譜條帶相比有明顯不同，且新橙皮苷、柚皮苷的斑點(diǎn)幾乎缺失，表明這些批次的枳實(shí)飲片中所含成分的種類與其他批次的藥材有差別，且新橙皮苷、柚皮苷成分含量極少或不含有。由圖2可見，各批次枳實(shí)飲片的色譜條帶相似，但由于辛弗林、N-甲基酪胺含量差異導(dǎo)致所呈現(xiàn)斑點(diǎn)的顏色深淺不一。由此表明，在枳實(shí)的定性鑒別中，4種黃酮苷的薄層色譜能夠更直觀、更清楚地反映各批次枳實(shí)飲片的差異，因此在枳實(shí)飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)中建議增加4種黃酮苷的薄層色譜鑒別項(xiàng)目；各批次枳實(shí)飲片存在較大差異反映了加強(qiáng)枳實(shí)藥材質(zhì)量管理的急迫性與必要性，提示中藥材必須在其栽培管理、采收、加工、運(yùn)輸、貯存等各個(gè)環(huán)節(jié)中保證相關(guān)信息的真實(shí)性與完整性，才能從源頭上保證藥材質(zhì)量。

2.2HPLC含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱：YMC-Pack ODS-A柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長：272 nm；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：乙腈-2 mmol·L-1乙酸銨水溶液(8.5∶91.5)等度洗脫；流速：0.8 mL·min-1；對(duì)照品溶液與供試品溶液進(jìn)樣體積各10 μL；理論塔板數(shù)按辛弗林峰計(jì)算不低于3 000。

2.2.2辛弗林對(duì)照品溶液的制備 精密稱取辛弗林對(duì)照品3.00 mg，加入體積分?jǐn)?shù)為30%的甲醇制得質(zhì)量濃度為300.00 μg·mL-1的辛弗林對(duì)照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備 詳見2.1.2。

2.2.4系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件，對(duì)照品溶液和供試品溶液均進(jìn)樣10 μL。在對(duì)照品溶液和供試品溶液的色譜圖中，辛弗林的保留時(shí)間約為4.6 min，且與其他色譜峰分離度良好，無干擾，拖尾因子符合要求。液相色譜圖見圖3。

圖3 HPLC圖注：A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；1.辛弗林。Fig.3 HPLC chromatogramsNotes:A.reference solution；B.sample solution;1.synephrine.

2.2.5線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.2項(xiàng)下的辛弗林對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為300.00 μg·mL-1)，以體積分?jǐn)?shù)30%的甲醇逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為300.00、150.00、75.00、37.50、18.75 μg·mL-1的溶液，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。以辛弗林的色譜峰面積(y)對(duì)對(duì)照品質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸。辛弗林的線性回歸方程為：y=1 985.6x-2 610.3，R2=0.999 8，表明辛弗林質(zhì)量濃度在18.75～300.00 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6重復(fù)性考察 精密稱取S19枳實(shí)中粉6份，每份0.2 g，按照2.1.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，測定辛弗林色譜峰面積，經(jīng)計(jì)算可知辛弗林的平均含量為4.64%，RSD值為2.37%，結(jié)果符合要求，說明本檢測方法的重復(fù)性良好。

2.2.7精密度考察 精密稱取S19枳實(shí)中粉0.2 g，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄辛弗林色譜峰的面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果辛弗林色譜峰面積的RSD值為0.79%，說明儀器的精密度良好。

2.2.8中間精密度考察 由本實(shí)驗(yàn)室其他2名實(shí)驗(yàn)人員按2.1.2項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，在不同時(shí)間分別選用2臺(tái)不同的高效液相色譜儀，按照2.2.1項(xiàng)下的色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定辛弗林色譜峰的峰面積，計(jì)算其RSD值。2位實(shí)驗(yàn)人員計(jì)算得辛弗林色譜峰面積的RSD值分別為0.81%、0.47%，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)方法可靠，中間精密度良好。

2.2.9穩(wěn)定性考察 選用2.2.8項(xiàng)下已制備好的供試品溶液，分別于制好后的2、4、12、24、36、48 h進(jìn)樣，進(jìn)行檢測分析，測定辛弗林色譜峰的峰面積，經(jīng)計(jì)算可知，其RSD值為0.97%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10耐用性考察 精密稱取S19枳實(shí)中粉0.2 g，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別在流速為0.795、0.80、0.85 mL·min-1，柱溫為30、35 ℃，檢測波長為270、272、275 nm等色譜條件下進(jìn)行辛弗林峰面積的測定，所得RSD值均小于1.50%。表明在略微改變色譜條件中的流速、而柱溫和檢測波長固定不變的條件下，或略微改變柱溫、流速和檢測波長保持不變的條件下，或略微改變檢測波長、流速和柱溫不變的條件下，本方法的耐用性均較好。

2.2.11準(zhǔn)確度考察 精密稱取已知含量的S14枳實(shí)飲片中粉(辛弗林含量2.23%)0.1 g，共6份，分別精密加入質(zhì)量濃度為1.115 mg·mL-1的辛弗林對(duì)照品溶液1 mL，通過揮發(fā)去除溶劑。按照2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定辛弗林色譜峰的面積，經(jīng)計(jì)算可知平均回收率為100.32%，RSD值為2.79%。

2.2.12樣品含量測定 準(zhǔn)確稱取編號(hào)為S1～S19的枳實(shí)飲片中粉，每個(gè)編號(hào)的樣品各取2份，每份約0.2 g，按照2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定辛弗林色譜峰的面積，每一供試品溶液各測定2次，計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 19批枳實(shí)飲片中辛弗林含量的測定結(jié)果Tab.2 Determination results of synephrine content in 19 batches of the decoction pieces of Aurantii Fructus

《中國藥典》2020年版一部中規(guī)定：枳實(shí)以干燥品計(jì)算，含辛弗林不得少于0.30%[1]。19批枳實(shí)飲片中辛弗林含量最低為1.82%，最高為4.71%，含量差異較大，因此建議上調(diào)辛弗林的含量標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)建立枳實(shí)飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)等級(jí)，以便對(duì)枳實(shí)飲片的等級(jí)進(jìn)行管理，從而實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)的市場規(guī)范，并確保臨床精準(zhǔn)的用藥量。在19批樣品中，江西產(chǎn)地樣品中的辛弗林含量為1.82%～4.24%；四川產(chǎn)地樣品(S4、S10)中的辛弗林含量分別為2.04%、2.65%；重慶產(chǎn)地(S2、S3、S19)樣品中的辛弗林的含量分別為3.57%、2.51%、4.71%。自近代以來，皆以江西產(chǎn)區(qū)的江枳實(shí)為道地藥材，從本研究獲得的數(shù)據(jù)來看，建議加強(qiáng)對(duì)重慶產(chǎn)枳實(shí)的研究力度，以擴(kuò)大藥源，滿足市場需求。

3 討論

3.1薄層鑒別展開系統(tǒng)的優(yōu)選 參考《中國藥典》及有關(guān)文獻(xiàn)，嘗試了正丁醇-冰醋酸-水[1,16]、氯仿-甲醇-濃氨水[17-18]等展開系統(tǒng)，根據(jù)展開效果不斷調(diào)整試劑的種類和比例，最終確定了氯仿-丙酮-甲醇-體積分?jǐn)?shù)10%的氨水-三乙胺(3∶3∶3∶0.9∶0.15)的展開系統(tǒng)，可同時(shí)定性鑒別辛弗林、N-甲基酪胺2種成分。同樣根據(jù)4種黃酮苷的極性大小，在實(shí)驗(yàn)中不斷嘗試各種試劑，仔細(xì)觀察每種試劑和比例對(duì)展開效果的影響，最終建立了石油醚-氯仿-丙酮-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸(1∶13∶3∶3∶2∶1.2)的展開條件。但由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，未能使用全自動(dòng)點(diǎn)樣儀，全部操作皆為手動(dòng)，因此不能保證點(diǎn)樣量的準(zhǔn)確性，且顯色劑噴灑均勻與否也會(huì)影響薄層板色譜圖的顯示結(jié)果。本研究所開發(fā)的2種薄層鑒別方法均通過了方法學(xué)考察，考察因素包括不同溫度、不同濕度、不同預(yù)飽和時(shí)間及不同廠家不同批次的薄層板。

3.2HPLC條件的優(yōu)化及供試品制備方法的考察 采用光電二極管陣列檢測器全波長掃描，確定辛弗林的最大吸收波長為272 nm。辛弗林分子中存在酚羥基和氨基，具有兩性性質(zhì)，因此考慮選用乙酸銨(緩沖離子對(duì)試劑)溶液作為流動(dòng)相，并進(jìn)行了濃度考察，確定了流動(dòng)相為乙腈-2 mmol·L-1乙酸銨水溶液。并采用單因素考察，以辛弗林色譜峰峰形、分離度為指標(biāo)，確定了柱溫為35 ℃、流速為0.8 mL·min-1。

供試品溶液制備中，采用單因素考察了以下因素：提取方式(加熱回流提取、超聲提取)；提取溶劑(水，甲醇，體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、80%的甲醇，乙醇，體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、80%的乙醇)；溶劑用量(25、35、45 mL)；提取時(shí)間(20、30、40 min)；提取次數(shù)(1、2、3次)。根據(jù)辛弗林的提取率確定了供試品溶液的制備方法。

3.3方法的評(píng)價(jià) 本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化枳實(shí)定性、定量研究方法的同時(shí)，將優(yōu)化后的方法應(yīng)用于3個(gè)產(chǎn)地共19批枳實(shí)飲片藥效成分的檢測中，結(jié)果表明本研究建立的方法適用性強(qiáng)，專屬性強(qiáng)，穩(wěn)定性、分離度良好，且簡便易操作。本研究建立了4種黃酮苷的定性鑒別方法，優(yōu)化了生物堿的定性、定量方法，與現(xiàn)有方法相比，能夠更全面地反映枳實(shí)質(zhì)量控制成分的信息特征，為多指標(biāo)成分評(píng)價(jià)枳實(shí)質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。