抗酸染色與PCR-熒光探針法在石蠟包埋組織結(jié)核分枝桿菌檢測的比較

吳俊峰，任淑婷

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710000）

0 引言

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的一種慢性肉芽腫性病，以肺結(jié)核病最為常見，但亦見于全身各臟器和器官，危害性極大[1]，是嚴(yán)重危害人類健康的全球性傳染病之一[2]。近年來，我國結(jié)核病的發(fā)病率持續(xù)上升，其發(fā)病率及死亡率在我國法定傳染病中居首位，是我國重點(diǎn)防治疾病之一[3]。因此，早期準(zhǔn)確診斷是結(jié)核病患者得以及時治療的關(guān)鍵，而提高診斷技術(shù)對早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者至關(guān)重要[4]。目前，醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)核分枝桿菌的方法既有傳統(tǒng)的抗酸染色、細(xì)菌培養(yǎng)等技術(shù)，又有免疫學(xué)診斷技術(shù)和各種PCR的衍生技術(shù)[5]。本次實(shí)驗(yàn)采用抗酸染色與PCR-熒光探針法同時檢測經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋組織中的結(jié)核分枝桿菌，比較兩種方法檢測結(jié)果的一致性，探討兩種方法在結(jié)核病病理診斷中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 研究資料

本組資料選自2018年1月至2019年10月西京醫(yī)院疑似結(jié)核患者，共543例，年齡1～90歲，平均（48.29±16.17）歲，其中男性231例，女性312例，檢測標(biāo)本類型包括肺組織、淋巴結(jié)、肝臟組織、腎臟組織、軟組織包塊、大網(wǎng)膜、胰腺、胸腹膜、子宮、關(guān)節(jié)滑膜、椎間盤、胸椎及腰椎、前列腺組織、附睪等，所有組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，3μm切片，HE染色、抗酸染色及PCR-熒光探針法檢測。

1.2 試劑與方法

1.2.1 抗酸染色試劑與方法

抗酸染色試劑盒購于珠海貝索生物技術(shù)有限公司，采用Ziehl-Neelsen法,操作步驟如下：①切片經(jīng)脫蠟后滴加石碳酸復(fù)紅溶液，微火加熱5～10min，重復(fù)滴加并加熱；②冷后水洗，濾紙吸干水分；③滴加酸性酒精溶液脫色1～2min；④水洗后加亞甲基藍(lán)溶液20～30s；⑤水洗，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.2.2 PCR-熒光探針法試劑與方法

PCR-熒光探針法試劑盒購于湖南圣湘生物科技有限公司，操作步驟如下：①取出試劑盒中的各組分，室溫放置，待其溫度平衡至室溫，混勻后備用；②根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照和陽性參照品A、B、C、D，按比例取相應(yīng)量的反應(yīng)液、酶混合液，充分混勻成PCR混合液，瞬時離心后備用；③在樣本中加入2～3倍體積的4%NaOH溶液，震蕩混勻后靜置液化30min。取液化后的樣本500μL于1.5mL離心管，12000r/min，離心3min，吸除上清；加入1mL無菌生理鹽水重懸沉淀，12000r/min，離心3min，吸除上清；加入50μL核酸釋放劑，100℃處理10min，12000r/min，離心3min，上清作為待測樣本備用；④每個PCR反應(yīng)管中依次加入待測樣本、陰性對照、陽性對照和陽性參照品各5μL；⑤每管加入PCR混合液40μL，蓋上管蓋，2000r/min離心30s；⑥將PCR反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀樣品槽，按對應(yīng)順序設(shè)置陰性對照、陽性對照、陽性參照品及未知樣本，并設(shè)置樣本名稱；⑦選擇熒光檢測通道，50℃UNG酶反應(yīng)2min，94℃Taq酶活化5min，94℃變性15s 45次，57℃退火，延伸及熒光采集30min 45次，25℃儀器冷卻10min。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，組內(nèi)比較采用行×列表資料的χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗酸染色陽性結(jié)果

結(jié)核分枝桿菌為長1.3～3.5μm，寬0.3～0.5μm桿菌，可有彎曲，沒有鞭毛和芽孢，鏡下抗酸菌或呈成群桿菌，或呈小點(diǎn)狀（退變時），菌量少時可見每2～3個細(xì)菌連成“V”、“Y”、“T”等形狀的特有集結(jié)，呈鮮紅色，其他細(xì)菌及細(xì)胞呈藍(lán)色（圖1）。

圖1 抗酸染色陽性結(jié)果圖

2.2 抗酸染色與PCR-熒光探針法染色結(jié)果（表1）

2.3 抗酸染色與PCR-熒光探針法結(jié)果的比較

在543例疑似結(jié)核患者病例中，抗酸染色與PCR-熒光探針法同為陽性者53例，同為陰性者327例，抗酸染色陰性，PCR-熒光探針法陽性者158例，抗酸染色陽性，PCR-熒光探針法陰性者5例，兩種方法符合率為69.98%，抗酸染色陽性檢出率為10.68%，PCR-熒光探針法陽性檢出率為38.86%，差異有顯著性（P<0.001,見表2）。

2.3.1 抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同性別MTB陽性率比較

抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同性別MTB的陽性檢出率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.001，見表3）且PCR-熒光探針法在不同性別患者的MTB陽性檢出率均高于抗酸染色法。

2.3.2 抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同年齡MTB陽性率比較

抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同年齡MTB的陽性檢出率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05，見表4）且PCR-熒光探針法在不同年齡患者的MTB陽性檢出率均高于抗酸染色法。

2.3.3 抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同組織來源MTB陽性率比較

除胸壁、胸膜、腹膜及肝組織外，抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同組織來源MTB的陽性檢出率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05，見表5）且PCR-熒光探針法在不同組織來源患者的MTB陽性檢出率均高于抗酸染色法。

2.4 187例明確臨床診斷結(jié)果中兩種方法Youden指數(shù)的比較

見表6、表7。

表1 抗酸染色與PCR-熒光探針法染色結(jié)果

表2 抗酸染色法與PCR-熒光探針法檢測結(jié)果的比較

表3 兩種方法檢測不同性別MTB陽性率比較[n(%)]

表4 兩種方法檢測不同年齡MTB陽性率比較[n(%)]

表5 兩種方法檢測不同組織來源MTB陽性率比較[n(%)]

表6 抗酸染色法的Youden指數(shù)

表7 PCR-熒光探針法的Youden指數(shù)

3 討論

結(jié)核病病理形態(tài)學(xué)主要表現(xiàn)為壞死性肉芽腫性炎，中央為干酪樣壞死，外圍由類上皮細(xì)胞、朗格漢斯巨細(xì)胞、反應(yīng)性增生纖維母細(xì)胞及淋巴細(xì)胞構(gòu)成[6]，但在實(shí)際工作中，結(jié)核病的病理變化既有典型的病變，也常出現(xiàn)不典型的病變，給結(jié)核病的診斷造成困難，因此，找到病灶組織中結(jié)核分枝桿菌成為病理學(xué)診斷的重要依據(jù)[7]。

抗酸染色是檢測結(jié)核分枝桿菌的傳統(tǒng)方法，可用于痰涂片和組織切片染色，其方法簡單、成本低、特異性高，但是靈敏度低，易造成假陰性[8]。PCR法是根據(jù)DNA復(fù)制原理而設(shè)計的體外DNA或RNA擴(kuò)增方法,優(yōu)點(diǎn)是具有高度的敏感性和特異性，且操作較簡單，已成為結(jié)核診斷的最佳檢測方法[9]。本實(shí)驗(yàn)對來自西京醫(yī)院的543例疑似結(jié)核患者同時進(jìn)行抗酸染色和PCR-熒光探針法檢測，比較兩種方法的陽性檢出率及符合率。結(jié)果顯示：抗酸染色法陽性檢出率為10.68%（58/543），PCR-熒光探針法陽性檢出率為38.86%（211/543），兩者符合率為69.98%，其中抗酸染色法陽性而PCR-熒光探針法陰性者有5例，分析其原因可能為：①抗酸染色法不僅使結(jié)核分枝桿菌呈陽性，非結(jié)核分枝桿菌如麻風(fēng)桿菌也會呈陽性；②若樣本含菌量極少，經(jīng)修片、切片后抗酸染色切片內(nèi)含少量菌，PCR組織內(nèi)可能會不含菌?？顾崛旧幮远鳳CR-熒光探針法陽性者158例，分析其原因可能為：①結(jié)核分枝桿菌較小，在鏡下觀察有一定的難度，具有觀察者的主觀差異，尤其是活檢小標(biāo)本菌量少的易漏診[10]；②若取材組織來自壞死灶中心特別是陳舊性壞死中心，而非肉芽腫內(nèi)或干酪樣壞死灶周圍，常因中心缺氧，不利于細(xì)菌生長，難以查見；③結(jié)核分枝桿菌在較陳舊或經(jīng)過治療的病灶內(nèi)可見短桿、顆粒及彎桿狀的變異形態(tài)，易誤診。

本文還比較了不同性別及年齡對抗酸染色和PCR-熒光探針法檢出率的影響，結(jié)果顯示：不同性別及年齡對抗酸染色和PCR-熒光探針法結(jié)果無明顯影響；同時，本文還對來自不同性別、年齡及組織來源的患者標(biāo)本采用兩種方法檢測的陽性檢出率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：在不同性別及年齡的患者標(biāo)本中，PCR-熒光探針法陽性檢出率均顯著高于抗酸染色法；在不同組織來源中，除胸壁、胸膜、腹膜及肝組織外，抗酸染色與PCR-熒光探針法檢測不同組織來源MTB的陽性檢出率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義且PCR-熒光探針法陽性檢出率均顯著高于抗酸染色法。胸壁、胸膜、腹膜及肝組織等組織來源可能因標(biāo)本例數(shù)太少導(dǎo)致兩種方法的陽性檢出率無統(tǒng)計學(xué)意義。

543例疑似結(jié)核患者中已知明確臨床診斷結(jié)果者共187例，其中陽性105例，陰性82例，PCR-熒光探針法Youden指數(shù)（J=0.5245）顯著高于抗酸染色法Youden指數(shù)（J=0.2095）。

綜上所述，PCR-熒光探針法檢測石蠟包埋組織中的結(jié)核分枝桿菌，陽性檢出率顯著高于抗酸染色法，具備較高的診斷價值，可結(jié)合病理組織學(xué)特點(diǎn)為臨床提供可靠的診斷依據(jù)。