基于Ser-SELEX技術(shù)的結(jié)腸癌血清適配體的篩選及其應(yīng)用研究*

張廣鑫 王 佳 石 明 劉志偉 丁婷婷 岳金媛 李 健 栗 坤 **

（1）燕山大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，秦皇島 066000；2）燕山大學(xué)河北省納米生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，秦皇島 066000；3）燕山大學(xué)亞穩(wěn)材料制備技術(shù)與科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，秦皇島 066000）

結(jié)腸癌是一種常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤，在癌癥相關(guān)死亡的病因中排名第三［1］，全球范圍內(nèi)每年有近兩百萬(wàn)人成為確診的結(jié)腸癌患者。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)結(jié)腸癌發(fā)病率居于全國(guó)第3位，死亡率位居全國(guó)第5位，且發(fā)病率和死亡率仍在逐年上升［2］。

目前結(jié)腸癌的診斷一般依據(jù)腸鏡［3］、計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）和核磁共振（NMR）等檢查手段。在早期癥狀較輕時(shí)，腸鏡檢查必要性較低，故結(jié)腸癌很難早期發(fā)現(xiàn)，即使診斷出結(jié)腸癌并及時(shí)進(jìn)行手術(shù)，癌細(xì)胞也有比較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)［2-4］。不僅如此，結(jié)腸癌早期，癥狀較輕不易引起注意。因此，如何有效早期確診，在普通查體中快速預(yù)警是否存在腫瘤狀況，成為了當(dāng)下著重研究的熱點(diǎn)問(wèn)題［5］。

適配體全稱(chēng)為核酸適配體，本質(zhì)是體外合成的寡核苷酸片段，因其能與相應(yīng)的配體分子進(jìn)行高親和力強(qiáng)特異性的結(jié)合而得名“適配體”［6］。它是一種近年來(lái)新興發(fā)展的化學(xué)抗體，相對(duì)抗體而言，具備很多優(yōu)點(diǎn)：其三維構(gòu)型多變，易形成螺旋、發(fā)夾、莖環(huán)和假結(jié)等結(jié)構(gòu)［7-8］，具有極高的生物相容性，可以與多種活性物質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，反應(yīng)快速、反應(yīng)過(guò)程靈敏且具有較強(qiáng)親和力［9］，易于體外合成，成本較低［10］；同時(shí)，適配體可匹配的靶標(biāo)分子范圍廣泛，包括動(dòng)植物細(xì)胞、單一蛋白質(zhì)、病毒和維生素等［11］；作為檢測(cè)工具有著較多優(yōu)點(diǎn)［12］，作為診斷試劑和治療試劑，追蹤siRNA、抗癌藥物甚至藥物蛋白［13］，可以提供更精準(zhǔn)的治療效果［14］，而抗體作為藥物傳遞系統(tǒng)的可行度非常復(fù)雜，在靶向治療中選擇使用適配體作為引導(dǎo)分子，則有助于避開(kāi)這些缺陷［15］，適配體的遞送系統(tǒng)能夠執(zhí)行更有選擇性的決策并實(shí)現(xiàn)更精確的治療效果［16］。

除此之外，適配體對(duì)于生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)有一定的幫助，比如新的特異性腫瘤標(biāo)志物［17］，有助于疾病的早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療［18］。生物標(biāo)志物還可用于定向給藥及標(biāo)記成像等，在醫(yī)學(xué)研究檢測(cè)方向十分必要，也有極大的前景［19］。在當(dāng)前研究階段，適配體可以更靈敏地根據(jù)靶標(biāo)細(xì)胞表面膜蛋白微量的差異，將靶標(biāo)細(xì)胞與正常細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)，因此適配體作用于新型生物標(biāo)志物研究有著巨大的潛力［20］。

血清篩選是以人血清中含有的蛋白質(zhì)為靶標(biāo)，基于血清體系進(jìn)行篩選，由于血清中具有非常豐富的蛋白質(zhì)信息，因此將不同疾病中含量異常的蛋白質(zhì)作為靶標(biāo)，利用血清篩選分離出相應(yīng)的適配體［21-22］。血清篩選具有非常多的優(yōu)點(diǎn)，但在許多疾病初期，血清中大量的免疫分子、免疫蛋白過(guò)量分泌［23］，會(huì)對(duì)血清中低豐度蛋白的篩選造成較大影響。如何在血清環(huán)境下，對(duì)部分高豐度蛋白進(jìn)行簡(jiǎn)單分離成為血清篩選前期的技術(shù)問(wèn)題，相比于單一蛋白質(zhì)的篩選，血清靶標(biāo)的篩選結(jié)果充滿(mǎn)可能，對(duì)未知的標(biāo)志物分子進(jìn)行釣取和后續(xù)蛋白質(zhì)的分析［24］，有助于推動(dòng)疾病研究在分子基礎(chǔ)上的發(fā)展，對(duì)疾病的診斷和治療有著重要的作用。

本研究以結(jié)腸癌血清為正篩靶標(biāo)、健康查體血清和其他癌癥血清為反篩靶標(biāo)，利用血清篩選技術(shù)（Ser-SELEX），篩選了可以特異性結(jié)合結(jié)腸癌血清的適配體，為結(jié)腸癌早期診斷提供識(shí)別工具和新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

本研究所使用的初始文庫(kù)是長(zhǎng)度為88個(gè)堿基的寡核苷酸片段，該片段由兩端各自固定12個(gè)堿基序列的和中間部分40個(gè)隨機(jī)的堿基序列構(gòu)成。試驗(yàn)所用PCR體系中的引物（P7/P11）為24 nt長(zhǎng)度的序列，用于制備次級(jí)庫(kù)的體系則使用帶標(biāo)記的下游引物P11-Bio，所用序列見(jiàn)表 1，由生工生物工程（Sangon Biotech）公司合成寄送。

Table 1 The primer and library sequences used in screening

本研究中所用到的人體血清均由秦皇島市第一醫(yī)院收集，以健康查體、首次診斷結(jié)腸癌、首次診斷肺癌、首次診斷乳腺癌和首次診斷直腸癌五類(lèi)人群分類(lèi)，瓊脂糖磁珠為本實(shí)驗(yàn)室制備。

實(shí)時(shí)定量PCR（美國(guó)Bio-rad集團(tuán)）、電泳儀（北京六一儀器廠(chǎng)）、多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices集團(tuán)）、J-1500圓二色譜儀（日本JASCO公司）、旋渦混勻器（德國(guó)IKA集團(tuán)）、凝膠成像系統(tǒng)（南京世研設(shè)備公司）。

1.2 材料準(zhǔn)備

血清準(zhǔn)備：將健康查體和癌癥病人的抗凝血血液，在4℃、3 000 r/min條件下離心10 min，棄去油脂沉淀，取上清于37℃孵育15 min，在15 000g、4℃條件下離心30 min，重復(fù)2次后，渦旋混勻震蕩器混勻約20 s，-20℃保存，使用時(shí)以血清∶乙腈∶水=2∶1∶4體積比混合，將乙腈和DEPC水混勻后加入血清，渦旋混勻震蕩器混勻約20 s，室溫水浴超聲5 min，在15 000g、4℃條件下離心15 min，吸取上清待用。

瓊脂糖磁珠活化：稱(chēng)取100 μl磁珠，每次以1 ml 0.025 mol/L 2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES）洗滌3次，加入300 μl 50 g/L的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和300 μl 50 g/L N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），室溫反應(yīng)30 min，得到活化后的羧基磁珠。

1.3 Ser-SELEX篩選適配體

篩選流程如圖1所示，首先活化的磁珠結(jié)合反篩血清中蛋白質(zhì)，封閉磁珠，篩選初始文庫(kù)適配體，取上清，再取新的磁珠結(jié)合正篩血清蛋白，封閉磁珠，篩選反篩上清中適配體，洗脫磁珠結(jié)合的適配體，經(jīng)過(guò)擴(kuò)增制單連，制備次級(jí)庫(kù)進(jìn)行下一輪篩選，通過(guò)前期結(jié)腸癌血清正篩-正常人血清反篩步驟和后期結(jié)腸癌血清正篩-其他癌癥血清反篩步驟循環(huán)的方式，經(jīng)過(guò)16輪的篩選流程，得到高特異性的適配體，首先是正篩，取400 μl離心后的結(jié)腸癌血清上清，與活化后的磁珠孵育45 min（血清濃度和孵育時(shí)間逐輪遞減），棄去血清孵育液，磷酸緩沖鹽溶液PBS清洗磁珠，加入1 ml封閉液（0.4 g蔗糖，0.05 g牛血清白蛋白，0.05 g酪蛋白溶于40 ml PBS中），繼續(xù)孵育30 min，減少磁珠對(duì)適配體的非特異性吸附。將封閉好的磁珠與初始文庫(kù)/次級(jí)庫(kù)孵育30 min。磁珠變性：棄去未結(jié)合上清，加入500 μl DEPC水，金屬浴95℃ 5 min，冰浴5 min。取上清，為該輪正篩模板，將模板PCR擴(kuò)增，一輪篩選完成后，使用鏈霉親和素磁珠法將制得的正篩模板制備成單鏈ssDNA，將鏈霉親和素凍干粉末在15 000g，4℃離心10 min，水溶成50 g/L，混勻后取10 μl與150 μl磁珠37℃旋轉(zhuǎn)孵育30 min，然后將正篩模板用P11-Bio下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在平臺(tái)期停止擴(kuò)增，得到生物素標(biāo)記的雙鏈，PBS清洗鏈霉親和素-磁珠復(fù)合物，加入PCR擴(kuò)增雙鏈孵育30 min，PBS清洗，加入5%甲酰胺溶液，40℃水浴5 min，清洗后向管內(nèi)加入300 μl 0.1 mol/L NaOH溶液，95℃ 5 min，冰浴5 min變性，調(diào)節(jié)pH至中性，獲得次級(jí)庫(kù)，即為下一輪文庫(kù)。每一輪的篩選均需經(jīng)過(guò)正篩-制庫(kù)-反篩3個(gè)步驟，以此往復(fù)循環(huán)，增加篩選壓力，提升清洗力度，通過(guò)不斷的正向富集和反向消除，獲得表現(xiàn)更優(yōu)異的適配體；以正常人血清做為反篩靶標(biāo)，共進(jìn)行7輪篩選，再以肺癌、乳腺癌、直腸癌血清作為反篩靶標(biāo)分別進(jìn)行3輪篩選。

Fig.1 Screening process

1.4 適配體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

將前期以健康查體血清為反篩的篩選終點(diǎn)和后期以非目標(biāo)癌癥血清為反篩的篩選終點(diǎn)的兩輪陽(yáng)性模板進(jìn)行擴(kuò)增，并將獲得的雙鏈DNA進(jìn)行高通量測(cè)序得到一級(jí)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行同源性分析，利用NUPACK網(wǎng)站進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，并且對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)上的莖環(huán)、發(fā)夾、螺旋和假結(jié)等結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并利用3dRNA/DNAWeb Server對(duì)適配體的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬。

1.5 適配體特異性和親和力的表征

利用qPCR進(jìn)行了適配體的親和力測(cè)定，將準(zhǔn)備好的結(jié)腸癌血清與瓊脂糖磁珠偶聯(lián)，充分洗滌后加入封閉液，防止適配體分子與其他結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，分別加入 0、15.63、31.25、62.5、125和250 nmol/L濃度的適配體溶液，37℃條件下使適配體與目標(biāo)分子結(jié)合；棄去過(guò)量適配體，分別取3 μl上清和17 μl PCR擴(kuò)增體系于37℃條件下將模板加入PCR管，95℃預(yù)變性1 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)，記錄擴(kuò)增后每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值，利用GraphPad Prism 8.0軟件分別計(jì)算出候選適配體APT-1、APT-2、APT-3和APT-4的親和力常數(shù)，即Kd值。

采用qPCR法特異性驗(yàn)證（圖2），將200 μl活化的磁珠與150 μl結(jié)腸癌患者血清和健康查體血清分別孵育結(jié)合后，加入等量適配體溶液，37℃恒溫旋轉(zhuǎn)孵育30 min，棄去過(guò)量適配體，加水熱變性，洗脫，qPCR法對(duì)洗脫的適配體進(jìn)行定量分析。以健康查體的血清組作為陰性對(duì)照，驗(yàn)證候選適配體與結(jié)腸癌患者血清的結(jié)合情況。

1.6 最顯著檢測(cè)結(jié)果測(cè)定

為了獲得最顯著檢測(cè)結(jié)果及患者血清檢測(cè)用量閾值，選用最優(yōu)候選適配體并設(shè)置濃度為100 nmol/L，將血清梯度稀釋并投入等量適配體，通過(guò)qPCR定量計(jì)算最低檢測(cè)限。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，比較陽(yáng)性組與陰性組數(shù)據(jù)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清中高豐度蛋白去除

本研究將40例癌癥病人的血清充分混合，消除癌癥病人血清的個(gè)體差異性，并設(shè)置每例病人血清量等量，保證個(gè)體同等性，同時(shí)將混合血清中的一些高豐度的非特異性蛋白（如白蛋白、球蛋白等）進(jìn)行去除，人類(lèi)血清原液總蛋白質(zhì)含量約為70 g/L，離心去除上層脂肪后血清總蛋白質(zhì)含量降低到約60 g/L，使用乙腈處理血清的方式將血清中高豐度蛋白含量降低，以血清∶乙腈∶水=2∶1∶4體積比混合后超聲離心，將處理后的血清進(jìn)行了蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)電泳測(cè)試，經(jīng)乙腈處理離心后的總蛋白質(zhì)含量降低至40～50 g/L，保證在乙腈的處理下，血清中原有的低豐度蛋白質(zhì)盡可能地不受到影響，而對(duì)原有的高豐度蛋白質(zhì)含量進(jìn)行削減。

2.2 篩選過(guò)程監(jiān)測(cè)

2.2.1 qPCR監(jiān)測(cè)富集程度

每一輪篩選后，需對(duì)制得的正篩以及反篩模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，確認(rèn)模板中核酸含量，以監(jiān)測(cè)適配體分子與血清蛋白結(jié)合程度，篩選后的模板量應(yīng)為隨著輪次逐漸降低，Ct值與模板量的變化相反（圖2），隨著篩選的進(jìn)行，陽(yáng)性模板量逐漸增大，陰性模板量逐漸降低，其?Ct值（Ct陰-Ct陽(yáng)）越來(lái)越小，且由初始陰性模板量大于陽(yáng)性模板量變?yōu)殛?yáng)性逐漸升高直至反超陰性模板，直至篩選結(jié)果的陰陽(yáng)性差值逐漸縮小，根據(jù)Ct值計(jì)算適配體濃度，計(jì)算結(jié)合比，即正篩模板濃度/次級(jí)庫(kù)濃度（圖3），初始幾輪篩選由于具有不穩(wěn)定性，導(dǎo)致結(jié)合比變化不規(guī)律，但同一反篩靶標(biāo)下，結(jié)合比逐漸增大，說(shuō)明適配體在富集，直至更換反篩靶標(biāo)，參考16輪結(jié)合比趨勢(shì)，及每輪陰陽(yáng)模板含量變化，適配體分子已富集，為避免PCR擴(kuò)增偏好導(dǎo)致的誤差，第7輪和第12輪模板為測(cè)序最佳選擇。

Fig.2 The change of positive and negative template content in each round

Fig.3 Combination ratio in screening process (normal screen template concentration/secondary library concentration)

2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳監(jiān)測(cè)擴(kuò)增的特異性

適配體分子在溶液中會(huì)形成穩(wěn)定且復(fù)雜的三級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致模板在擴(kuò)增過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)少量引物二聚體，進(jìn)行了瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增后模板含有少量引物二聚體，因在下一輪制次級(jí)庫(kù)擴(kuò)增單鏈時(shí)，引物二聚體無(wú)法與設(shè)定引物進(jìn)行配對(duì)進(jìn)而無(wú)法擴(kuò)增，故少量引物二聚體對(duì)后續(xù)篩選無(wú)影響。對(duì)第7、10、13和16輪制得模板DNA進(jìn)行電泳，結(jié)果顯示條帶位置位于50～100 bp之間，約為88 bp，驗(yàn)證了篩選結(jié)果的可靠性。

2.3 結(jié)構(gòu)分析

適配體的家族分析對(duì)挑選最優(yōu)適配體具有重要意義，由于前20條序列家族同源性高達(dá)90%以上，為了保證候選庫(kù)池的多樣性，選擇前100條適配體做了家族樹(shù)圖（圖4），篩選得到的前100條序列主要以右側(cè)的一個(gè)大家族和左側(cè)的許多小家族為主，這幾個(gè)家族可能具有優(yōu)勢(shì)結(jié)構(gòu)，再優(yōu)先考慮高通量測(cè)序中的重復(fù)情況、堿基分布情況和吉布斯最低自由能等條件，從右側(cè)的大家族中選擇了A1和A2兩條適配體，并在左側(cè)的小家族中選擇了A5和A54兩條適配體最為最終的候選適配體，將4條候選適配體進(jìn)行家族同源性分析（圖5），結(jié)果表明3條適配體具有較高家族同源性（不包括APT-54），APT-1、APT-2和APT-5三條適配體對(duì)結(jié)腸癌血清具有較高特異性，推測(cè)此家族中某些特殊結(jié)構(gòu)可能是結(jié)合靶標(biāo)蛋白的重要因素，且APT-1和APT-5的結(jié)果和預(yù)測(cè)結(jié)果幾乎完全相同，兩條適配體家族同源性高達(dá)97%。

Fig.4 The family tree of the first 100 aptamers

Fig.5 Homology analysis of four candidate aptamers

利用NUPACK軟件對(duì)4條候選適配體進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖6），4條適配體均具有15個(gè)堿基左右莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且APT-1、APT-2、APT-5和APT-54的吉布斯自由能分別為-5.68、-7.57、-5.88、-5.63 kcal/mol，自由能均在-5～-8 kcal/mol區(qū)間，說(shuō)明篩選的適配體序列具有較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，對(duì)4條候選適配體三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬（圖7a，c），APT-1和APT-5兩條適配體均在紅色螺旋部分有一個(gè)較大莖環(huán)，綠色部分有較小莖環(huán)，分析認(rèn)為兩個(gè)莖環(huán)中堿基附帶的磷酸基團(tuán)可能在環(huán)內(nèi)形成一個(gè)強(qiáng)負(fù)電電勢(shì)，可能是與目標(biāo)蛋白結(jié)合的主要位點(diǎn)。圖7b為APT-2模擬結(jié)果，雙螺旋為主要結(jié)構(gòu)，但其具有一個(gè)開(kāi)放的單鏈端，這種開(kāi)放的單鏈端可能由于自身體積小的因素對(duì)目標(biāo)蛋白上狹隘結(jié)構(gòu)有著一定的結(jié)合能力。APT-54上端的紫紅色結(jié)構(gòu)部分中具有一個(gè)特殊的假結(jié)結(jié)構(gòu)（圖7d），其主要螺旋部分結(jié)構(gòu)松散，結(jié)合時(shí)可能通過(guò)多種變化，如在不同pH條件下彎折形成具有特異性結(jié)構(gòu)，或在結(jié)合時(shí)解開(kāi)雙鏈形成較大莖環(huán)，以此達(dá)到對(duì)靶標(biāo)分子的作用。

2.4 親和力和特異性測(cè)定

將4個(gè)候選適配體在過(guò)量血清條件下，設(shè)置適配體濃度分別為200、100、50、25、12.5 nmol/L和無(wú)適配體添加作為對(duì)照，檢測(cè)與結(jié)腸癌患者血清的親和力，4條候選適配體均可與結(jié)腸癌患者血清結(jié)合，但親和力強(qiáng)弱略有不同。統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 8.0計(jì)算分析解離常數(shù)，4條候選適配體與結(jié)腸癌患者血清結(jié)合的Kd值分別為（4.466±0.384）、（6.122±0.615）、（5.610±0.202）及（6.964±0.181）nmol/L，均小于10 nmol/L，表明4條候選適配體對(duì)結(jié)腸癌患者血清中的目標(biāo)分子有較高親和力，其中APT-1結(jié)合能力最強(qiáng)，APT-2和APT-5結(jié)合能力次之，而適配體APT-54的結(jié)合能力較弱。

為確保特異性驗(yàn)證的準(zhǔn)確性，使用qPCR法以驗(yàn)證4條候選適配體的特異性。以16例不同結(jié)腸癌血清作為試驗(yàn)組，16例健康查體血清作為對(duì)照組，分析比較ΔCt值。結(jié)果如圖8所示：APT-1的ΔCt值小于2（圖8a），表明此適配體特異性不是很好，APT-2的ΔCt值為3～5范圍內(nèi)（圖8b），表明此適配體特異性較好，與結(jié)腸癌患者血清的結(jié)合程度較強(qiáng)，陽(yáng)性檢出率約為82.5%；APT-5和APT-54的ΔCt值小于1（圖8c，d），說(shuō)明識(shí)別結(jié)腸癌患者血清的特異性較弱。

Fig.6 Secondary structure of candidate aptamers in the NUPACK software

Fig.7 3D structural simulation of candidate aptamers

Fig.8 Specific validation of APT-1,APT-2,APT-5 and APT-54 for colon cancer serums

針對(duì)特異性較強(qiáng)的適配體APT-2，補(bǔ)充了32例其他癌癥患者血清進(jìn)一步驗(yàn)證，分析APT-2對(duì)其他癌癥的特異性（圖9），該適配體對(duì)結(jié)腸癌患者血清檢出率仍可達(dá)到80%以上，表明該適配體具有較強(qiáng)的結(jié)合結(jié)腸癌患者血清能力。分析認(rèn)為APT-2可與結(jié)腸癌患者血清中高表達(dá)的未知目標(biāo)蛋白分子進(jìn)行穩(wěn)定結(jié)合，顯示了APT-2可以穩(wěn)定檢出結(jié)腸血清的能力，分析APT-2的二級(jí)結(jié)構(gòu)可知，APT-2的主要結(jié)構(gòu)為莖環(huán)，且其自由能僅為-5.88 kcal/mol，所以其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，與特異性表征試驗(yàn)結(jié)果一致。

Fig.9 Specific validation of APT-2

2.5 最顯著檢測(cè)結(jié)果

為確定標(biāo)定qPCR法檢測(cè)時(shí)血清用量，選取不同濃度的血清和同一濃度的適配體進(jìn)行檢測(cè)（圖10）。當(dāng)結(jié)腸癌血清用量在30～200 μl時(shí)，陰陽(yáng)性模板量有顯著差別；當(dāng)血清量低于30 μl時(shí)，血清中未知的目標(biāo)蛋白含量較低，結(jié)果無(wú)顯著差異；血清用量超過(guò)200 μl時(shí)，由于瓊脂糖磁珠用量固定，陽(yáng)性血清中的目標(biāo)蛋白無(wú)法全部結(jié)合，導(dǎo)致模板量的差異無(wú)顯著變化，故最佳血清用量為30～200 μl。

Fig.10 Optimum serum dosage for testing

3 討論

本研究以瓊脂糖磁珠為載體，結(jié)腸癌患者血清為正篩樣本，健康查體、肺癌患者、直腸癌患者和乳腺癌患者血清為反篩樣本，通過(guò)正反篩交替循環(huán)的篩選步驟，建立了完整有效的Ser-SELEX技術(shù)，篩選結(jié)腸癌血清的適配體，從隨機(jī)程度較高的庫(kù)池中進(jìn)行篩選，通過(guò)逐漸增加篩選壓力，如減少正篩靶標(biāo)的孵育時(shí)間，增加反篩靶標(biāo)的孵育時(shí)間和洗脫步驟得到具有更高的親和力，性質(zhì)更穩(wěn)定的適配體序列。并通過(guò)qPCR對(duì)獲得的正篩模板進(jìn)行定量監(jiān)測(cè)，確保適配體庫(kù)池得到富集，在此過(guò)程不斷消減陰陽(yáng)性靶標(biāo)共有蛋白質(zhì)結(jié)合的適配體，使庫(kù)池中的序列具有較高特異性，在模板量監(jiān)測(cè)過(guò)程中，若出現(xiàn)篩選結(jié)果不理想，即陰陽(yáng)性模板差異沒(méi)有明顯縮小，則應(yīng)重復(fù)當(dāng)天輪次直至陰陽(yáng)性模板量差異縮小，以確保篩選每一輪的有效性。

經(jīng)過(guò)16輪篩選，獲得了具有特異性結(jié)合結(jié)腸癌患者血清蛋白的適配體庫(kù)池，對(duì)此序列池與陰陽(yáng)性靶標(biāo)結(jié)合進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)篩選得到的序列池已經(jīng)對(duì)陽(yáng)性靶標(biāo)蛋白有一定的結(jié)合能力，在陰陽(yáng)性對(duì)比時(shí)有明顯差異，對(duì)這個(gè)序列池里第7輪正篩模板和第16輪正篩模板進(jìn)行第二代測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行理論分析，通過(guò)適配體的堿基分布情況和二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)挑選出了APT-1、APT-2、APT-5和APT-54四條適配體作為最終的候選適配體，并對(duì)候選適配體進(jìn)行堿基分布情況與二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析。根據(jù)最低自由能原則分析，發(fā)現(xiàn)在模板庫(kù)池中，莖環(huán)是主要存在的結(jié)構(gòu)類(lèi)型，尤其是適配體APT-2和APT-54，其結(jié)構(gòu)以一個(gè)大莖環(huán)為主，適配體APT-1和APT-5，除莖環(huán)結(jié)構(gòu)外，在序列的一端呈現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，莖環(huán)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)可能是適配體分子識(shí)別目標(biāo)分子的特殊結(jié)構(gòu)域。

為確保適配體具有良好特異性，篩選結(jié)腸癌患者血清適配體時(shí)使用健康查體血清等作為反篩。結(jié)果表明適配體APT-1與結(jié)腸癌血清的親和力最高，而APT-54親和力較弱。通過(guò)對(duì)約60例病人血清的特異性分析，發(fā)現(xiàn)適配體APT-2能特異性識(shí)別結(jié)腸癌，陽(yáng)性檢出率約為 82.5%，Kd為（6.122±0.615）nmol/L，因此適配體APT-2為最優(yōu)適配體，且適配體APT-2對(duì)結(jié)腸癌血清的檢測(cè)范圍較廣，在30～150 μl范圍內(nèi)均有良好的差異性和穩(wěn)定的檢出率。

4 結(jié)論

本研究篩選得到一條表現(xiàn)優(yōu)異的功能性核酸適配體APT-2，該適配體可與結(jié)腸癌患者血清進(jìn)行特異性結(jié)合，并具有良好的親和力，為構(gòu)建以適配體為核心的結(jié)腸癌血清生物傳感器和結(jié)腸癌早期臨床診斷技術(shù)提供了理論依據(jù)和試驗(yàn)方法。