基于遺傳算法的計算機(jī)輔助策略優(yōu)化孕酮適配體*

唐春花 江寒冰 楊 潔 盧曉玲 陳美侖 魏 錚 劉一杰 余 鵬

（中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，長沙 410013）

孕酮（progesterone，P4）是一種天然的雌激素，與女性的月經(jīng)周期、懷孕及胎兒發(fā)育有著密切的關(guān)系［1］，然而，激素濫用導(dǎo)致的水源、食品中的P4含量過高卻會給人們帶來極大的身體危害［2］。因此，不論是在臨床治療用藥，還是在環(huán)境保護(hù)方面，對P4濃度的監(jiān)測都十分重要。常見的P4檢測方法有免疫法和色譜法，這兩種方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，但存在著價格昂貴、操作繁瑣、專業(yè)性強(qiáng)、不適于現(xiàn)場檢測等缺點［3］。核酸適配體是一段單鏈寡聚核苷酸，它可以與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合，因此可作為新型識別分子應(yīng)用于分析檢測領(lǐng)域。適配體可以通過體外選擇過程從隨機(jī)核苷酸文庫中獲得，這種方式稱為指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）［4］。考慮到初始文庫的多樣性有限，且在PCR過程中存在偏好性，可能導(dǎo)致潛在的高親和力適配體丟失，有研究者根據(jù)其篩選經(jīng)驗預(yù)估SELEX的成功率約為50%［5］。

計算機(jī)輔助優(yōu)化策略（in silicomaturation，ISM）可作為一種針對適配體篩選后優(yōu)化、改善適配體功能的方法。有研究者指出，應(yīng)用ISM對SELEX篩選后的序列進(jìn)行重篩選可在一定程度上彌補(bǔ)SELEX技術(shù)的局限性［6-7］。如模擬生物進(jìn)化算法的遺傳算法（genetic algorithm，GA），將親代適配體通過選擇、交叉和變異產(chǎn)生子代，從有希望的親本序列中進(jìn)化出改良的適配體，通過反復(fù)選擇、進(jìn)化，在經(jīng)ISM優(yōu)化后進(jìn)行體外評價。2005年，Ikebukuro等［8］首次將基于GA的ISM應(yīng)用于核酸適配體的優(yōu)化，用于抑制凝血酶的DNA適配體的重篩選。雖然ISM已經(jīng)被應(yīng)用于篩選多個靶標(biāo)的高親和力適配體且不需要重復(fù)SELEX過程［7-13］，但迄今為止，還沒有研究者嘗試使用ISM來提高適配體對P4的親和力。

P4屬于小分子化合物，已有研究指出針對小分子靶標(biāo)選擇的適配體比其他靶標(biāo)選擇的適配體親和力低［14］。篩選小分子靶標(biāo)適配體的主要挑戰(zhàn)之一是靶標(biāo)-核酸復(fù)合物和游離核酸的分離，由于靶標(biāo)的分子質(zhì)量較小，并不會導(dǎo)致游離核酸和靶標(biāo)-核酸復(fù)合物之間存在較大的質(zhì)量差異，分離過程更加復(fù)雜，這也是傳統(tǒng)SELEX技術(shù)在篩選小分子靶標(biāo)適配體時面臨的主要挑戰(zhàn)［15］。針對小分子適配體實驗篩選的困難，ISM則可作為一種有效的補(bǔ)充選擇，來改善小分子靶標(biāo)適配體的功能。

雖然ISM的核酸文庫容量比傳統(tǒng)SELEX的容量小，倘若每一個子代中的所有序列（10～50個序列）都進(jìn)行合成和評估，對于高通量篩選來說，ISM過程仍然是昂貴、繁瑣和耗時的。同時，研究人員也不可能通過確定每次傳代過程中適配體-靶標(biāo)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征，來選擇最好的親本適配體進(jìn)行傳代。在ISM中，毫無疑問以有效的、節(jié)約時間和成本的手段來識別適配體-靶標(biāo)復(fù)合物之間的相互作用對篩選高質(zhì)量核酸適配體起著非常重要的作用。而分子對接則可以作為研究適配體與靶標(biāo)結(jié)合時產(chǎn)生何種親和力以及親和力大小的一個理想的工具［16-17］。目前學(xué)界面臨的主要問題之一是在分子對接時ssDNA適配體及其靶點的研究缺乏準(zhǔn)確預(yù)測ssDNA三維結(jié)構(gòu)的工具。最近也有研究者提出了通過先預(yù)測與DNA相對應(yīng)的RNA三維結(jié)構(gòu)，再將其轉(zhuǎn)換為DNA的方法來預(yù)測ssDNA的三維結(jié)構(gòu)［18］。

此外，由于結(jié)合試驗的靈敏度較低，目前還沒有標(biāo)準(zhǔn)化的分析方法來表征小分子適配體對靶標(biāo)的親和力大?。?9-20］。近來有研究人員提出，對于適配體-靶標(biāo)復(fù)合物的解離常數(shù)（equilibrium dissociation constant，KD）的測定，大致方法可分為基于分離策略（如透析法、超濾法、凝膠電泳法、毛細(xì)管電泳法等）或均相策略（熒光強(qiáng)度法、熒光各向異性法、圓二色譜法、紫外可見分光光度法及表面等離子體共振法等）［21-22］。納米金（AuNPs）比色法是一種現(xiàn)象明顯、易制備、操作簡單、耗時短的表征方法，目前已有廣泛的應(yīng)用，只是AuNPs比色法一般并不用于KD值的準(zhǔn)確測定，而是多用于親和性、特異性檢測與傳感器的制備［22-23］。熒光檢測法在測定適配體-靶標(biāo)復(fù)合物時具有諸多優(yōu)勢，它可以在適配體與靶標(biāo)處于平衡時進(jìn)行測定，避開了結(jié)合速率和解離速率的問題。因此，本研究在結(jié)合已有研究的基礎(chǔ)上，首先使用AuNPs比色法對經(jīng)ISM優(yōu)化后的適配體親和力進(jìn)行初步驗證，隨后根據(jù)核酸適配體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換信號檢測靶標(biāo)的原理，將標(biāo)記有羧基熒光素（carboxy fluorescein，F(xiàn)AM）的核酸適配體與標(biāo)記猝滅基團(tuán)（black hole quencher 1，BHQ1）的適配體互補(bǔ)鏈配對雜交，通過P4競爭適配體的結(jié)合位點使熒光恢復(fù)，建立了一種基于核酸適配體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換開關(guān)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）方法對適配體的KD值進(jìn)行測定［24］。

2017年，P4適配體經(jīng)過截短后，這里稱為P4S-0，在適配體傳感器的構(gòu)建中得到了應(yīng)用［25］。本研究描述了一種基于GA的ISM與分子對接相結(jié)合的方法，來篩選和優(yōu)化出高親和力和選擇性的P4適配體（圖1）；此外，還提出使用Mfold和RNAComposer分別預(yù)測ssDNA的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，使用Discovery Studio將RNA修改為DNA，最后對結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最小化處理，作為分子對接中的ssDNA適配體的三維模型的輸入結(jié)構(gòu)；在親和力驗證階段，首先使用AuNPs比色法對適配體進(jìn)行初步表征，隨后采用基于FRET的熒光法對適配體的KD值進(jìn)行測定，優(yōu)化后的候選適配體與其互補(bǔ)序列如表1所示。

Table 1 Candidate aptamers and their complementary sequences

Fig.1 The genetic algorithm-based in silico maturation strategy combined with molecular docking to obtain progesterone-binding aptamer with improved affinity

1 材料與方法

1.1 P4適配體的計算機(jī)輔助優(yōu)化方法

1.1.1 初始文庫的生成

輪盤賭算法原理與操作過程：GA中的輪盤賭是一種簡單的選擇方法，即每個個體的選擇概率和其適應(yīng)度值成比例，適應(yīng)度越大，選中概率也越大，類似于商場的抽獎輪盤［26］。此處以每條適配體與P4進(jìn)行分子對接打分的分值作為算法中的適應(yīng)度值，打分越高，那么適應(yīng)度越高，該序列成為親本的可能性越大。后續(xù)每次參與變異的親本序列、選擇變異的類型與選擇發(fā)生變異的位置等都離不開輪盤賭算法。

首先利用GA構(gòu)造DNA序列庫，使用給定的P4適配體序列P4S-0產(chǎn)生初始親代DNA序列庫。初始序列庫由3種類型的適配體組成，包括分別由1個點突變、2個點突變和不同交叉（單點、雙點和多點交叉）產(chǎn)生的3組適配體，共60條序列。所有GA過程均在Microsoft Visual Studio（2022）［27］中使用C++語言編寫的程序?qū)崿F(xiàn)，設(shè)定恒定的交叉百分比（0.8）和突變率（0.2）［28］。執(zhí)行此程序后，得到了初始文庫的60條序列。

1.1.2 基于GA的P4適配體迭代優(yōu)化步驟

產(chǎn)生第一代序列（G1）：初始文庫包括60條序列，根據(jù)初始文庫中序列的分子對接結(jié)果，選擇打分排名前5的序列，根據(jù)對接結(jié)果的打分值對初始序列以不同的適應(yīng)度值（即出現(xiàn)率）進(jìn)行復(fù)制，并隨機(jī)配對選擇親本，通過輪盤賭選擇方法對序列進(jìn)行單點、雙點和多點交叉（程序隨機(jī)產(chǎn)生1個0到2的隨機(jī)整數(shù)，0對應(yīng)發(fā)生單點交叉，1對應(yīng)發(fā)生兩點交叉，2對應(yīng)發(fā)生多點交叉），產(chǎn)生20條不重復(fù)的子代序列作為G1。將得到的適配體再次進(jìn)行分子對接。

產(chǎn)生第二代序列（G2）：將G1和初始文庫中對接打分排名前5的序列作為親代，將單堿基突變隨機(jī)引入序列以產(chǎn)生1組20條新序列作為G2。具體操作為：同樣以不同的出現(xiàn)率按照輪盤賭方法選擇親代，然后再產(chǎn)生1～25內(nèi)（序列長度為25）的隨機(jī)數(shù)決定親代的哪個位置發(fā)生單堿基突變，突變后的堿基種類也是由隨機(jī)數(shù)的產(chǎn)生決定，隨機(jī)產(chǎn)生0～3之間的整數(shù)，每個整數(shù)對應(yīng)一種堿基（0對應(yīng)A、1對應(yīng)T、2對應(yīng)C、3對應(yīng)G），如果產(chǎn)生的堿基與原堿基相同，則重新產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)決定。此時產(chǎn)生了20條新序列作為G2，繼續(xù)進(jìn)行分子對接。

產(chǎn)生第三代序列（G3）：選擇初始文庫、G1、G2代中打分排名前5的序列，引入雙堿基突變以產(chǎn)生20條新序列作為G3。具體操作為：根據(jù)不同的出現(xiàn)率和輪盤賭方法，來選擇每次突變的親代，選擇親代后產(chǎn)生兩個不同的隨機(jī)整數(shù)來選擇發(fā)生堿基突變的序列位置（隨機(jī)數(shù)范圍就是序列長度范圍1～25），再產(chǎn)生0～3的隨機(jī)整數(shù)來表示突變后的堿基（0對應(yīng)堿基A、1對應(yīng)堿基T、2對應(yīng)堿基C、3對應(yīng)堿基G），若突變后的堿基與親代序列的原位置堿基相同，就重新產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)來重新選擇，直到選擇到不同的堿基為止，突變后將序列與親代、已經(jīng)產(chǎn)生過的突變序列進(jìn)行比較，如果重復(fù)，那么將重新在該親代上選擇突變位置和突變后的堿基。此時產(chǎn)生了20條新序列作為G3代，同樣進(jìn)行分子對接。

所有GA優(yōu)化步驟和適配體對接打分結(jié)果見圖S1和表S1，在初始文庫、G1、G2和G3代中選擇5條打分最高的序列作為候選適配體。

1.1.3 適配體二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

使用Mfold Web服務(wù)器（http://www.unafold.org/hybrid2-same.php）對初始文庫以及G1、G2、G3代序列的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測［29］。預(yù)測在溫度為25℃，離子濃度與后續(xù)熒光實驗緩沖液（pH 7.6）的離子組分相同時，即在120 mmol/L Na+、20 mmol/L Mg2+下熱穩(wěn)定最好的結(jié)構(gòu)。

1.1.4 適配體三級結(jié)構(gòu)的建模和優(yōu)化

對ssDNA適配體三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測主要包括3個步驟。首先，ssDNA的二級結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過Mfold Web服務(wù)器預(yù)測出，將預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)通過RNA Composer服務(wù)器建立相對應(yīng)的3D RNA模型［30］。隨后，使用Discovery Studio 4.5［31］將ssRNA結(jié)構(gòu)中的尿嘧啶轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶，將核糖核酸轉(zhuǎn)換為脫氧核糖核酸，即轉(zhuǎn)換為ssDNA的三級結(jié)構(gòu)。隨后，使 用 Molecular Operating Environment（MOE，2014）［32］將ssDNA的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最小化處理，在Amber力場下使用最陡下降法使斜率小于0.000 01 kcal/mol2。

通過對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）中的24個ssDNA序列進(jìn)行核磁共振解析，評價該方法的準(zhǔn)確性。用Visual Molecular Dynamics（VMD）［33］軟件比較了核磁共振求解的糖-磷酸鹽骨架結(jié)構(gòu)和用上述方法預(yù)測的糖-磷酸鹽骨架結(jié)構(gòu)之間的均方根偏差（RMSD）來確定結(jié)構(gòu)的相似度。

1.1.5 分子對接

使用分子對接軟件AutoDockTools（ADT，1.5.6）［34］對GA產(chǎn)生的ssDNA適配體與P4的親和力大小進(jìn)行評估。將能量最小化后的ssDNA適配體結(jié)構(gòu)視為剛性結(jié)構(gòu)，隨后對P4小分子進(jìn)行檢測配體中心與扭轉(zhuǎn)鍵的操作。為了覆蓋適配體結(jié)構(gòu)中的所有活性位點，創(chuàng)建大小在126 ?×126 ?×126 ?（x，y，z），間距為0.375 ?以內(nèi)的對接盒子。使用拉馬克遺傳算法構(gòu)象搜索，建立了100次遺傳算法運行的所有對接模擬，種群規(guī)模為1 502 500 000次能量評估的最大數(shù)量，每次運行27 000代。根據(jù)結(jié)合能、相互作用類型（主要是氫鍵、疏水作用）和結(jié)合位點等分子對接結(jié)果對最佳配合物進(jìn)行評分和篩選。

1.1.6 對接結(jié)果的圖像表征

使用Pymol［35］將適配體-P4復(fù)合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行圖像表征。

1.2 實驗方法

為了驗證經(jīng)ISM優(yōu)化后的適配體親和力與特異性，將適配體進(jìn)行了如下的實驗評估。首先，使用AuNPs比色法初步驗證，比較候選適配體的親和力大?。?2］，原理如圖2所示。隨后構(gòu)建如圖3的適配體結(jié)構(gòu)開關(guān)準(zhǔn)確測定候選適配體的KD值。根據(jù)適配體結(jié)構(gòu)開關(guān)檢測靶標(biāo)的原理，在候選適配體的兩條互補(bǔ)鏈上從3'和5'端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM和猝滅基團(tuán)BHQ1，當(dāng)候選適配體與兩條互補(bǔ)鏈堿基配對雜交時，標(biāo)記了熒光基團(tuán)的FDNA與標(biāo)記了猝滅基團(tuán)的BDNA相互靠近，熒光猝滅；通過P4競爭結(jié)合候選適配體FDNA的結(jié)合位點，使兩條互補(bǔ)鏈從適配體上解離下來，熒光恢復(fù)。以此核酸適配體結(jié)構(gòu)開關(guān)法評估候選適配體的親和力和特異性。

Fig.2 The schematic for the evaluation of candidate aptamer based on colorimetric method

Fig.3 The schematic for the evaluation of candidate aptamer based on FRET and the aptamer structure switch

1.2.1 實驗試劑與儀器

孕酮（源葉生物科技有限公司，上海），雙酚A、雌二醇、睪酮和皮質(zhì)醇（阿拉丁生化科技股份有限公司，上海）、適配體及其互補(bǔ)序列（生工生物工程公司，上海）、Tris-HCl（福州奧研實驗器材有限責(zé)任公司，福州），氯化鈉、氯化鎂和吐溫-20（Tween-20）（阿拉丁生化科技股份有限公司，上海）、納米金膠體（先豐納米，南京）。

F-7100熒光分光光度計（HITACHI，日本），設(shè)置激發(fā)波長為480 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度設(shè)定為5 nm和5 nm；Synerg Lx多功能酶標(biāo)儀（博騰儀器有限公司，美國）；ZQPW-70A全溫振蕩培養(yǎng)箱（萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司）；AUY220-0.1 mg分析天平（島津，日本）；TGL-20M臺式高速冷凍離心機(jī)（邁克爾實驗儀器有限公司，湖南）；Q-LAB20-DV超純水儀（啟沁環(huán)?？萍脊?，湖南）。

1.2.2 AuNPs比色法初步驗證候選適配體的親和力

AuNPs比色法的實驗原理如圖2所示，先對實驗中NaCl和適配體的濃度進(jìn)行優(yōu)化，具體見文檔S1和圖S2，S3。條件優(yōu)化后進(jìn)行適配體親和力的定性分析，分別量取25 μl 3 μmol/L適配體溶液與25 μl系列濃度梯度 P4 溶液（0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/L），震蕩混勻，在室溫下孵育30 min后，再加入150 μl AuNPs溶液和10 μl 2.5 μmol/L NaCl溶液，室溫孵育5 min后觀察混合溶液的顏色變化，記錄溶液吸光度變化情況，計算吸光度比值A(chǔ)620/A520，以P4濃度為橫坐標(biāo)，吸光度比值A(chǔ)620/A520為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。

1.2.3 基于適配體結(jié)構(gòu)開關(guān)的FRET法測量適配體的KD值

a.適配體KD值的測量

構(gòu)建適配體結(jié)構(gòu)開關(guān)（圖3），并優(yōu)化適配體與互補(bǔ)鏈的濃度、結(jié)構(gòu)開關(guān)形成時間、P4孵育時間以及探索溶液中Mg2+濃度和Tween 20含量對結(jié)構(gòu)開關(guān)的影響，上述條件優(yōu)化見文檔S1和圖S4～S8。依據(jù)上述條件優(yōu)化后的結(jié)果，測定在不同濃度P4的情況下結(jié)構(gòu)開關(guān)體系的熒光信號變化強(qiáng)度。分別配制 0、10、20、30、50、100、500、1 000 nmol/L的P4溶液。將緩沖液稀釋好的0.1 μmol/L FDNA、0.2 μmol/L適配體、0.3 μmol/L BDNA各50 μl置于95℃水浴鍋中加熱10 min，取出后迅速轉(zhuǎn)移到碎冰中冷卻降溫。然后取適配體、FDNA、BDNA一起孵育15 min，后加入50 μl P4溶液在37℃恒溫下孵育30 min，使二者得到充分結(jié)合，在測定前加入300 μl純凈水將反應(yīng)體系補(bǔ)足到500 μl，利用熒光分光光度計測定每組熒光信號值。以P4濃度為橫坐標(biāo)x，以熒光信號恢復(fù)百分比（F1-F2）/F2為縱坐標(biāo)y，其中F1是加入P4之后的熒光值，F(xiàn)2是陰性對照組（P4為0）的熒光值。通過GraphPad Prism 8.0 擬合不同濃度P4與適配體結(jié)合的非線性飽和曲線，根據(jù)曲線y=Bmax/（KD+x）計算KD值，Bmax指的是適配體與P4的最大結(jié)合率，是常量。根據(jù)此方法測定以上對接打分最高的5條候選適配體與靶標(biāo)復(fù)合物的KD值。

b.通過實驗評估適配體的選擇性

經(jīng)ISM優(yōu)化后，適配體對P4的特異性同樣需要鑒定。因此，本實驗選取了雙酚A、雌二醇、睪酮、皮質(zhì)醇作為干擾物，將這些物質(zhì)配制成濃度為0.1 μmol/L的溶液。0.1 μmol/L FDNA、0.2 μmol/L P4適配體和 0.3 μmol/L BDNA 各 50 μl先孵育15 min，然后再加入0.1 μmol/L各物質(zhì)的溶液50 μl，在測定前加入300 μl ddH2O將反應(yīng)體系補(bǔ)足到500 μl，利用熒光分光光度計測定出不同物質(zhì)的熒光信號變化強(qiáng)度，以不同物質(zhì)種類為橫坐標(biāo)x，以熒光信號恢復(fù)值（F1-F2）為縱坐標(biāo)y作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 候選適配體的熱力學(xué)性質(zhì)

Fig.4 Frequency of secondary structures in groups from the initial library and following generations (G1,G2,G3)

初始文庫包含60條ssDNA，包含3種不同類型的二級結(jié)構(gòu)，包括簡單發(fā)夾環(huán)（hairpin loop）、內(nèi)環(huán)（internal loop）和多分支環(huán)（multibranch loop）。子代G1、G2、G3中的適配體二級結(jié)構(gòu)更加多樣化（圖4）。初始文庫中二級結(jié)構(gòu)形成的最小自由能在-0.01～-4.42 kcal/mol，G1代中為-0.03～-10.21 kcal/mol，G2代為-0.19～-4.98 kcal/mol，G3代為-0.27～-10.8 kcal/mol。初始適配體P4S-0具有內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)（圖5），其自由能約為-0.35 kcal/mol。初始庫和子代文庫中選擇的幾條候選適配體二級結(jié)構(gòu)如圖5所示，結(jié)果表明，不同的GA操作可以成功地創(chuàng)建一個虛擬文庫，不同子代的核酸序列在二級結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)性質(zhì)上具有多樣性。

2.2 適配體的三維建模

通常，虛擬篩選需要得到受體和配體分子的三維結(jié)構(gòu)。由于目前缺乏對ssDNA進(jìn)行準(zhǔn)確三維建模的計算工具，且難以通過實驗確定文庫中所有核酸序列的三維結(jié)構(gòu)，許多研究人員不得不轉(zhuǎn)而尋找較為可靠的預(yù)測ssDNA三維結(jié)構(gòu)的方法。Jeddi和Saiz［18］在2017年首次報道了一種預(yù)測ssDNA適配體三維結(jié)構(gòu)的方法，這里本文學(xué)習(xí)這種建模思路并進(jìn)行了一定修改。主要預(yù)測步驟包括：a.構(gòu)建二級結(jié)構(gòu)；b.構(gòu)建等效的三維ssRNA結(jié)構(gòu)；c.根據(jù)報道的步驟，將三維ssRNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為ssDNA結(jié)構(gòu)。本文在步驟b中使用了RNAComposer而不是文獻(xiàn)中的Assemble2/Chimera；此外，并非使用VMD，而是使用Discovery Studio 4.5將ssRNA模型轉(zhuǎn)換為等效的ssDNA 3D結(jié)構(gòu)，并使用MOE軟件包進(jìn)行能量優(yōu)化。通過對24個具有已知結(jié)構(gòu)的ssDNA進(jìn)行3D建模，每個預(yù)測的ssDNA結(jié)構(gòu)都與從PDB數(shù)據(jù)庫下載的相應(yīng)ssDNA結(jié)構(gòu)對齊，并計算了每對結(jié)構(gòu)之間的相應(yīng)均方根偏差（RMSD）以測量相似程度。圖6顯示了24個預(yù)測的3D結(jié)構(gòu)（ssDNA-黃色）和從PDB數(shù)據(jù)庫下載的24個NMR結(jié)構(gòu)（ssDNA-綠色）［36-56］的疊加，以及RMSD的計算值。結(jié)果表明，本方法能夠準(zhǔn)確預(yù)測各種ssDNA的結(jié)構(gòu)，序列范圍是7～27個核苷酸，得到的RMSD值范圍在2.51～9.02 ?的，通常在4 ?附近，平均值為5.6 ?。然后，利用本方法預(yù)測所有新的適配體的三維結(jié)構(gòu)，并用于分子對接研究。

Fig.6 Alignment of the 3D structures predicted by our pipeline (yellow) and the corresponding experimental ones obtained from PDB (green) for the 24 ssDNA

2.3 使用計算機(jī)輔助策略優(yōu)化P4適配體

利用分子對接技術(shù)研究P4與120條候選適配體的結(jié)合能、結(jié)合位點和相互作用模式，其中包括來自初始文庫和G1、G2、G3代的序列。在初始文庫和不同子代中，ssDNA適配體的預(yù)測結(jié)合能分別在-4.26～-6.7 kcal/mol和-4.46～-7.48 kcal/mol（表S1）。

初始適配體P4S-0與P4的相互作用主要是疏水作用和氫鍵作用，對接能量為-4.63 kcal/mol，主要是P4S-0的這幾個殘基——DA2、DT3和DT4與P4進(jìn)行相互作用。P4S-0的DA2殘基與P4的20位酮羰基形成氫鍵（圖S9）。

在初始文庫和后幾代的打分排名靠前的序列中，大多數(shù)具有簡單的簡單發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)（圖5），其自由能等于或低于P4S-0。對接結(jié)果指出，發(fā)夾環(huán)適配體的結(jié)合位點主要位于同一環(huán)區(qū)，而多分支環(huán)適體的結(jié)合位點主要位于同一環(huán)區(qū)的循環(huán)區(qū)域外。通常，未配對殘基可以作為結(jié)合位點參與靶標(biāo)識別，因為這些殘基更靈活，有更多可用的供體或受體［57］。此外，對接結(jié)果也表明，候選適配體的平均結(jié)合能從初始庫（-5.08 kcal/mol）到G1（-5.98 kcal/mol）、G2（-5.93 kcal/mol）、G3（-5.85 kcal/mol）大幅降低，G3代的結(jié)合能又有一些升高。在經(jīng)過這幾輪GA后的局部搜索后，似乎對適配體序列進(jìn)行了適當(dāng)優(yōu)化，而進(jìn)一步的修改可能導(dǎo)致了序列的分化，導(dǎo)致功能的喪失。

在G1打分最高的序列中，適配體P4G1-14、P4G1-6和P4G1-7對P4的親和度最高。適配體P4G1-14、P4G1-6和P4G1-7的結(jié)合能分別為-7.48、-6.9和-6.86 kcal/mol。P4G1-14與P4的結(jié)合模式為溝槽結(jié)合，主要作用力有氫鍵和疏水作用。P4G1-6與P4主要通過疏水作用和氫鍵產(chǎn)生相互作用，其中疏水作用占主導(dǎo)，結(jié)合模式為溝槽結(jié)合。P4G1-7與P4的結(jié)合位點在非環(huán)區(qū)，作用模式也是溝槽結(jié)合。

在G2代中，P4G2-14和P4G2-20的對接打分最高，對接能量分別為-6.76和-6.95 kcal/mol。P4G2-14與P4的相互作用模式為插入結(jié)合，P4G2-20與P4的相互作用模式為溝面結(jié)合，相互作用力中疏水作用占主導(dǎo)。以上適配體與P4具體相互作用的具體堿基和2D拓?fù)鋱D（圖S9，S10），可以更直觀地體現(xiàn)適配體與目標(biāo)物的具體作用位點、作用力的方向等。

基于熱力學(xué)性質(zhì)和對接分析，篩選出P4G1-14、P4G2-14、P4G1-6、P4G1-7和P4G2-20這5條適配體最佳候選適配體，隨后通過實驗進(jìn)行評價，實驗部分以P4S-0為對照。

2.4 初步驗證候選適配體的親和力

在優(yōu)化后的NaCl濃度、適配體濃度的條件下，基于AuNPs比色法對原適配體P4S-0與候選適配體（P4G1-14、P4G2-20、P4G1-6、P4G1-7和P4G2-14）進(jìn)行了親和力比較。在與系列濃度梯度的P4溶液（0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/L）充分混合均勻后，觀察溶液顏色變化，A620/A520比值越高，說明適配體與靶標(biāo)的親和力越強(qiáng)。隨著P4濃度的升高，在濃度為0～4 mg/L時，各核酸適配體吸光度比值A(chǔ)620/A520逐漸上升，說明此時P4濃度不夠，AuNPs上仍吸附有過量的核酸適配體，還未完全與P4結(jié)合，受核酸適配體的保護(hù)，AuNPs產(chǎn)生聚集不明顯。隨著P4濃度的升高，越來越多AuNPs上吸附的核酸適配體脫落與P4結(jié)合，AuNPs產(chǎn)生的聚集效應(yīng)越來越明顯，直到反應(yīng)完全，A620/A520基本不變，此時AuNPs、核酸適配體與P4三者的結(jié)合達(dá)到了平衡。另外，從圖7可以看出，在同等條件下，候選適配體P4G1-14的吸光度比值A(chǔ)620/A520較高，明顯高于其他適配體，說明P4G1-14與P4的親和力最強(qiáng)，原始適配體P4S-0的吸光度比值最低，其余4條候選適配體的親和力均高于P4S-0。從上述分析可初步得出，優(yōu)化后的候選適配體親和力均較P4S-0有了較大提升。只是AuNPs比色法并不能對適配體的KD值進(jìn)行準(zhǔn)確測定。

Fig.7 Variation of A620/A520 of AuNPs solution of candidate aptamers with increasing P4 concentration

2.5 適配體的KD值

2.5.1 適配體KD值的測定

使用基于適配體結(jié)構(gòu)開關(guān)的FRET法測定適配體靶標(biāo)復(fù)合物的KD值，KD值越小，說明適配體與靶標(biāo)的親和力越高。以上候選適配體與原始適配體的KD測定結(jié)果如圖8所示，并與AutoDOCK對接打分結(jié)果進(jìn)行比較（表2）。結(jié)果表明，經(jīng)以上GA優(yōu)化后的候選適配體相比于原始適配體P4S-0，對P4的親和性有了較大提高，其中，P4G1-14的親和力提升最明顯，其KD值為4.457，相比于P4S-0親和力提升了約3倍，其次是P4G2-20、P4G1-6、P4G1-7 和 P4G1-14，KD值分別為 6.432、8.582、10.45、11.34，此方法得出的KD值親和大小順序與對接打分的結(jié)果基本一致。這種實驗的優(yōu)勢在于，檢測熒光信號可以在適配體和P4處于平衡狀態(tài)時進(jìn)行KD測定，這不僅避開了結(jié)合速率或解離速率的問題，同時允許在各種緩沖溶液中進(jìn)行測定，這可能是其他分離模式的分析技術(shù)難于實現(xiàn)的［58］。但是，由于小分子適配體的親和力鑒定目前缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的分析方法，此方法僅可作為判斷的部分依據(jù)，如果有其他親和力鑒定方式作為輔助將會使結(jié)果更加可靠。

Table 2 The KD value of aptamer was measured by fluorescence detection method based on the structure switch of aptamer and compared with the docking score

Fig.8 Saturation curve of candidate aptamers binding to P4

此外，方法中的測試結(jié)果可能會受到FDNA與BDNA的解鏈溫度的影響，當(dāng)這兩條鏈GC含量高時，解鏈溫度會隨之升高［59］，使得鏈解離更加困難，導(dǎo)致測得的解離常數(shù)偏小，這一點會對實驗結(jié)果造成影響。例如P4S-0的BDNA鏈中GC含量約為80%，而P4G1-14的BDNA中GC含量為58%，解鏈溫度差距的影響可能會對實驗結(jié)果造成一定偏差。本實驗沒有設(shè)置第二種有效的方法測定KD值，無法與FRET法的結(jié)果相佐證，是本實驗的局限性所在。

2.5.2 通過實驗評估適配體的特異性

如圖9所示，幾個候選適配體對P4的響應(yīng)值都是最高的，幾種干擾物都只能引起部分響應(yīng)。其中，雙酚A的干擾性最小，而雌二醇、睪酮和皮質(zhì)醇由于擁有與P4一樣的甾體結(jié)構(gòu)，所以候選適配體保存著對這幾種甾體物質(zhì)的識別能力，對雌二醇、睪酮和皮質(zhì)醇的響應(yīng)值較雙酚A高。從圖9中可以看出，在P4與其他干擾物共存的情況下，候選適配體仍對P4具有較高的特異性，候選適配體可用于進(jìn)一步的傳感器設(shè)計開發(fā)。

Fig.9 Fluorescence response of aptamer structural switch to different targets

3 結(jié)論

本研究成功地使用基于GA的ISM策略，與分子對接結(jié)合，提高了之前報道的P4S-0適配體對P4的親和力。計算機(jī)打分結(jié)果與實驗的一致性證實了此策略是設(shè)計或優(yōu)化適配體功能的有效工具。分子對接技術(shù)可在分子水平上闡明受體與配體之間的相互作用，有助于設(shè)計或優(yōu)化所需的適配體。然而，缺乏對生物大分子3D結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件是計算機(jī)輔助技術(shù)發(fā)展的重要限制。本文通過先分別預(yù)測序列的二級結(jié)構(gòu)以及相對應(yīng)的RNA三級結(jié)構(gòu)，后將RNA轉(zhuǎn)換為DNA并經(jīng)過能量優(yōu)化得到ssDNA的三級結(jié)構(gòu)，能夠較準(zhǔn)確預(yù)測DNA適配體的3D結(jié)構(gòu)，首次預(yù)測了原始適配體P4S-0與P4的結(jié)合位點和相互作用類型。此外，對不同適配體-P4復(fù)合物的分析表明，較低的結(jié)合能、較簡單的二級結(jié)構(gòu)、較低的DG和相互作用類型是得到高親和力、高選擇性適配體的重要因素。

得到經(jīng)ISM優(yōu)化的適配體后，對適配體的親和力和特異性驗證是本研究的關(guān)鍵步驟。本研究首先采取了AuNPs比色法對候選適配體的親和力進(jìn)行初步驗證，由于AuNPs比色法并不能準(zhǔn)確測定適配體的KD值，于是構(gòu)建了基于結(jié)構(gòu)開關(guān)的FRET法準(zhǔn)確測量適配體的KD值?；谶m配體結(jié)構(gòu)開關(guān)檢測適配體對P4親和力的方法，可以避開結(jié)合速率或解離速率的問題，同時允許在各種緩沖溶液中進(jìn)行測定，在表征小分子結(jié)合適配體方面所表現(xiàn)出的優(yōu)勢可以用于開發(fā)高效的熒光適配體傳感器。但該方法的缺陷在于，對于小分子配體的親和力鑒定沒有一種標(biāo)準(zhǔn)化的分析方法，應(yīng)當(dāng)多引入幾種適配體親和力測定方法對計算機(jī)優(yōu)化適配體的結(jié)果加以佐證，且此方法中互補(bǔ)鏈的不同解鏈溫度會對結(jié)果造成偏差，是FRET法的局限性所在，同時，也應(yīng)該補(bǔ)充靈敏度實驗以更直觀地體現(xiàn)優(yōu)化后的適配體擁有更強(qiáng)的功能。

其他改善適配體功能的策略，如結(jié)合序列的共軛或者構(gòu)建多價適配體、穩(wěn)定適配體的結(jié)構(gòu)或?qū)⑹杷鶊F(tuán)引入適配體，可通過此方法流程進(jìn)行研究。

附件見本文網(wǎng)絡(luò)版（http://www.pibb.ac.cn或http://www.cnki.net）：

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