從分子學角度探討柴胡-郁金對卒中后抑郁潛在作用機制

張梓琪，高才植，殷曉莉

1 遼寧中醫(yī)藥大學 遼寧沈陽 110032

2 遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院 遼寧沈陽 110032

卒中后抑郁（Post-Stroke Depression，PSD）是發(fā)生于中風后的一種情感障礙，臨床表現(xiàn)主要為情緒低落、思維遲緩、興趣減退，早在1977年由Folstein等[1]首次提出腦卒中后繼發(fā)抑郁的可能，目前發(fā)病機制尚不明確，主要有生物學機制和社會心理學機制這兩方面解釋。卒中后抑郁不僅影響了卒中患者的康復進程，還提高了卒中患者的致死率，給家庭社會造成極大的負擔。中醫(yī)學認為卒中后抑郁屬于“郁證”范疇，屬因病致郁，中藥治療在減輕患者癥狀、縮短病程方面發(fā)揮了相當?shù)膬?yōu)勢，且極大的減少了毒副作用，為卒中患者后續(xù)的康復治療提供了保障。“柴胡-郁金”治療卒中后抑郁有較好的療效，且基于文獻數(shù)據(jù)挖掘，統(tǒng)計出“柴胡-郁金”為近15年中藥治療PSD頻次最多的藥物，兩者配伍可以加強調節(jié)臟腑氣機升降出入的功能[2]。

柴胡[3]為傘形科植物柴胡或狹葉柴胡的干燥根，按性狀差異，分為“北柴胡”及“南柴胡”，味苦，性微寒，歸膽、肝經，柴胡的主要成分為柴胡皂苷，藥理作用有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗病毒、調節(jié)免疫系統(tǒng)、抗腫瘤等作用[4]；郁金[3]為姜科屬，是溫郁金、姜黃、蓬莪術、廣西莪術的干燥塊根，味辛、苦，性微寒，歸肝、心、肺經，藥理作用有調節(jié)脂質代謝、保肝利膽、調節(jié)血液循環(huán)、調節(jié)消化系統(tǒng)[5]。中醫(yī)學以“整體觀念、辨證論治”貫穿始終，中藥作用于疾病更是多成分、多途徑、多靶點，如何用更加科學的方法解釋中藥作用于疾病的機理，成為了中醫(yī)藥的研究熱點[6]。網(wǎng)絡藥理學探討的是相互之間關系網(wǎng)絡，與中藥作用疾病機理不謀而合。“網(wǎng)絡藥理學”的概念由Hopkins等于2007年提出[7]，是基于系統(tǒng)生物學理論，對生物系統(tǒng)進行的網(wǎng)絡剖析，更強調從多途徑對信號進行調節(jié)，揭示了“藥物－基因－靶點－疾病”之間復雜的網(wǎng)絡關系，從多維視角理解疾病的分子學機制，預測藥理作用[8]。本文將從網(wǎng)絡藥理學角度探討“柴胡-郁金”對卒中后抑郁的潛在分子作用機制，為后續(xù)卒中后抑郁的研究治療提供有效幫助。

材料與方法

1 數(shù)據(jù)庫及軟件

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmspsearch.php）、疾病靶點數(shù)據(jù)庫（Genecards，https：//www.genecards.org/）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https：//www.omim.org/）、Cytoscape3.6.2軟件、蛋白-蛋白相互作用平臺數(shù)據(jù)庫（String，https：//string-db.org/）、Venny繪圖軟件、富集分析metascape（https：//metascape.org/gp/index.html#/）。

2 藥物靶點及活性成分篩選

將TCMSP數(shù)據(jù)庫分別輸入“柴胡”“郁金”，搜索得到各藥化學成分，通過設置口服生物利用度OB（OB≥30%）及類藥性DL（DL≥0.18）進行篩選，再結合文獻搜集，將潛在的有效靶點整合一起。

3 疾病靶點收集

通過Genecards、OMIM軟件，以疾病名稱“Post-Stroke Depression”為檢索詞進行檢索，將不同數(shù)據(jù)庫的檢索結果歸納在一起，得到PSD的靶標。

4 藥物疾病靶點標準化及藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡構建

將藥物作用靶點（Target name）通過輸入軟件Uniport進行規(guī)范，添加symbol，同時將柴胡-郁金所有基因靶點與卒中后抑郁（PSD）基因靶點篩選后，通過Venny軟件繪制出疾病和藥物共同作用靶點圖，將疾病藥物共同作用靶點導入cytoscape3.7.2軟件，通過R語言，繪制疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖。

5 蛋白相互作用網(wǎng)絡構建（PPI）

將篩選得到的藥物和疾病的共同靶點上傳到String平臺，基因類型設置“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設置為0.7，其余參數(shù)不變，構建PPI網(wǎng)絡圖，展示出“柴胡-郁金”藥對靶點蛋白與卒中后抑郁靶點蛋白之間的相互作用。

6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

將藥物疾病共同靶點上傳到metascape，物種選擇“H.sapiens 36”，依次進行GO（gene ontology）分析和KEGG（pathway analysis）分析，P值設置＜0.01，篩選結果最終以條形圖呈現(xiàn)[9]。

結 果

1 柴胡-郁金作用靶點及潛在有效成分

通過TCMSP篩選（OB≥30%、DL≥0.18）的到柴胡化學成分共17個，作用靶點276個，郁金的得到的化學成分15個，作用靶點60個，最后刪除重復項，最終的到“柴胡-郁金”總共的化學成分為32個，作用靶點為190個。（化學成分見表1，由于結果較多，僅列出部分）

2 PSD疾病作用靶點

通過GeneCards（https：//www.genecards.org/cgibin/carddisp.pl）輸入“Post-stroke Depression”篩選得到的疾病靶點為210個，通過OMIM得到疾病靶點為6個，刪除重復，最終通過這兩個數(shù)據(jù)庫的到PSD疾病靶點為213個。

3 “柴胡-郁金”與PSD共同靶點以及疾病-靶點-藥物網(wǎng)絡圖

將藥物與疾病靶點通過Venny軟件，繪制出韋恩圖，得到共有靶點為36個（結果如圖1所示）；將得到的標準化的共同靶點和化學成分導入cytoscape3.7.2中，繪制藥物-成分-靶點-疾病圖，見圖2。圖中內圈為有效成分，外圈為疾病、藥物共同靶點，圖中共有節(jié)點（nodes）47個，其中靶基因節(jié)點36個，成分節(jié)點8個，平均度值為4.1，度值反映了節(jié)點與節(jié)點相互連接的情況，根據(jù)度值高低排序，依次是槲皮素、柚皮素、山柰酚、β-谷固醇、異鼠李素、茵陳黃酮、豆甾醇、3，5，6，7-四甲氧基-2-（3，4，5-三甲氧基苯基）色酮，度值排名前6位靶基因依次為PPARG、F7、CASP3、AKT1、PON1、CASP9。

表1 柴胡-郁金潛在活性成分

圖1 藥物疾病共同靶點韋恩圖

4 PPI網(wǎng)絡構建

將上過程得到的藥物疾病共同靶點輸入String，設置最低相互作用閾值為0.7，其余設置不變，得到藥物-疾病的PPI網(wǎng)絡，共有節(jié)點數(shù)36個，邊數(shù)為139條，平均節(jié)點度為7.72，并將得到的tsv文件導入Cytoscape3.7.2，然后選擇NetworkAnalyzer，得到圖3，圖中每一個節(jié)點相當于一個蛋白，節(jié)點大小、顏色亮度代表Degree的值，Degree值越大則節(jié)點越大，顏色越亮，邊的寬度代表節(jié)點和節(jié)點相互作用的強度，邊越寬，則節(jié)點之間互相作用越強。通過圖3得到“柴胡-郁金”與PSD潛在核心蛋白是IL6、AKT1、VEGFA、CRP、CCL2、MMP9、SERPINE1。

5 GO生物學功能富集分析和KEGG代謝通路富集分析

將藥物疾病共同靶點導入Metascape，物種選擇“homo sapiens”，選擇個性化分析，設置P值＜0.01，最小計數(shù)為3，富集因子＞ 1.5，然后進行GO生物學功能富集分析，包括3部分，生物學過程（Biological Process，BP）、細胞組成（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）分析[10]，如圖4、5、6（僅列出部分，圖中顏色根據(jù)P值著色，P值越高，顏色越深）?！安窈?郁金”與PSD共有靶點的分子功能主要為細胞因子活性、內肽酶活性、蛋白酶結合、NADP綁定等；主要的生物學功能為調節(jié)細胞因子介導的信號通路、對脂多糖的反應、對酸性化學物質的反應、調節(jié)對受傷的反應、對外部刺激反應的負面調節(jié)、對雌二醇的反應等；主要細胞組成為細胞外基質、血漿脂蛋白顆粒、膜筏、早期核內體等；KEGG代謝通路的分析主要系統(tǒng)分析了基因產物在細胞中的代謝途徑，如圖7所示，主要代謝途徑為AGE-RAGE信號通路、弓形蟲病、TNF信號通路、腫瘤中轉錄失調通路、血清素（5-HT）信號通路、NF-κB信號通路等。這可能為“柴胡-郁金”作用于PSD的關鍵通路。

圖2 藥物-成分-靶點-疾病圖

圖3 PPI網(wǎng)絡圖

圖4 細胞組成

圖5 分子功能

圖6 生物學過程

討 論

柴胡和郁金在臨床上作為治療卒中后抑郁經常出現(xiàn)的藥物，具有疏肝解郁，調節(jié)人體氣機升降的功能。有關藥理學研究也證實“柴胡-郁金”內含有多種單體成分能夠對抑郁起到治療作用[11，12]。通過藥物-成分-靶點-疾病圖，得到柴胡潛在化合物為異鼠李素、茵陳黃酮、槲皮素、豆甾醇、3，5，6，7-四甲氧基-2-（3，4，5-三甲氧基苯基）色酮，郁金潛在化合物為β-谷固醇、柚皮素。柴胡中的多種化合物屬于黃酮類化合物，近些年隨著人們對黃酮類化合物的研究，發(fā)現(xiàn)他對中樞系統(tǒng)具有顯著影響，具有神經保護、抗抑郁、抗焦慮的作用[13]，N. SAMAD等[14]通過將槲皮素溶于25%乙醇溶液中，實驗組抑郁小鼠予以注射，對照組只注射25%乙醇，研究結果表明槲皮素逆轉了小鼠的應激引起的抑郁和焦慮；柚皮素屬于類黃酮化合物，具有很強的抗氧化和抗炎作用，動物研究表明[15]柚皮素減少了小鼠靜止時間，增加了社會探索偏好，表明具有抗抑郁的活性。柚皮素通過增強膽堿能傳遞、抗氧化防御系統(tǒng)、抑制脂質過氧化和亞硝化過程的機制，實現(xiàn)功能行為效應和神經精神疾病的預防。PPI網(wǎng)絡中潛在核心靶點為IL6、AKT1、VEGFA、CRP、CCL2、MMP9、SERPINE1，IL6（白細胞介素-6）和CRP（C反應蛋白）同屬于炎性細胞因子，有研究表明，卒中急性期炎性細胞因子水平增高，并且炎性細胞因子水平和PSD的發(fā)生率成正相關，提示IL6、CRP可能在卒中后抑郁的發(fā)病機制中起重要作用，而藥物可能通過該靶點作用于疾病而起到治療效果[16]。VEGFA（血管內皮生長因子A）屬于神經營養(yǎng)因子（NF）家族中的一種，對神經細胞的再生以及神經系統(tǒng)的發(fā)育起著重要作用，可以誘導內皮細胞增生分化，進而促使新血管生成及側支循環(huán)的建立[17]。AKT1屬于AKT家族中的一員，屬于蛋白激酶，是神經元存活的關鍵因子，有研究提出[18]AKT1基因參與調節(jié)人腦紋狀體多巴胺信號的過程，可以猜測AKT1通過調節(jié)多巴胺的含量來影響情緒，但尚缺乏大量證據(jù)。CCL2屬于趨化因子，因有使白細胞聚集的功能而得名，趨化因子的釋放還可刺激釋放炎癥細胞因子，進而影響PSD的發(fā)生。

圖7 KEGG代謝通路

GO生物過程提示“柴胡-郁金”靶點涉及炎性細胞因子信號通路、雌二醇的反應、上皮細胞凋亡、調節(jié)內皮細胞增殖等，這可能與卒中后抑郁發(fā)生的病理生理有關聯(lián)。雖然卒中后抑郁的發(fā)病機制尚不明確，大量研究表明[19]，炎性刺激因子可能為重要危險因素，并且與PSD的發(fā)生成正相關；雌二醇是由卵巢成熟濾泡分泌的一種自然雌激素，而雌激素是有效的情緒調節(jié)器，能夠調節(jié)5-HT的含量和保護神經，促進神經再生，起到抗抑郁作用[20]。KEGG代謝通路提示“柴胡-郁金”主要通過糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE途徑、腫瘤途徑、血清素能途徑等途徑發(fā)揮作用，血清素（5-HT）是中樞神經系統(tǒng)的傳遞物質，在海馬區(qū)內調節(jié)膜電位、興奮性和抑制性突觸傳遞，位于突觸前膜的5-HT轉運體通過再攝取突觸間隙的5-HT而在代謝及功能精細調節(jié)中起關鍵作用[21]。由此可以猜測“柴胡-郁金”其中成分可能通過5-HT轉運通路，來影響雌激素合成，進而起到治療作用。AGE-RAGE[22]細胞通路中，AGE是細胞因子，RAGE是受體，AGE通過其受體RAGE發(fā)出信號以激活NF-kB細胞程序，NF-kB受到激活后進而影響TNF-α，IL-1、 IL-2、IL-6等從而產生炎癥。

綜上，“柴胡-郁金”對卒中后抑郁的治療為多成分、多靶點、多通路，通過網(wǎng)絡藥理學發(fā)現(xiàn)靶點之間可以相互作用，而且許多靶點雖然度值非常低，也能起很大的作用，這為后來的研究提供了新的參考方向。