基于HPLC-MS/MS快速篩選阿卡波糖及其類(lèi)似物的菌株

賴曉紅，李 敏，周 燕，夏 兵

(中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，四川 成都 610041)

糖尿病是一種代謝性疾病，同腫瘤、心血管疾病成為威脅人類(lèi)健康的三大疾病。我國(guó)是糖尿病上升率最快的國(guó)家，目前是糖尿病患病第二大國(guó)。糖尿病已被國(guó)家列為“新藥創(chuàng)制科技重大專(zhuān)項(xiàng)”的十大類(lèi)疾病之一，降糖藥物的研究日益重要。α-葡萄糖苷酶抑制劑是通過(guò)可逆性地抑制小腸絨毛粘膜細(xì)胞刷狀緣的α-葡萄糖苷酶對(duì)二糖或寡糖1→4糖苷鍵的水解作用，從而達(dá)到降低餐后血糖水平的效果[1]。臨床上應(yīng)用α-葡萄糖苷酶抑制劑的代表性藥物主要有阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇和乙格列脂[2]，其中以阿卡波糖的應(yīng)用最為廣泛[3]。

阿卡波糖是游動(dòng)放線菌產(chǎn)生的一種具有α-葡萄糖苷競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)是C7N-氨基環(huán)醇類(lèi)的假性四糖物質(zhì)[4]。Mahmud[5]指出，具有C7N-氨基環(huán)醇結(jié)構(gòu)的大多數(shù)化合物均顯示出有效的α-葡萄糖苷酶抑制作用，如阿卡波糖、脂肪族素、支鏈淀粉抑素、低聚他汀。其中，氨基環(huán)醇和4-氨基-4,6-二脫氧葡萄糖組成的二單元是其顯示活性的核心結(jié)構(gòu)[6]。因此，具有相同核心結(jié)構(gòu)的阿卡波糖類(lèi)似物大多數(shù)也具有α-葡萄糖苷酶抑制劑的作用[7]。阿卡波糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成較為困難、成本較高、收率較低，主要依靠生物發(fā)酵法獲取阿卡波糖[8]。

目前，國(guó)內(nèi)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)阿卡波糖的發(fā)酵水平較低、成本高、規(guī)模小，如果有高效的方法篩選高產(chǎn)量的阿卡波糖產(chǎn)生菌，則會(huì)大大降低阿卡波糖的生產(chǎn)成本。目前報(bào)道的篩選阿卡波糖發(fā)酵液的方法主要有薄層層析法(TLC)[9]、高效液相色譜法(HPLC)[10]和基于α-葡萄糖苷酶抑制劑活性的篩選方法[11-13]，如吡喃葡萄糖苷比色(PNPG)法[14]。未見(jiàn)基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法從阿卡波糖發(fā)酵液中篩選阿卡波糖菌株的報(bào)道。本文擬通過(guò)優(yōu)化串聯(lián)質(zhì)譜條件，建立HPLC-MS/MS法篩選阿卡波糖產(chǎn)生菌，希望為推動(dòng)阿卡波糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)方案。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UPLC/Xevo TQ超高效液相色譜-質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；甲醇(HPLC級(jí))：美國(guó)Fisher Scientific公司產(chǎn)品；超純水：由PCWJ-10超純水機(jī)制得；WCX型陽(yáng)離子型交換固相萃取柱：納譜分析技術(shù)有限公司產(chǎn)品；阿卡波糖對(duì)照品：成都攜進(jìn)生物科技有限公司產(chǎn)品；阿卡波糖雜質(zhì)A、阿卡波糖雜質(zhì)D：實(shí)驗(yàn)室自制，純度大于98%。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1色譜條件 Waters CORTECS UPLC C18+色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.6 μm)；流動(dòng)相：水(A)和甲醇(B)；梯度洗脫條件：0～2 min(5%B)，2～12 min(5%～95%B)，12～17 min(95%B)，17～18 min(95%～5%B)，18～20 min(5%B)；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

1.2.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子檢測(cè)模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描，毛細(xì)管電壓2.5 kV，錐孔電壓30 V，離子源溫度150 ℃，錐孔氣(氮?dú)?流速50 L/h，脫溶劑氣流速500 L/h，脫溶劑氣溫度550 ℃。

1.3 阿卡波糖菌株的培育

分別取位于成都沙河大橋旁的河邊、菜地、番茄地中適量的土壤，共采集20 g樣品。將采集的土壤翻曬自然干燥7天，稱取1 g干燥后的土壤，加入100 mL生理鹽水中，分別在40、50、60、70、80 ℃下水浴加熱20 min[9]，不加熱的土壤樣品作為空白對(duì)照，用無(wú)菌生理鹽水將樣品稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等6個(gè)濃度，接種高氏培養(yǎng)基培育7天，以10%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱，以200 r/min搖瓶培養(yǎng)7天，得實(shí)驗(yàn)用阿卡波糖發(fā)酵液[15]。

1.4 溶液配制

1.4.1對(duì)照溶液的配制 分別精密稱取適量的阿卡波糖、阿卡波糖雜質(zhì)A、阿卡波糖雜質(zhì)D對(duì)照品，加入甲醇超聲溶解后，再加入20 μL 0.1 g/L NaCl水溶液，于12 000 r/min離心7 min，取上層液體，即得對(duì)照品溶液。

1.4.2供試品溶液的配制 分別使用乙腈、超純水淋洗陽(yáng)離子型固相萃取小柱，加入1～2 mL發(fā)酵液原樣，過(guò)濾得濾液，將處理過(guò)的發(fā)酵液稀釋約30倍(即取30 μL發(fā)酵液加超純水稀釋至1 mL)，于12 000 r/min離心7 min，取上層清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 阿卡波糖及其類(lèi)似物的質(zhì)譜裂解

2.1.1正負(fù)離子模式的選擇 本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了阿卡波糖、阿卡波糖雜質(zhì)A、阿卡波糖雜質(zhì)D的質(zhì)譜分析，結(jié)果表明，阿卡波糖在正離子模式下產(chǎn)生的碎片離子及其強(qiáng)度優(yōu)于負(fù)離子模式，故采用正離子模式。

2.1.2特征離子碎片 阿卡波糖及其類(lèi)似物的母離子[M+H]+在一定的碰撞能量下均會(huì)產(chǎn)生m/z304.1特征碎片。阿卡波糖及其雜質(zhì)A、D的二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖1。

2.1.3質(zhì)譜裂解規(guī)律 正離子模式下，阿卡波糖對(duì)照品的準(zhǔn)分子離子峰為m/z646.3，給予其30 eV的能量碰撞誘導(dǎo)解離，主要裂解途徑為優(yōu)先失去1個(gè)麥芽糖產(chǎn)生碎片離子m/z304.1，進(jìn)一步碎裂再失去1個(gè)不飽和環(huán)醇，產(chǎn)生碎片離子m/z146.1。阿卡波糖雜質(zhì)A比阿卡波糖更容易丟失1分子H2O生成碎片離子m/z628.2，阿卡波糖丟失末端1個(gè)糖單元，產(chǎn)生碎片離子m/z466.2，若碎片離子m/z304.1進(jìn)一步丟失1分子H2O，則產(chǎn)生碎片離子m/z286.1。阿卡波糖雜質(zhì)A和雜質(zhì)D具有與阿卡波糖相同的C7N單元和相似的裂解途徑，示于圖2。

2.2 阿卡波糖及其類(lèi)似物的篩選方法

超高效液相色譜以甲醇和水為流動(dòng)相，樣品經(jīng)梯度洗脫后進(jìn)入質(zhì)譜分析。以阿卡波糖及其類(lèi)似物的對(duì)照品二級(jí)質(zhì)譜圖為依據(jù)，在正離子模式下掃描分析物。阿卡波糖類(lèi)似物具有相同的C7N單元，有報(bào)道[5]證明，具有相同的C7N單元都能產(chǎn)生m/z304.1子離子碎片。因此，可以利用這一質(zhì)譜特征對(duì)阿卡波糖及其類(lèi)似物進(jìn)行篩查。

由于未進(jìn)行針對(duì)性的發(fā)酵條件優(yōu)化，發(fā)酵液中阿卡波糖及其類(lèi)似物的濃度較低，代謝產(chǎn)物復(fù)雜，為了提高檢測(cè)靈敏度，采用靈敏度較高的MRM掃描模式。以阿卡波糖及其類(lèi)似物的準(zhǔn)分子離子為母離子，以其共有的m/z304.1為子離子，在MRM模式下對(duì)阿卡波糖及其類(lèi)似物進(jìn)行掃描，觀察是否檢測(cè)到對(duì)應(yīng)化合物的峰，以此判斷發(fā)酵液中是否存在相應(yīng)化合物。阿卡波糖及其類(lèi)似物的母離子及特征碎片離子列于表1。阿卡波糖對(duì)照品的UPLC-MS總離子流圖示于圖3，保留時(shí)間為4.5 min。

2.3 阿卡波糖菌株的篩選

以m/z646.3為母離子，m/z304.1為子離子的MRM掃描模式分析阿卡波糖發(fā)酵液，通過(guò)對(duì)比保留時(shí)間鑒定發(fā)酵液中是否含有阿卡波糖及其類(lèi)似物。本實(shí)驗(yàn)篩選了來(lái)自于河邊、菜地和番茄地土壤的20種發(fā)酵液。在編號(hào)為AB/F-01樣品中，MRM掃描模式下總離子流圖的相應(yīng)保留時(shí)間處有疑似阿卡波糖或阿卡波糖雜質(zhì)A的譜峰(化合物1)。在阿卡波糖雜質(zhì)的篩選中，編號(hào)為HE2-1C的發(fā)酵液中篩選到疑似阿卡波糖雜質(zhì)D的譜峰(化合物2)，保留時(shí)間為1.8 min，強(qiáng)度較小。AB/F-01和HE2-1C發(fā)酵液的總離子流圖示于圖4。

圖1 阿卡波糖(a)、阿卡波糖雜質(zhì)A(b)、阿卡波糖雜質(zhì)D(c)的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.1 MS/MS spectra of acarbose (a), acarbose impurity A (b) and acarbose impurity D (c)

圖2 正離子模式下，阿卡波糖、阿卡波糖雜質(zhì)A和雜質(zhì)D的裂解途徑Fig.2 Fragmentation pathways of acarbose, acarbose impurity A, acarbose impurity D at positive ion mode

表1 阿卡波糖及其類(lèi)似物的母離子及特征碎片離子Table 1 Parent ions and characteristic product ions of acarbose and its analogs

圖3 MRM掃描模式下，阿卡波糖對(duì)照品的總離子流圖Fig.3 TIC of acarbose by MRM scanning at positive ion mode

2.4 阿卡波糖產(chǎn)生菌的確認(rèn)

阿卡波糖對(duì)照品和阿卡波糖雜質(zhì)A互為同分異構(gòu)體，普通C18反相色譜柱在該條件下無(wú)法實(shí)現(xiàn)兩者的分離，故本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了串聯(lián)質(zhì)譜分析，以確證目標(biāo)化合物1。在正離子模式下，其他質(zhì)譜參數(shù)與1.2.2節(jié)保持一致，分別對(duì)阿卡波糖對(duì)照品和樣品進(jìn)行子離子掃描，以碰撞能量為橫坐標(biāo)，碎片離子相對(duì)豐度為縱坐標(biāo)，繪制能量-豐度曲線圖。結(jié)果表明，以[M+H]+為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，兩者的能量曲線極為相似(見(jiàn)附圖S55～S56，請(qǐng)登錄《質(zhì)譜學(xué)報(bào)》網(wǎng)站http:∥www.jcmss.com.cn下載)，故選取[M+Na]+作為母離子。在38、40、42、44、46、48、50 eV 7個(gè)梯度的碰撞能量下，檢測(cè)阿卡波糖和阿卡波糖雜質(zhì)A的特征碎片離子m/z608.2、347.1、305.1、254.1的豐度，其能量-豐度曲線示于圖5。阿卡波糖與阿卡波糖雜質(zhì)A在結(jié)構(gòu)上的主要區(qū)別是胺基環(huán)醇末端糖單元的羥基和氧原子的位置，兩者在以[M+Na]+為母離子時(shí)，碎片離子存在較大差異。阿卡波糖對(duì)照品產(chǎn)生較大豐度的m/z608.2和m/z305.1，并且在44 eV時(shí)，m/z608.2相對(duì)豐度開(kāi)始減小；阿卡波糖雜質(zhì)A對(duì)照品m/z608.2和m/z305.1的整體豐度較低，變化趨勢(shì)較小，同時(shí)能產(chǎn)生特有的碎片離子m/z347.1，并且變化趨勢(shì)較大。

將發(fā)酵液樣品濃縮后，以[M+Na]+為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，選取m/z608.2、347.1、305.1、254.1繪制能量-豐度曲線，示于圖6。通過(guò)與阿卡波糖及阿卡波糖雜質(zhì)A對(duì)照品的能量曲線對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其與阿卡波糖的能量曲線極為相似，因此判斷樣品中化合物1為阿卡波糖。樣品中化合物2的含量較低，不足以進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，不能確定其是否一定是阿卡波糖雜質(zhì)D，有待培育出具有更高產(chǎn)率的阿卡波糖菌株進(jìn)行驗(yàn)證。

圖4 MRM掃描模式下，AB/F-01(a)和HE2-1C(b)發(fā)酵液的總離子流圖Fig.4 TIC of fermentation broth of AB/F-01 (a) and HE2-1C (b) by MRM scanning at positive ion mode

圖5 阿卡波糖(a)和阿卡波糖雜質(zhì)A(b)的能量-豐度曲線圖Fig.5 Energy-abundance curves of acarbose (a) and acarbose impurity A (b)

圖6 AB/F-01發(fā)酵液中化合物1的能量-豐度曲線圖Fig.6 Energy-abundance curves of compound 1 of AB/F-01

3 結(jié)論

本研究建立了HPLC-MS/MS法篩選不同來(lái)源阿卡波糖產(chǎn)生菌的發(fā)酵液，根據(jù)阿卡波糖及其類(lèi)似物的特征質(zhì)譜峰，結(jié)合其特有的二級(jí)離子碎片峰，歸納總結(jié)質(zhì)譜裂解規(guī)律。實(shí)驗(yàn)表明，子離子掃描能夠確定化合物的裂解途徑，提供化合物的能量曲線，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)的MRM掃描模式能定性鑒別化合物，兩者的結(jié)合使用能夠快速、高效、便捷地篩選不同來(lái)源發(fā)酵液中的阿卡波糖，并可以應(yīng)用于阿卡波糖類(lèi)似物的篩選。通過(guò)子離子峰可判斷子離子碎片中是否含有氮原子，進(jìn)而可粗略判斷該子離子和相應(yīng)化合物中是否有C7N單元。本研究為α-葡萄糖苷抑制劑新化合物的發(fā)現(xiàn)提供了實(shí)驗(yàn)思路，有利于α-葡萄糖苷抑制類(lèi)降糖藥的開(kāi)發(fā)。