克拉霉素及其雜質(zhì)KL和KO的電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析

蔣可志，金 勇，王兆剛，付君平，秦欣榮，侯仲軻，潘遠(yuǎn)江

(1.浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江 杭州 310007；2. 浙江國(guó)邦藥業(yè)有限公司，浙江 紹興 312369)

克拉霉素又稱6-O-甲基紅霉素A，學(xué)名為5-(4-二甲胺四氫-3-羥基-6-甲基-2-吡喃氧基)-6-甲氧基-11,12,13-三羥基-2,4,6,8,10,12-六甲基-9-氧代-3-(四氫-5-羥基-4-甲氧基-4,6-二甲基-2-吡喃氧基)十五烷酸-μ-內(nèi)酯，屬于14元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[1-2]?？死顾剡m用于鼻咽感染、下呼吸道感染、皮膚軟組織感染、急性中耳炎、肺炎、尿道炎及宮頸炎等感染癥狀的治療，對(duì)鏈球菌屬、肺炎球菌、葡萄球菌等革蘭陽(yáng)性菌的抗菌作用略優(yōu)于紅霉素，對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生的紅霉素耐藥菌株也具有一定的抗菌活性[3-5]。

克拉霉素屬于微生物類次級(jí)代謝產(chǎn)物衍生物，其存在大量雜質(zhì)，即使是全球最大的大環(huán)內(nèi)酯類原料藥生產(chǎn)商(浙江國(guó)邦藥業(yè)有限公司)所生產(chǎn)的克拉霉素藥品也存在需進(jìn)一步分析個(gè)別微量雜質(zhì)結(jié)構(gòu)。電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)具有快速、靈敏以及直接分析混合物等優(yōu)點(diǎn)，在雜質(zhì)結(jié)構(gòu)分析中受到重視[6-8]。

本工作擬對(duì)克拉霉素及其雜質(zhì)KL和KO進(jìn)行電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜研究，總結(jié)質(zhì)譜碎裂規(guī)律，以期為相關(guān)的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)推導(dǎo)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

Agilent 1260系列高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；micro TOF-QII電噴霧四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：德國(guó)Bruker公司產(chǎn)品。

1.2 樣品和試劑

克拉霉素(K)及其雜質(zhì)KL、KO：浙江國(guó)邦藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，化學(xué)結(jié)構(gòu)示于圖1。甲醇、甲酸：色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；水為去離子水，電阻率大于18.2 MΩ·cm；用于準(zhǔn)確質(zhì)量校正的PEG1000溶液由本實(shí)驗(yàn)室制備。

圖1 克拉霉素(a)及其雜質(zhì)KL(b)、KO(c)的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of clarithromycin (a) and its impurities KL (b), KO (c)

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

使用甲醇-水溶液(1∶1，V/V)將待測(cè)物溶解并稀釋至10 mg/L，通過(guò)注射泵以3 μL/min注入電噴霧離子源，在正離子模式下離子化，以PEG1000為外標(biāo)溶液對(duì)儀器進(jìn)行準(zhǔn)確質(zhì)量軸校正。儀器操作參數(shù)：霧化氣為氮?dú)?，壓?0 kPa；干燥氣為氮?dú)?，流? L/min；干燥氣溫度250 ℃；毛細(xì)管電壓-4.5 kV；在二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中，碰撞氣體為氬氣，目標(biāo)離子的質(zhì)量選擇窗口4 u，碰撞誘導(dǎo)解離(CID)碰撞能量18 eV。使用Analysis version 4 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.4 量化計(jì)算

量化計(jì)算軟件為Gaussian 03程序[9]，采用半經(jīng)驗(yàn)理論MP3基組進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和頻率計(jì)算。完成結(jié)構(gòu)優(yōu)化后，進(jìn)行反應(yīng)物、中間物和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)頻率計(jì)算時(shí)不存在虛頻；而過(guò)渡態(tài)結(jié)構(gòu)存在唯一的振動(dòng)虛頻和合理的振動(dòng)模式，并且通過(guò)內(nèi)稟反應(yīng)坐標(biāo)(IRC)計(jì)算確認(rèn)。本工作研究對(duì)象的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，存在許多構(gòu)象，為獲得相對(duì)最優(yōu)結(jié)構(gòu)，采用分子動(dòng)力學(xué)軟件對(duì)某一優(yōu)化結(jié)構(gòu)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模擬，獲得若干個(gè)初始優(yōu)化結(jié)構(gòu)，并將能量最低的結(jié)構(gòu)作為相對(duì)最優(yōu)結(jié)構(gòu)。本文采用電子和熱自由能的總和進(jìn)行能量討論，所優(yōu)化的結(jié)構(gòu)由Gaussview軟件(3.09版本)顯示。

2 結(jié)果與討論

2.1 克拉霉素的質(zhì)譜碎裂研究

克拉霉素原樣的液相色譜圖示于圖2，K及其雜質(zhì)KL和KO的出峰時(shí)間分別為12.71、9.92、17.17 min。經(jīng)ESI電離，K、KL和KO均容易產(chǎn)生[M+H]+，即m/z748.484 2、763.494 1、777.510 0，確定其化學(xué)式分別為C38H70NO13+、C38H71N2O13+和C39H73N2O13+。采用高分辨Q-TOF技術(shù)對(duì)[M+H]+離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，結(jié)果示于圖3，相關(guān)離子的質(zhì)荷比、豐度以及元素組成等信息列于表1。

以K為例解析質(zhì)譜碎裂規(guī)律?？死顾刭|(zhì)子化離子的質(zhì)譜碎裂類似于多肽的流動(dòng)質(zhì)子模式碎裂，帶電質(zhì)子可以在其柔性結(jié)構(gòu)中各堿性位點(diǎn)間遷移，當(dāng)帶電質(zhì)子遷移到解離質(zhì)子化位點(diǎn)時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)相應(yīng)的碎裂反應(yīng)[10-12]?？死顾亟Y(jié)構(gòu)中存在許多堿性位點(diǎn)，包括氨基N、羰基O、醚鍵O和羥基O。其中，氨基N和羰基O的氣相堿度明顯大于醚鍵O和羥基O，量化計(jì)算結(jié)果示于圖4?？死顾匕被鵑質(zhì)子化所形成的離子K5c的自由能比酮羰基O質(zhì)子化離子K1和酯羰基O質(zhì)子化離子K9的自由能分別低41.8、51.6 kJ/mol，表明克拉霉素的最優(yōu)質(zhì)子化位點(diǎn)在氨基N上。因此，克拉霉素經(jīng)ESI電離后，帶電質(zhì)子主要結(jié)合在氨基N上，形成質(zhì)子化離子K5c。經(jīng)碰撞活化后，克拉霉素質(zhì)子化離子中帶電質(zhì)子開始從氨基N向各解離質(zhì)子化位點(diǎn)遷移，并引發(fā)相應(yīng)碎裂。

圖2 克拉霉素原樣的液相色譜圖Fig.2 HPLC spectrum of the raw clarithromycin sample

注：碰撞能量18 eV圖3 克拉霉素(a)及其雜質(zhì)KL(b)、KO(c)的[M+H]+離子高分辨串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.3 Accurate MS/MS spectra of clarithromycin (a) and its impurities KL (b) and KO (c)

開環(huán)碎裂至少涉及2個(gè)化學(xué)鍵的斷裂，克拉霉素的大環(huán)內(nèi)脂骨架上只有1個(gè)解離質(zhì)子化位點(diǎn)(O原子)，故其不容易發(fā)生骨架開環(huán)碎裂，質(zhì)譜碎裂優(yōu)先發(fā)生在側(cè)鏈上，如大環(huán)骨架的6、5、3號(hào)位上的醚鍵O。

由于帶電質(zhì)子主要結(jié)合在大環(huán)骨架5號(hào)位吡喃環(huán)的氨基N上，故先從5號(hào)位側(cè)鏈基團(tuán)碎裂入手研究克拉霉素質(zhì)子化離子K5c的碎裂規(guī)律?？死顾毓羌苌?號(hào)位側(cè)鏈脫氧氨基糖苷基團(tuán)的質(zhì)譜斷裂存在2種途徑，示于圖5。在path-1中，K5c克服93.9 kJ/mol的能壘使其帶電質(zhì)子從氨基N遷移到5a位O原子上，形成異構(gòu)離子K5a，同時(shí)自由能增加82.2 kJ/mol。K5a只需跨越6 kJ/mol的能壘就可以發(fā)生i-斷裂，并通過(guò)丟失大環(huán)內(nèi)酯單元產(chǎn)生含吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的碎片離子K5a-P(m/z158.1)。在path-2中，K5c需克服106.6 kJ/mol的能壘使帶電質(zhì)子遷移到5b位O原子上，形成異構(gòu)離子K5b，同時(shí)自由能增加94.6 kJ/mol。K5b繼續(xù)克服17.2 kJ/mol的能壘發(fā)生電荷誘導(dǎo)的C—O鍵斷裂，從而產(chǎn)生異構(gòu)離子K5b2。K5b2繼續(xù)克服54.9 kJ/mol的能壘發(fā)生i-斷裂，引發(fā)脫氧氨基糖苷單元開環(huán)反應(yīng)，產(chǎn)生亞胺結(jié)構(gòu)碎片離子K5b-P(m/z116.1)，克拉霉素大環(huán)5號(hào)側(cè)鏈質(zhì)譜碎裂的反應(yīng)勢(shì)能面示于圖6。Path-1碎裂途徑的累積能壘為93.9 kJ/mol，遠(yuǎn)小于path-2的159.8 kJ/mol，表明path-1碎裂途徑更易發(fā)生，即碎片離子K5a-P豐度為100%，而K5b-P豐度僅為9.6%，與表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。

克拉霉素及其雜質(zhì)大環(huán)6號(hào)側(cè)鏈發(fā)生的質(zhì)譜碎裂途徑示于圖7。當(dāng)帶電質(zhì)子遷移到6a位的O原子上，形成異構(gòu)離子K6a。K6a發(fā)生電荷誘導(dǎo)的丟失甲醇反應(yīng)，產(chǎn)生碎片離子m/z716.5，其途徑為：1) 直接丟失形成碎片離子K6a-P1；2) 鄰基參與反應(yīng)，即5號(hào)位上吡喃環(huán)的鄰位羥基親核進(jìn)攻6號(hào)位C發(fā)生閉環(huán)反應(yīng)并丟失甲醇分子，產(chǎn)生碎片離子K6a-P2。在K6a-P1離子結(jié)構(gòu)中，正電荷定域在6號(hào)C上，而在K6a-P2離子結(jié)構(gòu)中，正電荷以帶電質(zhì)子的形式遷移到堿性位點(diǎn)上，其自由能比K6a-P1克拉霉素及其雜質(zhì)大環(huán)發(fā)生在3號(hào)側(cè)鏈上的質(zhì)譜碎裂途徑示于圖8。當(dāng)帶電質(zhì)子遷移到3a位O原子上，形成異構(gòu)離子K3a，存在2種碎裂途徑：1) 5號(hào)位側(cè)鏈糖基上的羥基O5d原子親核進(jìn)攻K3a的3號(hào)位側(cè)鏈糖基C3b原子，并發(fā)生O3a—C3b鍵斷裂，從而實(shí)現(xiàn)了3號(hào)位側(cè)鏈上糖基基團(tuán)的遷移，形成異構(gòu)體K3a2，K3a2上的帶電質(zhì)子遷移到O5a原子后發(fā)生i-斷裂，通過(guò)丟失大環(huán)內(nèi)酯單元產(chǎn)生碎片離子K3a-1P(m/z316.2)；2) 3號(hào)位側(cè)鏈糖基上的對(duì)位羥基O3c原子親核進(jìn)攻C3b原子，發(fā)生O3a—C3b鍵斷裂，產(chǎn)生離子-中性復(fù)合物K-INC，其是由丟失3號(hào)側(cè)鏈糖基的克拉霉素(K3a-2P)與帶雙環(huán)結(jié)構(gòu)的脫水吡喃糖類質(zhì)子化離子(3P)兩部分組成。K3a-2P結(jié)構(gòu)中含有叔胺N，其質(zhì)子親和勢(shì)高于3P，所以在K-INC分離之前，3P的帶電質(zhì)子遷移到K3a-2P的叔胺N上，然后產(chǎn)生碎片離子K3a-2P(m/z590.4)。K3a-2P與K5c結(jié)構(gòu)相似，也能發(fā)生丟失甲醇的碎裂反應(yīng)，產(chǎn)生碎片離子K3a-2P-P(m/z558.4)。

表1 克拉霉素及其雜質(zhì)的高分辨串聯(lián)質(zhì)譜圖中碎片離子信息Table 1 Accurate MS/MS data of clarithromycin and its impurities KL and KO

圖4 克拉霉素氨基N(a)和酮羰基O(b)、酯羰基O(c)質(zhì)子化離子的優(yōu)化結(jié)構(gòu)Fig.4 Optimized structures of the N-protonated and the carbonyl O-protonated clarithromycin

圖5 克拉霉素及其雜質(zhì)大環(huán)5號(hào)側(cè)鏈發(fā)生的質(zhì)譜碎裂途徑Fig.5 Fragmentation pathways of protonated K, KL and KO at the No.5 side chain group

圖6 克拉霉素大環(huán)5號(hào)側(cè)鏈質(zhì)譜碎裂的反應(yīng)勢(shì)能面Fig.6 Potential energy surface for fragmentation of protonated clarithromycin at the No.5 side chain group

圖7 克拉霉素及其雜質(zhì)大環(huán)6號(hào)側(cè)鏈發(fā)生的質(zhì)譜碎裂途徑Fig.7 Fragmentation pathways of protonated K, KL and KO at the No.6 side chain group

圖8 克拉霉素及其雜質(zhì)大環(huán)3號(hào)側(cè)鏈發(fā)生的質(zhì)譜碎裂途徑Fig.8 Fragmentation pathways of protonated K, KL and KO at the No.3 side chain group

2.2 克拉霉素雜質(zhì)KL和KO的質(zhì)譜碎裂反應(yīng)

雜質(zhì)KL和KO是克拉霉素分別與羥胺或甲氧基胺縮合反應(yīng)產(chǎn)生的，二者與克拉霉素具有非常相似的碎裂途徑：在高質(zhì)量區(qū)存在相同的特征中性丟失，如丟失CH4O(32 u)、C8H12O3(158 u)、(C8H12O3+CH4O)(190 u)；在低質(zhì)量區(qū)存在相同的碎片離子，如m/z316.2、158.1、116.1等。

此外，由于雜質(zhì)KL和KO大環(huán)結(jié)構(gòu)中肟基上的O是一個(gè)堿性位點(diǎn)，可以促進(jìn)帶電質(zhì)子在整個(gè)離子結(jié)構(gòu)中的遷移，并引發(fā)相應(yīng)的碎裂反應(yīng)，所以會(huì)產(chǎn)生更多的碎片離子。比如，雜質(zhì)KL質(zhì)子化離子在丟失3號(hào)側(cè)鏈基團(tuán)(KL3a-2P)后，還會(huì)繼續(xù)丟失5號(hào)側(cè)鏈基團(tuán)產(chǎn)生碎片離子m/z448.3(12.5%)；雜質(zhì)KO質(zhì)子化離子會(huì)連續(xù)丟失3號(hào)和5號(hào)側(cè)鏈基團(tuán)，產(chǎn)生碎片離子m/z462.3(1.4%)。

3 結(jié)論

本研究將串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)和量化計(jì)算相結(jié)合，系統(tǒng)地研究了克拉霉素及其雜質(zhì)KL和KO的質(zhì)譜碎裂規(guī)律。量化計(jì)算結(jié)果表明，克拉霉素結(jié)構(gòu)中的最優(yōu)質(zhì)子化位點(diǎn)為5號(hào)側(cè)鏈單元氨基N原子，其質(zhì)子化離子經(jīng)碰撞活化后發(fā)生一系列質(zhì)子遷移和側(cè)鏈基團(tuán)的碎裂反應(yīng)：1) 帶電質(zhì)子分別遷移到5號(hào)側(cè)鏈基團(tuán)O5a和O5b上，引發(fā)丟失大環(huán)內(nèi)酯單元或脫氧氨基糖苷開環(huán)反應(yīng)，產(chǎn)生特征離子5a-P(m/z158.1)和5c-P(m/z116.1)；2) 帶電質(zhì)子遷移到6號(hào)側(cè)鏈基團(tuán)O6，并引發(fā)丟失甲醇，產(chǎn)生碎片離子6a-P；3) 帶電質(zhì)子遷移到3號(hào)側(cè)鏈基團(tuán)O3a，引發(fā)由5號(hào)側(cè)鏈單元O5d親核取代而導(dǎo)致吡喃糖單元遷移，并丟失大環(huán)內(nèi)酯單元產(chǎn)生特征離子3a-1P(m/z316.2)，也可發(fā)生由對(duì)位羥基O3c親核取代引發(fā)的吡喃糖單元丟失碎裂，產(chǎn)生特征離子3a-2P，并繼續(xù)丟失甲醇分子產(chǎn)生特征離子3a-2P-P。本研究可為相關(guān)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)推導(dǎo)提供參考。