蘆薈素通過激活ERK1/2-Runx 2信號通路介導(dǎo)對去卵巢大鼠骨量流失的保護(hù)作用

沙仁高娃 陳華

1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，青海 西寧 810000 2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤婦科，青海 西寧 810000

骨質(zhì)疏松癥是一種系統(tǒng)性骨骼疾病，其特征是骨量低和骨組織的微結(jié)構(gòu)退化，導(dǎo)致骨骼脆弱和骨折風(fēng)險增加[1]。骨質(zhì)疏松癥的主要原因是骨形成和骨吸收之間的不平衡，這是由成骨細(xì)胞的失活和破骨細(xì)胞活性的增加所致。目前主要預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的藥物有兩種：抗吸收藥和促合成代謝藥。由于雙膦酸鹽類藥物具有減慢骨吸收的功效，因此它們被廣泛用于治療骨質(zhì)疏松癥，而包括人甲狀旁腺素在內(nèi)的合成代謝藥物則可刺激骨形成。然而，長期使用這些藥物會具有某些局限性和副作用[2-3]。蘆薈素(LHS)是從常綠多年生植物蘆薈中提取的蒽醌糖基化合物[4]，已被證明具有有效的抗腫瘤、抗炎、抗結(jié)腸炎和抗氧化活性[5-6]作用。最近的一項研究[6]發(fā)現(xiàn)，LHS可以在MC3T3-E1細(xì)胞中促進(jìn)成骨分化調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，例如BMP-2(骨形態(tài)發(fā)生蛋白2)和Runx 2(Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2)。然而，尚未有LHS對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥療效的研究。因此，本研究的目的是使用LHS干預(yù)觀察其對去卵巢大鼠骨量的影響，并初步探討可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

將30只3月齡的雌性Sprague Dawley(SD)大鼠[(250±30) g，購于北京動物實驗中心)]適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，隨后對30只雌性大鼠進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除術(shù)(n=20)及假手術(shù)(n=10)。手術(shù)后大鼠被隨機(jī)分為3組(每組10只)：去卵巢組(OVX)、假手術(shù)組(Sham)和去卵巢大鼠接受蘆薈素治療組(LHS)；其中LHS組大鼠每天接受50 mg/kg蘆薈素(純度>98%，購于Sigma-Aldrich)治療，其余組大鼠接受生理鹽水治療。治療12周后，處死所有動物收集雙側(cè)股骨進(jìn)行檢測。

1.2 方法

1.2.1Micro-CT檢測：使用SkyScan 1076型號Micro-CT(SkyScan,Aartselaar,Belgium)對大鼠左側(cè)股骨遠(yuǎn)端的松質(zhì)骨骨小梁進(jìn)行3D分析。Micro-CT設(shè)備包括一個焦點(diǎn)為9 μm的微型X射線管，可產(chǎn)生由電荷耦合器件陣列和轉(zhuǎn)臺檢測到的扇形束，并可以沿軸向自動移動。選擇能量和強(qiáng)度分別等于40 kVp和250 μA。在原始3D圖像上，直接根據(jù)感興趣的區(qū)域(VOI)確定形態(tài)計量指標(biāo)，該體積僅限于直徑為1.5 mm的內(nèi)圓柱和整個股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨骨小梁，不包括距骺線2 mm遠(yuǎn)端的區(qū)域。通過計算以下3D形態(tài)參數(shù)來描述骨骼質(zhì)量和微觀結(jié)構(gòu)：骨密度(BMD，g/cm2)、骨小梁厚度(Tb.th)、骨小梁體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)和骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.2.2組織學(xué)檢測：將右側(cè)股骨在中性緩沖的10 %甲醛溶液中固定5 d，并在10 %乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)中脫鈣1個月，然后用手術(shù)刀從矢狀面中段分開并包埋在石蠟中。最后將樣品在矢狀面切成5 μm厚的切片，放在顯微鏡載玻片上，并用Van Gieson(VG)染色以進(jìn)行光學(xué)顯微鏡檢查。

1.2.3生物力學(xué)評估：使用Instron 4302系統(tǒng)對左側(cè)股骨(每組n=5)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實驗評估。將股骨放在材料檢測機(jī)支架上，兩個支架之間的距離為1.5 mm，測試區(qū)域定義為股骨的最中央部分。以2 mm/min的速度施加壓縮載荷直至骨折。通過連接的計算機(jī)監(jiān)控骨折時的最大載荷(N)和彈性模量(mm2)的數(shù)據(jù)。

1.2.4蛋白印記檢測：用RIPA緩沖液(Thermo Fisher Science)制備股骨遠(yuǎn)端骨組織裂解物，然后12 000g離心15 min以去除組織碎片。用BCA蛋白分析試劑盒(Beyotime)測定蛋白質(zhì)濃度。在10 %或12 %十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳膠上分離總蛋白(20 μg)，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。在含有5 %脫脂奶粉的TBS中封閉1 h，然后在4 ℃下與p-Erk1/2、Erk1/2、ALP、RUNX 2、OCN和OPN (購于Cell Signing Technology)一抗體孵育過夜，最后用TBST清洗膜，并與二次抗體孵育1 h。使用ECL試劑 (Thermo Fisher Science)檢測抗體反應(yīng)條帶，使用ImageJ軟件定量分析條帶強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計分析采用單因素方差分析(ANOVA)，然后進(jìn)行Student’t檢驗。結(jié)果使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。P<0.05表示比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Micro-CT結(jié)果分析

股骨干骺端骨小梁二維圖像如圖1 A所示。股骨干骺端的微觀參數(shù)如圖1B～圖1F所示。OVX組左側(cè)股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th較Sham組明顯降低，而Tb.Sp則明顯升高(P<0.05)。LHS組左側(cè)股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯高于OVX組(P<0.05)，而Tb.Sp則明顯低于OVX組(P<0.05)。

圖1 三組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測結(jié)果A：股骨干骺端骨小梁二維圖像；B：骨密度；C：Tb.Th；D：Tb.N；E：Tb.Sp；F：BV/TV。注：與Sham組相比，*P<0.05;與OVX組相比，#P<0.05。Fig.1 Micro-CT test results of the femoral metaphysis in the three groups of rats

2.2 股骨組織病理學(xué)

股骨干骺端骨小梁組織切片如圖2所示，Sham組大鼠股骨干骺端骨小梁致密，骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)正常；OVX組大鼠骨小梁疏松變薄，導(dǎo)致骨小梁間隙變寬；LHS組大鼠的骨小梁數(shù)量和連接增加明顯，表現(xiàn)出明顯的結(jié)構(gòu)恢復(fù)。

圖2 三組股骨的組織病理學(xué)a:Sham組;b:OVX組;c:LHS組。注：VG染色(放大倍數(shù)，×10)。Fig.2 Histopathology of femurs in the three groups

2.3 股骨的生物力學(xué)變化

股骨三點(diǎn)彎曲試驗表明，Sham組的最大載荷和彈性模量均高于OVX組，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，LHS組的最大載荷和彈性模量均高于OVX組(P<0.05)，見圖3。

圖3 右股骨的三點(diǎn)彎曲試驗結(jié)果注：與Sham組相比，*P<0.05;與OVX組相比，#P<0.05。Fig.3 Three-point bending test results of the right femur of rats

2.4 WB檢測結(jié)果

圖4 WB檢測結(jié)果A:WB檢測各種蛋白的相對表達(dá);B:RUNX 2;C:OCN;D:OPN;E:ALP;F:Erk1/2;G:p-Erk1/2。注：與Sham組相比，*P<0.05;與OVX組相比，#P<0.05。Fig.4 WB test results

和Sham組比較，OVX組p-Erk1/2、Erk1/2、ALP、RUNX 2、OCN和OPN表達(dá)水平明顯下調(diào)，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。和OVX組比較，LHS組p-Erk1/2、Erk1/2、ALP、RUNX 2、OCN和OPN表達(dá)水平明顯上調(diào)，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

蘆薈素不僅具有促進(jìn)傷口愈合的作用，還具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗過敏作用[5]。最近的研究[4]表明，蘆薈素是RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中破骨細(xì)胞生成和骨吸收的有效抑制劑，還可以通過MAPK和Wnt途徑增強(qiáng)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨性[4]。但是，蘆薈素對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用目前尚不清楚。本研究的目的是研究蘆薈素對去卵巢大鼠股骨骨強(qiáng)度、骨密度和骨小梁微觀結(jié)構(gòu)的影響。

Micro-CT結(jié)果顯示，OVX組的BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th最低，而TbSp最高。而蘆薈素可以顯著改善BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp。組織病理結(jié)果進(jìn)一步證實了蘆薈素可以改善骨小梁的微結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果表明，蘆薈素可以顯著增加去卵巢雌性大鼠的骨量，并改善其骨小梁的微結(jié)構(gòu)。三點(diǎn)彎曲試驗結(jié)果表明，去卵巢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠最大負(fù)荷和彈性模量均明顯降低，蘆薈素可以顯著改善上述指標(biāo)，并可以顯著改善股骨的生物力學(xué)性能、增強(qiáng)其機(jī)械強(qiáng)度。

本研究進(jìn)一步通過蛋白印記檢測骨組織p-Erk1/2、Erk1/2、ALP、RUNX 2、OCN和OPN表達(dá)情況。在一項使用MC3T3-E1細(xì)胞系的研究[7]中，蘆薈素在初始階段通過增加ALP的產(chǎn)生并在后期階段通過礦化來刺激成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)過程。本研究表明蘆薈素能促進(jìn)骨組織中成骨相關(guān)基因(ALP、OCN和OPN)的表達(dá)。RUNX 2是成骨細(xì)胞分化和骨形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入成骨細(xì)胞譜系的過程中起著重要作用；當(dāng)受到連續(xù)的機(jī)械刺激或用熱激蛋白70處理時，間充質(zhì)干細(xì)胞可以被誘導(dǎo)成骨，這依賴于ERK1/2-Runx 2信號通路[8]。據(jù)報道，ERK1/2通路參與成骨的調(diào)節(jié)，成骨細(xì)胞分化過程中RUNX 2的穩(wěn)定需要ERK1/2磷酸化[9]。為了確認(rèn)ERK1/2途徑是否參與蘆薈素介導(dǎo)對去卵巢大鼠骨量保護(hù)作用，本研究進(jìn)一步觀察了蘆薈素對骨組織ERK1/2表達(dá)情況。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，在蘆薈素干預(yù)的情況下，p-ERK1/2和RUNX 2表達(dá)水平顯著上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明蘆薈素能促進(jìn)ERK1/2的磷酸化，進(jìn)而上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子RUNX 2的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨作用。

總之，本研究首次證明了蘆薈素可以通過ERK1/2-Runx2信號通路促進(jìn)去卵巢大鼠成骨，防止去卵巢大鼠骨量、骨密度和骨強(qiáng)度的降低。蘆薈素可能成為治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的潛在藥物。