血清lncRNA HULC水平與乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系

（焦作市人民醫(yī)院 普外二區(qū)，河南 焦作 454002）

乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌（以下簡(jiǎn)稱：乙肝相關(guān)性肝癌）的臨床診斷及預(yù)后評(píng)估多以甲胎蛋白（AFP）結(jié)合影像學(xué)檢查為主，而AFP對(duì)診斷肝癌的預(yù)后評(píng)估的敏感度較低[1-3]，因此，尋找敏感度高、特異度強(qiáng)的血清學(xué)標(biāo)志物對(duì)于乙肝相關(guān)性肝癌的預(yù)后評(píng)估顯得尤為重要[4-6]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，lncRNA HULC（highly up-regulated in liver cancer）是一種在肝癌中發(fā)現(xiàn)的特異性高表達(dá)的lncRNA，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，是潛在的肝癌標(biāo)志物[7-8]。本研究主要研究血清lncRNA HULC水平與乙肝相關(guān)性肝癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系，并分析血清lncRNA HULC水平與患者術(shù)后生存預(yù)后的相關(guān)性，旨在為肝癌的預(yù)后情況尋找新指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 病歷資料

收集我院2007年6月—2017年9月接受手術(shù)治療的乙肝相關(guān)性肝癌患者術(shù)前血清標(biāo)本及術(shù)后的石蠟標(biāo)本各30例，其中I～I(xiàn)I期21例，III期9例；高中分化17例，低分化13例。所有病例均有完整臨床資料。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

入選標(biāo)準(zhǔn)：病理學(xué)確診為肝細(xì)胞癌患者，均為乙型肝炎病毒感染者，臨床病理資料完整；術(shù)后有隨訪數(shù)據(jù)，所有病例癌腫均手術(shù)切除。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝轉(zhuǎn)移癌者，術(shù)前接受過(guò)放化療或生物治療者，術(shù)后無(wú)隨訪數(shù)據(jù)者，合并其他惡性腫瘤者。

1.3 試劑與儀器

RNA提取和分離試劑盒（Ambion，美國(guó)），RiboLock RNA酶抑制劑（Fermentas，深圳）；VEGF、MMP-2、E-Cadherin兔抗人抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司；ABC免疫組化試劑盒與DAB組化染色試劑套裝購(gòu)于天津麥蘭伯公司。組織蠟塊切片機(jī)購(gòu)于德國(guó)Leica公司，熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)）。

1.4 研究方法

1.4.1 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)按文獻(xiàn)[9]方法，RNA 提取試劑盒說(shuō)明提取患者血清總RNA，引物設(shè)計(jì)序列（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成）。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 作為模板，按照熒光定量PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)配置PCR 體系，然后上機(jī)。

1.4.2 免疫組化實(shí)驗(yàn)按文獻(xiàn)[10-11]方法，各組肝臟組織采用4% 中性等滲甲醛溶液固定，病理科標(biāo)準(zhǔn)梯度酒精脫水、二甲苯透明，以制作組織蠟塊標(biāo)本，然后切片，采用免疫組織化學(xué)染色步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：將石蠟切片進(jìn)行脫蠟、高溫抗原修復(fù)、滴加相應(yīng)抗體、DAB 染色及封片，然后鏡檢拍照等。

1.5 觀察指標(biāo)與結(jié)果判定

1.5.1 lncRNA HULC含量測(cè)定按文獻(xiàn)[12]方法，目的基因量=2-ΔΔCT，ΔΔCT=（CTlncRNAHULC-CTGAPDH）實(shí)驗(yàn)-（CTlncRNAHULC-CTGAPDH）對(duì)照，把所得到的CT值還原為目的基因的量。結(jié)果用ABI 自帶軟件分析。

1.5.2 免疫組化陽(yáng)性結(jié)果判定按文獻(xiàn)[13]方法，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)VEGF、MMP-2、E-Cadherin 在肝細(xì)胞癌組織與正常肝組織中的表達(dá)情況。VEGF、MMP-2、E-Cadherin 可以表達(dá)于細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)，染色呈棕黃色視為陽(yáng)性。依據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率判斷染色結(jié)果：弱陽(yáng)性、中等陽(yáng)性與強(qiáng)陽(yáng)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。樣本率的比較用χ2檢驗(yàn)。獨(dú)立樣本的比較采用t檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法，差異性檢驗(yàn)采用Gehan-Breslow-Wilcoxon檢驗(yàn)，Cox多因素回歸分析對(duì)生存預(yù)后獨(dú)立影響因素進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料

30例乙肝相關(guān)性肝癌患者的一般資料見(jiàn)表1。年齡＜60歲與≥60歲的乙肝相關(guān)性肝癌患者均為15例（50.0%）；男性患者23例（76.7%），女性患者7例（23.3%）；對(duì)患者術(shù)前AFP進(jìn)行分析，其中≥400μg/L病例數(shù)24例（80.0%），＜400μg/L患者6例（2 0.0%）合并肝硬化的患者2 5例（83.3%），無(wú)肝硬化的患者5例（16.7%）；腫瘤≥5 cm患者16例（53.3%），＜5 cm患者14例（46.7%）。

2.2 肝癌患者血清lncRNA HULC水平分布

乙肝相關(guān)性肝癌患者血清lncRNA HULC相對(duì)水平范圍為2.6～9.5，本文以中位值5.0為分界線，將患者分為高lncRNA HULC組（12例）和lncRNA HULC高水平組（18例）（圖1）。

表1 患者一般資料Table1 General information of the patients

圖1 患者血清lncRNA HULC水平Figure1 Serum lncRNA HULC levels of the patients

2.3 血清lncRNA HULC水平與患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

低lncRNA HULC組患者病理高分化比例高于高lncRNA HULC 組患者；高lncRNA HULC組患者III～I(xiàn)V期比例高于低lncRNA HULC組患者；低lncRNA HULC組患者肝內(nèi)轉(zhuǎn)移與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移例數(shù)均比例低于高lncRNA HULC組患者；高lncRNA HULC組患者肝癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)比例高于低lncRNA HULC組患者，兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（表2）。

表2 血清lncRNA HULC水平與患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系[n（%）]Table2 Association of serum lncRNA HULC level with clinicopathologic features of the patients [n (%)]

2.4 血清lncRNA HULC水平與乙肝相關(guān)性肝癌組織中標(biāo)記物的關(guān)系

與低lncRNA HULC組比較，高lncRNA HULC組患者的癌組織中VEGF、MMP-2陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，而E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)明顯減少。結(jié)果說(shuō)明，患者血清lncRNA HULC處于高水平時(shí)，其癌組織內(nèi)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物VEGF、MMP-2陽(yáng)性表達(dá)增加，而抑制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物E-cadherin 陽(yáng)性表達(dá)減少（圖2）。

2.5 血清lncRNA HULC水平與患者生存預(yù)后的關(guān)系

低lncRNA HULC組患者生存中位數(shù)為44個(gè)月，高lncRNA HULC組患者生存中位數(shù)為23個(gè)月，低lncRNA HULC組患者生存率高于高lncRNA HULC組患者（P＜0.05）（圖3A）。高lncRNA HULC組患者肝癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)比例高于低lncRNA HULC組患者，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3B）。同時(shí)采用Cox多因素模型分析影響乙肝相關(guān)性肝癌患者生存預(yù)后的因素，將單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的單因素，包括腫瘤分化程度、TNM分期、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移情況及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移進(jìn)行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，結(jié)果顯示，術(shù)前血清lncRNA HULC水平是影響乙肝相關(guān)性肝癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立影響因素（OR=1.769，P=0.045）（表3）。

圖3 Kaplan-Meier曲線分析 A：不同血清lncRNA HULC水平患者的生存率；B：不同血清lncRNA HULC水平患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率Figure3 Kaplan-Meier curve analysis A:The survival rates of patients with different serum lncRNA HULC levels;B:The postoperative recurrence rates of patients with different serum lncRNA HULC levels

表3 影響乙肝相關(guān)性肝癌患者生存的Cox 多因素分析Table3 Multivariate Cox analysis of factors affecting the survival of patients with HBV-related HCC

3 討 論

乙肝相關(guān)性肝癌在我國(guó)是常見(jiàn)的惡性腫瘤，其病死率高[14-17]。腫瘤診斷及治療靶點(diǎn)是在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用的分子[18-20]。乙肝相關(guān)性肝癌診斷及預(yù)后判定的方法主要包括肝穿病理學(xué)、影像學(xué)檢查等，然而這些方法不適用于大規(guī)模篩查，尤其是對(duì)肝癌的早期診斷。因此，探索敏感度與特異度強(qiáng)的生物標(biāo)志物是肝癌診治及預(yù)后判斷的重點(diǎn)研究方向[21-23]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)[24-25]，血清非編碼RNA作為腫瘤生物標(biāo)記物具有明顯優(yōu)勢(shì)，在血清中具有一定的豐度、穩(wěn)定性好、敏感度高等特點(diǎn)。研究表明，lncRNA HULC與肝癌密切相關(guān)，可通過(guò)表觀遺傳調(diào)控、促進(jìn)血管生成及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等機(jī)制參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展[26]。

本研究結(jié)果表明，低lncRNA HULC組患者病理高分化比例與肝內(nèi)轉(zhuǎn)移與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移例數(shù)低于高lncRNA HULC組患者；高lncRNA HULC組患者III～I(xiàn)V期比例與肝癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)比例均高于低lncRNA HULC組患者。以上結(jié)果提示血清lncRNA HULC水平與乙肝相關(guān)性肝癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系密切，腫瘤低分化及易侵襲轉(zhuǎn)移的肝癌患者血清中，lncRNA HULC水平較高，其與肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為密切相關(guān)。多項(xiàng)研究[7,27]已證實(shí)lncRNA HULC可作為促癌基因影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲生物學(xué)特性。

肝癌的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移與腫瘤間質(zhì)血管生成密切相關(guān)，VEGF能通過(guò)旁分泌形式誘導(dǎo)腫瘤血管生成，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[28]，有研究聯(lián)合檢測(cè)外周血中VEGF含量可以預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)[29]；MMP-2是降解腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)最重要的酶類[30]。MMP-2和VEGF在肝癌肝移植受體呈高表達(dá)，與肝癌術(shù)后腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[31]。而跨膜糖蛋白E-cadherin可以介導(dǎo)同質(zhì)型細(xì)胞分子黏附，其表達(dá)降低和缺失使腫瘤細(xì)胞間黏附力下降，易于脫離原組織而發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移[32]。本研究免疫組化結(jié)果表明，血清lncRNA HULC高水平的肝細(xì)胞癌組織中VEGF、MMP-2陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，而E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)明顯減少，提示肝癌患者血清lncRNA HULC處于高水平時(shí)，其肝癌組織內(nèi)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物VEGF、MMP-2陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，而抑制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)明顯減少。血清lncRNA HULC處于高水平時(shí)，腫瘤細(xì)胞活動(dòng)能力增強(qiáng)，細(xì)胞間黏附力下降，易于發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移。因此，血清lncRNA HULC高水平的患者肝內(nèi)癌細(xì)胞惡性程度較高。

為了進(jìn)一步闡述血清lncRNA HULC水平對(duì)乙肝相關(guān)性肝癌肝切除術(shù)后生存預(yù)后的影響，本文采用Kaplar-Meier法及Cox多因素回歸分析對(duì)患者生存預(yù)后影響因素進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，高lncRNA HULC組患者生存率低于低lncRNA HULC組患者，且肝癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)率高于低lncRNA HULC 組患者。同時(shí)采用C o x 多因素模型分析影響乙肝相關(guān)性肝癌患者生存預(yù)后的因素，結(jié)果顯示，術(shù)前血清lncRNA HULC水平是影響乙肝相關(guān)性肝癌患者生存預(yù)后的重要因素。Cox多因素模型分析中，腫瘤分化程度、TNM分期、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移情況及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等結(jié)果顯示陰性，考慮可能是由于研究樣本例數(shù)導(dǎo)致的偏倚，致使風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果并無(wú)顯著性差異。

綜上所述，乙肝相關(guān)性肝癌患者血清lncRNA HULC水平較高且與其預(yù)后相關(guān)，可能用于腫瘤預(yù)后的評(píng)估，從而為肝癌防治提供指導(dǎo)，對(duì)降低病死率、改善預(yù)后具有重要意義。