重視結(jié)核分枝桿菌分子生物學(xué)診斷

吳樹(shù)才 章志華 邸紅芹

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的慢性傳染性疾病，是全世界十大死因之一，被列為我國(guó)重大傳染病之一。2010年第五次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告顯示，我國(guó)15歲及以上人群中，活動(dòng)性肺結(jié)核患病率為459/10萬(wàn)，其中痰涂片陽(yáng)性率為66/10萬(wàn)[1]。WHO[2]全球結(jié)核病報(bào)告顯示，2019年全球新發(fā)結(jié)核病患者約996萬(wàn)例，結(jié)核病發(fā)病率為130/10萬(wàn)，30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家的新發(fā)患者數(shù)占到了全球患者數(shù)的86%，其中印度(26%)、印度尼西亞(8.5%)、中國(guó)(8.4%)、菲律賓(6.0%)、巴基斯坦(5.7%)、尼日利亞(4.4%)、孟加拉國(guó)(3.6%)和南非(3.6%)等8個(gè)國(guó)家的新發(fā)患者約占全球患者數(shù)的2/3。此外，全球估算利福平耐藥結(jié)核病患者數(shù)約46.5萬(wàn)例，其中耐多藥結(jié)核病約占78%。我國(guó)仍然是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，面對(duì)如此嚴(yán)峻的形勢(shì)，早期、快速和準(zhǔn)確地診斷MTB感染是至關(guān)重要的。然而，常規(guī)的診斷方法如痰MTB培養(yǎng)雖然能夠診斷，但培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，敏感度低；痰涂片染色操作復(fù)雜，陽(yáng)性檢出率低，且不能鑒別非結(jié)核分枝桿菌感染[3-4]。

隨著近年來(lái)分子生物學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展，分枝桿菌的檢測(cè)、鑒定技術(shù)也取得巨大的進(jìn)展。目前應(yīng)用報(bào)道多為核酸檢測(cè)技術(shù)(nucleic acid amplication tests，NAAT)，通過(guò)檢測(cè)MTB特異性的基因片段，判定標(biāo)本中是否存在MTB，為結(jié)核病早期快速診斷提供了新的途徑。2017年，我國(guó)已將MTB核酸檢測(cè)陽(yáng)性作為肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，這將會(huì)提升我國(guó)結(jié)核病診療的整體水平[5]。為充分了解分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)在結(jié)核病診斷中的作用，筆者對(duì)目前應(yīng)用的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行闡述。

一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)最早由Higuchi等[6]提出，隨后美國(guó)PE(Perkin Elmer)公司研發(fā)出了TaqMan熒光探針定量技術(shù)，真正做到了“實(shí)時(shí)檢測(cè)”。與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，具有特異度高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單以及無(wú)常規(guī)PCR擴(kuò)增后開(kāi)管操作等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)目前在臨床應(yīng)用較為廣泛，常規(guī)實(shí)時(shí)熒光定量PCR以MTB IS6110(特異性插入序列)為檢測(cè)靶點(diǎn)，用于檢測(cè)MTB或非結(jié)核分枝桿菌感染，具有較高的敏感度和特異度[7]。

2009年美國(guó)Cepheid公司研發(fā)的MTB及利福平耐藥檢測(cè)試劑盒(GeneXpert MTB/RIF, 簡(jiǎn)稱(chēng)“Xpert”)，開(kāi)始用于結(jié)核病及耐藥檢測(cè)。該方法基于半巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，以MTB特異性序列rpoB基因上的利福平耐藥相關(guān)核心區(qū)域(RRDR)為靶點(diǎn)，自動(dòng)提取擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)MTB及其對(duì)利福平耐藥性的快速檢測(cè)，報(bào)告周期為2 h[8]。由于其具有快速可靠、安全性好、不易受污染等優(yōu)點(diǎn)，2013年WHO推薦Xpert作為成人和兒童耐多藥結(jié)核病或并發(fā)HIV感染的首選檢測(cè)方法。陳蕾和吳桂輝[9]以藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏試驗(yàn)”)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得Xpert檢測(cè)MTB敏感度為84.80%，特異度為98.82%，說(shuō)明該技術(shù)在檢測(cè)MTB方面具有較高的敏感度和特異度。Meta分析顯示，Xpert檢測(cè)結(jié)核性胸腔積液的敏感度和特異度分別為51.4%和98.6%，提示在結(jié)核性胸腔積液診斷中具有低敏感度和高特異度，表明該檢測(cè)方法具有一定的局限性[10]。

GeneXpert MTB/RIF Ultra(簡(jiǎn)稱(chēng)“Xpert Ultra”)是在Xpert基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)，旨在提高檢測(cè)敏感度。Xpert Ultra以IS6110和IS1081為檢測(cè)靶點(diǎn)，同時(shí)與Xpert相比，MTB的檢測(cè)閾值為15.6 CFU/ml，是Xpert敏感度的10倍，因而對(duì)含菌量少的標(biāo)本(如肺外結(jié)核、艾滋病并發(fā)結(jié)核病、兒童結(jié)核病等)的敏感度更高[11]。一項(xiàng)納入21例臨床診斷為疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)MTB感染的非HIV感染患者的研究顯示，Xpert Ultra檢測(cè)陽(yáng)性率(66.7%)顯著高于Xpert(26.7%)和液體培養(yǎng)(26.7%)陽(yáng)性率；Xpert Ultra用于腦脊液診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感度和特異度分別為66.7%和100.0%[12]，證實(shí)Xpert Ultra是目前診斷結(jié)核性腦膜炎最敏感的方法，相比之下，Xpert Ultra相對(duì)Xpert有更好的臨床應(yīng)用意義。

二、恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)

近年來(lái)，隨著對(duì)體內(nèi)DNA、RNA的合成過(guò)程以及一些輔助蛋白作用機(jī)制的不斷深入研究，在恒溫條件下擴(kuò)增目的片段的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，且表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)不需要專(zhuān)用的設(shè)備，僅需金屬浴或保溫箱即可進(jìn)行檢測(cè)；對(duì)標(biāo)本要求低，可以耐受一些PCR反應(yīng)的抑制劑，標(biāo)本無(wú)需經(jīng)過(guò)復(fù)雜的核酸提取過(guò)程即可進(jìn)行擴(kuò)增；敏感度和特異度與PCR技術(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；此外在恒溫條件下，反應(yīng)時(shí)間更短。目前MTB診斷主要為：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)、交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增(crossing priming amplification，CPA)技術(shù)及實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增(simultaneous amplification and testing，SAT)技術(shù)。

(一)LAMP技術(shù)

LAMP技術(shù)是Notomi[13]于2000年研究的一種基于具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶的核酸體外恒溫?cái)U(kuò)增新技術(shù)，該技術(shù)針對(duì)目的基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，依賴(lài)鏈置換Bst DNA聚合酶，在恒溫(60～65 ℃)條件下實(shí)現(xiàn)高效、特異的靶序列的擴(kuò)增。LAMP檢測(cè)時(shí)不需要專(zhuān)門(mén)的核酸擴(kuò)增設(shè)備，通過(guò)肉眼觀察即可判定檢測(cè)結(jié)果；對(duì)操作人員技術(shù)水平要求低；敏感度和特異度較高，適合在基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行推廣應(yīng)用。劉權(quán)賢等[14]評(píng)估LAMP法在肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本中的應(yīng)用，對(duì)于抗酸陽(yáng)性標(biāo)本，檢出率為100.0%(75/75)，而在抗酸染色陰性標(biāo)本中陽(yáng)性檢出率為31.9%(23/72)，均顯著高于L-J固體培養(yǎng)。歐喜超等[15]以固體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，顯示LAMP的敏感度和特異度分別為90.24%(333/369)和96.86%(924/954)，涂片陰性患者中檢測(cè)敏感度和特異度分別為82.52%(170/206)和97.06%(924/952)，該方法可用于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者。雖然LAMP技術(shù)有諸多的優(yōu)點(diǎn)，但缺點(diǎn)也明顯，如在高溫和高濕等環(huán)境下會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性率升高；不能區(qū)分肺結(jié)核處于活動(dòng)期還是潛伏期，即不能監(jiān)測(cè)患者的診療效果。

(二) CPA技術(shù)

CPA技術(shù)由杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司研發(fā)，為中國(guó)首個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)[16]。該技術(shù)以MTB復(fù)合群特異性的IS6110插入序列為靶序列，通過(guò)兩對(duì)特異性擴(kuò)增引物、一對(duì)特異性探針，以及Bst的DNA聚合酶，在恒定溫度條件下，一次性完成MTB復(fù)合群IS6110片段的特異擴(kuò)增和雜交過(guò)程，然后在密閉的一次性核酸檢測(cè)裝置中利用免疫層析乳膠標(biāo)記試紙條檢測(cè)技術(shù)，定性檢測(cè)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)敏感度為10個(gè)病原體，操作簡(jiǎn)便快速，擺脫了分子生物學(xué)診斷對(duì)昂貴儀器和高要求實(shí)驗(yàn)室的依賴(lài)。CPA的檢測(cè)性能評(píng)估顯示，該方法的敏感度和特異度分別為98.94%和92.31%，顯著高于痰涂片和痰培養(yǎng)，說(shuō)明CPA是一種痰涂片鏡檢很好的補(bǔ)充檢測(cè)，可以提高痰涂片陰性標(biāo)本MTB的檢出率，尤其適用于基層醫(yī)院MTB的快速篩查[17]。

(三)SAT技術(shù)

SAT技術(shù)以MTB 16Sr RNA為檢測(cè)靶標(biāo)，基于M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA聚合酶，在恒溫(42 ℃)條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增檢測(cè)[18]。該技術(shù)采用了RNA擴(kuò)增方式進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)靶和擴(kuò)增物均是RNA，因而有極高的擴(kuò)增效率且反應(yīng)穩(wěn)定，可快速鑒別結(jié)核病患者是否處于活動(dòng)期。柴國(guó)祥等[19]對(duì)400例疑似肺結(jié)核患者標(biāo)本進(jìn)行SAT檢測(cè)，敏感度和特異度分別為72.68%和98.62%；以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，SAT檢測(cè)的符合率(86.75%)顯著高于痰培養(yǎng)(69.75%)和痰涂片(67.50%)。金玄俊等[20]通過(guò)對(duì)比涂片抗酸染色、L-J固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)和SAT檢測(cè)MTB陽(yáng)性率評(píng)估SAT技術(shù)的臨床應(yīng)用價(jià)值，結(jié)果顯示SAT檢測(cè)陽(yáng)性率(51.7%，137/265)顯著高于涂片抗酸染色(31.3%，83/265)、L-J固體培養(yǎng)(38.9%，103/265)和液體培養(yǎng)陽(yáng)性率(43.7%，116/265)，表明SAT檢測(cè)技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，值得用于結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室輔助診斷。

三、MTB耐藥檢測(cè)技術(shù)

(一) 基因芯片技術(shù)

基因芯片(gene chip)是一種基于核酸雜交技術(shù)的高通量DNA檢測(cè)技術(shù)，將含有熒光標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與包被有特異性DNA探針的芯片雜交，通過(guò)檢測(cè)分析雜交信號(hào)的強(qiáng)度即可獲知樣品信息。Pang等[21]研究納入1814例患者標(biāo)本，以藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示基因芯片法檢測(cè)利福平耐藥的敏感度和特異度分別為87.56%和97.95%；檢測(cè)異煙肼耐藥的敏感度和特異度分別為80.34%和95.82%，表明該技術(shù)是一種高效、快速、安全的檢測(cè)方法，值得廣泛應(yīng)用。楊映暉等[22]對(duì)933例疑似肺結(jié)核患者晨痰標(biāo)本進(jìn)行基因芯片法檢測(cè)分析，結(jié)果顯示基因芯片法檢測(cè)出異煙肼耐藥的敏感度為86.67%(26/30)，特異度為96.53%(195/202)，表明基因芯片法敏感度、特異度較高，有助于結(jié)核病的早期診斷及防控。

(二) 線性探針技術(shù)

線性探針技術(shù)(line probe assay)是一種基于核酸反向雜交技術(shù)，將帶有生物素標(biāo)記的目的片段與固定于雜交膜上的特異性寡核苷酸探針雜交，根據(jù)酶聯(lián)免疫顯色結(jié)果，判定雜交結(jié)果。2008年WHO批準(zhǔn)該技術(shù)可用于耐多藥結(jié)核病的篩查?；诰€性探針技術(shù)原理，德國(guó)HAIN公司推出GenoType MTBDR和MTBDRsl檢測(cè)試劑盒，可以用于快速檢測(cè)一線以及氟喹諾酮類(lèi)及二線注射藥物耐藥。一項(xiàng)評(píng)估線性探針技術(shù)對(duì)耐藥肺結(jié)核診斷準(zhǔn)確性的Meta分析顯示，線性探針技術(shù)診斷耐利福平、異煙肼、耐多藥、氟喹諾酮、二線注射類(lèi)藥物(包括卡那霉素、卷曲霉素、丁胺卡那霉素)以及廣泛耐藥肺結(jié)核的敏感度分別為91.0% (88.0%～94.0%)、80.0%(77.0%～83.0%)、81.0%(76.0%～85.0%)、92.0%(88.0%～95.0%)、79.0%(58.0%～91.0%)和46.0%(19.0%～75.0%)，特異度分別為98.0%(97.0%～99.0%)、98.0%(96.0%～99.0%)、99.0%(99.0%～100.0%)、94.0%(91.0%～97.0%)、98.0%(90.0%～100.0%)和100.0%(98.0%～100.0%)，表明線性探針技術(shù)對(duì)耐藥肺結(jié)核的診斷準(zhǔn)確性較高[23]。

由于可同時(shí)檢測(cè)的靶點(diǎn)多、檢測(cè)效率高且檢測(cè)成本較低，基于核酸分子雜交的結(jié)核病診斷和耐藥檢測(cè)技術(shù)仍獲得了較多研究者和臨床實(shí)驗(yàn)室的青睞，如基于PCR 擴(kuò)增和核酸雜交芯片的Truenat MTB檢測(cè)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出反射測(cè)定法來(lái)檢測(cè)MTB陽(yáng)性結(jié)果的樣品對(duì)利福平的耐藥性，印度醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)根據(jù)當(dāng)?shù)財(cái)?shù)據(jù)向印度中央結(jié)核病司推薦了Truenat MTB，并獲得了WHO 技術(shù)驗(yàn)證和推廣[2]。

(三)高分辨率熔解曲線(high resolution melting，HRM)技術(shù)

HRM技術(shù)是一種基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR和熔解曲線分析相結(jié)合的新技術(shù)，直接檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中飽和熒光染料熒光強(qiáng)度變化。由于靶序列中不同GC堿基含量和分布不同，DNA分子變性溫度(Tm)不同，會(huì)形成特殊的熔解曲線形狀和位置，通過(guò)比較解鏈溫度曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線的差異，即可準(zhǔn)確區(qū)分野生型與突變型基因，可以區(qū)分單個(gè)堿基的序列差異。李春燕等[24]以藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，納入200例痰涂片陽(yáng)性患者標(biāo)本，測(cè)得HRM技術(shù)在初治患者中檢測(cè)異煙肼耐藥的敏感度和特異度分別為71.43%和96.77%，檢測(cè)利福平耐藥的敏感度和特異度分別為80.00%和97.92%；在復(fù)治患者中，檢測(cè)異煙肼耐藥的敏感度為35.00%，特異度為81.25%，檢測(cè)利福平耐藥的敏感度為82.35%，特異度為94.74%，表明HRM技術(shù)檢測(cè)快速、高效，可用于初治和復(fù)治患者利福平、異煙肼耐藥性的檢測(cè)，并指導(dǎo)臨床用藥。HRM技術(shù)性能研究顯示，異煙肼的敏感度和特異度分別為95.00%和82.76%[25]。目前基于HRM技術(shù)的國(guó)產(chǎn)商品化檢測(cè)試劑盒已逐漸用于結(jié)核病耐藥性檢測(cè)領(lǐng)域，并且國(guó)家“十二五”科技重大專(zhuān)項(xiàng)已對(duì)該技術(shù)開(kāi)展多中心臨床研究。

四、其他新型檢測(cè)技術(shù)

(一) DNA測(cè)序技術(shù)

DNA測(cè)序技術(shù)是檢測(cè)基因突變最直接、最可靠的方法，目前隨著測(cè)序技術(shù)的日益成熟，多種生物信息學(xué)平臺(tái)均可實(shí)現(xiàn)MTB耐藥快速、精準(zhǔn)的診斷。辜吉秀等[26]納入135株菌株以比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)二代測(cè)序(next generation sequencing, NGS)技術(shù)在耐藥結(jié)核病中的檢測(cè)效能，結(jié)果顯示NGS技術(shù)檢測(cè)異煙肼、乙胺丁醇、利福平、鏈霉素及氧氟沙星耐藥的敏感度分別為88.75%、85.71%、84.72%、73.91和68.97%，特異度分別為100.00%、86.84%、96.83%、96.97%和99.06%，提示NGS技術(shù)檢測(cè)利福平、異煙肼及氧氟沙星等耐藥效果較好，能夠滿足臨床結(jié)核病診斷需要，但對(duì)乙胺丁醇和鏈霉素已知耐藥位點(diǎn)檢測(cè)性一般，需要對(duì)其耐藥機(jī)制進(jìn)一步研究。盡管測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果可靠，但在結(jié)核病耐藥診斷過(guò)程中仍然存在一些挑戰(zhàn)，測(cè)序儀器以及測(cè)序費(fèi)用昂貴；缺少專(zhuān)家共識(shí)和指南用于規(guī)范測(cè)序操作，以及制定標(biāo)準(zhǔn)化步驟，因此在臨床上還難以推廣。

(二)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)

MALDI-TOF-MS是一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，適用于混合物和生物大分子的測(cè)定。該技術(shù)原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成共結(jié)晶薄膜，使基質(zhì)晶體升華進(jìn)入氣相，根據(jù)質(zhì)荷比與飛行時(shí)間，得出質(zhì)譜峰圖，之后對(duì)比參考圖譜即可辨別樣本分子。王蔚等[27]以測(cè)序?yàn)榻饦?biāo)準(zhǔn)，評(píng)估MALDI-TOF-MS對(duì)液體培養(yǎng)分枝桿菌菌種鑒定的能力，結(jié)果顯示MALDI-TOF-MS鑒定MTB和非結(jié)核分枝桿菌準(zhǔn)確率分別為95.65%和88.46%，表明該方法是一種快速、簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的鑒定方法，在臨床應(yīng)用中具有重要價(jià)值。一項(xiàng)納入11篇文獻(xiàn)的Meta分析顯示，MALDI-TOF-MS鑒定分枝桿菌正確率為91%，其對(duì)分枝桿菌屬的鑒定有較好的準(zhǔn)確性[28]。

五、展望

我國(guó)現(xiàn)階段仍是結(jié)核病的高負(fù)擔(dān)國(guó)家，早期、快速、精確的診斷方法將會(huì)發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。近年來(lái)，MTB的檢測(cè)正由傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢查轉(zhuǎn)向分子生物學(xué)診斷等更為精確的方法。但分子生物學(xué)檢測(cè)也存在一些局限性。首先，菌株的突變呈現(xiàn)地域性的差異，商品化的檢測(cè)試劑僅覆蓋了常見(jiàn)的檢測(cè)位點(diǎn)，單獨(dú)的運(yùn)用分子生物學(xué)檢測(cè)勢(shì)必造成對(duì)部分帶有其他位點(diǎn)的菌株的漏檢；導(dǎo)致其檢測(cè)敏感度不高，因此仍然要綜合實(shí)驗(yàn)室其他檢測(cè)。近年來(lái)，全基因組測(cè)序技術(shù)廣泛運(yùn)用，由于其具有高通量，涵蓋基因全等優(yōu)勢(shì)，其用于MTB的檢測(cè)具有很大的潛力；其次，基因突變和表型耐藥仍有一些差別，基因突變不一定存在表型耐藥，分子生物學(xué)檢測(cè)應(yīng)結(jié)合培養(yǎng)等傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)證據(jù)；最后，實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展分子生物學(xué)檢測(cè)需具備一些硬件條件，通常實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有臨床基因擴(kuò)增的資質(zhì)及標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室分區(qū)，因此限制了部分檢測(cè)技術(shù)在基層的使用。

雖然分子診斷存在諸多挑戰(zhàn)，但隨著分子診斷技術(shù)研究的不斷深入和進(jìn)步，將會(huì)在結(jié)核病診斷中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，對(duì)結(jié)核病的診療、防控具有深遠(yuǎn)意義。