高通量測序技術(shù)在水生態(tài)污染監(jiān)測中的應(yīng)用

景 明， 陳 瑜， 高 昕， 李繼影

（江蘇省蘇州環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇蘇州215000）

0 引 言

張家港位于江蘇省蘇州市，區(qū)域范圍內(nèi)水系發(fā)達，隨著區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展，人類活動一定程度上影響了河道水質(zhì)。本研究主要針對張家港某生態(tài)污染河道河水呈赤紅色，經(jīng)顯微鏡初步鑒定發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象是由微生物爆發(fā)導(dǎo)致的生態(tài)污染事件。微生物是指示水生態(tài)環(huán)境變化的敏感指標［1］。目前，微生物分類主要依靠光學(xué)根據(jù)細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征確定其種類［2］。但顯微鏡檢測適用于鑒定細胞體積較大，具有顯著形態(tài)學(xué)的大型細胞，對于部分個體較小的細胞無法有效鑒定［3］。

隨著基因測序技術(shù)不斷地發(fā)展與普及，大數(shù)據(jù)分析能力不斷提高，基因組研究手段正越來越多地應(yīng)用于鑒定形態(tài)學(xué)難以辨別的物種［4］。原核生物和真核生物的基因組都含有保守區(qū)和可變區(qū)，其中可變區(qū)能夠區(qū)分物種之間的差異，適用于進行測序和分類鑒定，是研究環(huán)境樣品中微生物物種群落的重要手段。目前高通量測序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于研究藍藻水華的形成及其爆發(fā)原因的機理。本研究通過Illumina 測序?qū)υ摵拥赖脑松锛罢婧松锓謩e進行測序，分析其群落結(jié)構(gòu)及成因。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及前處理

本次采樣地點為張家港污染河道（坐標為120°38′15.43E，31°48′32.11N），采樣時間2019-12-23，每個采樣點使用垂直采樣器在水面下0.5 m處收集5 L水樣，儲存在塑料瓶內(nèi)，置于4 ℃冷藏箱后運回實驗室，在24 h內(nèi)完成水樣中微生物的富集。采用標準方法［5］測定以下常規(guī)水質(zhì)指標：葉綠素a、氨氮、總磷、總氮、化學(xué)需氧量、色度和pH。

樣品濃縮采用膜過濾法，將樣品通過醋酸纖維素濾膜（孔徑0.45 μm、直徑50 mm），用PBS（0.01 mol／L）對濾膜進行洗脫。然后將洗脫液進行高速離心濃縮（14 000 r／min，10 min），最后去掉上層清液，用1 mL PBS進行洗脫，然后進行DNA提取。

1.2 DNA提取及高通量測序

DNA提取采用CTAB［6］法標準化操作流程，然后采用瓊脂糖凝膠電泳進行DNA 濃度和純度檢測。最后取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng／μL作為基因組DNA 模板。根據(jù)待測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode 的特異引物（New England Biolabs 公司的Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer）和高效高保真酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。本研究選擇針對原核生物16S rRNA基因中高度變化的V4 區(qū)域［7］以及真核生物18S rRNA的V4 區(qū)域［8］的引物作為擴增子，詳見表1。PCR的反應(yīng)條件為：95 ℃5 min，94 ℃60 s，57 ℃45 s，72 ℃60 s，共34 個循環(huán)，最后72 ℃ 終延伸10 min，16 ℃5 min。PCR產(chǎn)物通過2%的瓊脂凝膠電泳檢測。根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度對樣品進行等量混合，然后使用1 ×TAE 濃度2%的瓊脂糖膠電泳對PCR 產(chǎn)物進行純化，將剪切得到的目標條帶使用試劑盒回收產(chǎn)物，試劑盒為Thermo Scientific 公司GeneJET 膠回收試劑盒。

使用建庫試劑盒（Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns，Thermofisher）進行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測合格后，進行上機測序（Ion S5TMXL，Thermofisher）。

表1 本研究PCR擴增引物引物序列

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Cutadapt［9］先對原始數(shù)據(jù)的reads 進行低質(zhì)量部分剪切，去掉干擾數(shù)據(jù)，再根據(jù)Barcode 從處理后的數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，然后進行去除嵌合體序列處理，即對截去Barcode 和引物序列初步質(zhì)控得到原始數(shù)據(jù)Reads 序列［10］通過與物種注釋數(shù)據(jù)庫進行比對檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列［11］，得到最終的有效數(shù)據(jù)（Clean Reads）。

用Uparse 軟件［12］對樣品進行聚類分析，以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），選取OTUs 中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。對OTUs序列進行物種注釋，用RDP Classifier 方法與Silva132 數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.6 ～1.0）。使用MUSCLE 軟件進行快速多序列比對，得到所有OTUs 序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后，以樣品中數(shù)據(jù)量最少為標準對測序數(shù)據(jù)進行均一化處理，后續(xù)的Alpha 多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)分析及多樣性指數(shù)

本次擴增的第1 輪PCR擴增產(chǎn)物如圖1 所示，所擴增的基因片段條帶單一，長度分別約為300 bp 及350 bp，真核生物的生物量顯著高于原核生物。

圖1 擴增產(chǎn)物電泳圖

測序共獲得16S rRNA 基因V4 可變區(qū)的88 968條原始序列，通過數(shù)據(jù)篩選后共得到80 148 個高質(zhì)量序列；18S rRNA 基因V4 可變區(qū)的88 510 條原始序列，通過數(shù)據(jù)篩選后，共得到87 841 個高質(zhì)量序列。

將序列進行隨機抽樣，并通過對所抽到的序列數(shù)和代表的OTU數(shù)來構(gòu)建稀釋性曲線，如圖2 所示。由圖可知，原核生物得到的注釋為548 種OTU，真核生物得到的注釋為33 種，兩個樣品的稀釋曲線趨于平坦，說明原核生物與真核生物的測序結(jié)果都較為完整，原核生物的物種分布較為均勻種群組成較為豐富；真核生物的種群組成比較單一。

圖2 OTUs稀釋曲線

對不同樣本在97%一致性閾值下的Alpha Diversity 分析指數(shù)進行統(tǒng)計，結(jié)果見表2（均一化時選取的數(shù)據(jù)量：cutoff ＝65 446（原核生物）；cutoff ＝79 939（真核生物））。Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)表示個體分布的均勻度，各物種之間個體分布越均勻，指數(shù)越高，如果每一個體都屬于不同的物種，指數(shù)則達到極值，由表可知真核生物的物種組成比原核生物單一。

表2 Alpha Indices 統(tǒng)計表

2.2 原核生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)分析

對樣品中的原核生物OTUs 進行注釋后發(fā)現(xiàn)，本次樣品原核生物多樣性豐富，涵蓋了22 門74 種。其中，變形菌門（Proteobacteria）21 種，占54.5%；擬桿菌門（Bacteroidetes）24 種，占15.77%；放線菌門（Actinobacteria）1 種，占12.37%：厚壁菌門（Firmicutes）15 種，占8.19%，如圖3 所示。原核生物OTUs前6 的屬占總測序量的百分比見表3，6 個屬OTUs總百分比僅為32.18%，表明原核生物種類分布較為均勻。

圖3 原核生物門水平上的物種相對豐度餅狀圖

表3 原核生物主要物種注釋（前6 種）

2.3 真核生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)分析

對所得到真核生物的OTUs序列進行物種注釋后發(fā)現(xiàn)，本次采集的樣品中真核生物種類比較單一，共發(fā)現(xiàn)4 個門12 種，其中金藻門（Chrysophyta）占93.95%，如圖4 所示，樣品中核心OTU 是Pedospumella encystans占93.94%，3 種微生物占真核生物的95%以上（見表4）。

圖4 真核生物門水平上的物種相對豐度餅狀圖

表4 真核生物主要物種注釋（前3 種）

顯微鏡觀察結(jié)果如圖5 所示，藻體呈棒狀及螺旋狀，游動速度較快。且棒狀藻體中含5 ～10 個顆粒狀色素體。幾乎所有的可見細胞均為該微生物，細胞顏色為紫紅色，水體中大量出現(xiàn)，導(dǎo)致河道水面呈現(xiàn)為紫紅色，形態(tài)學(xué)鑒定無法準確判斷該微生物種類。

根據(jù)高通量測序結(jié)果中真核生物和原核生物生物量以及物種豐度的區(qū)別，導(dǎo)致本次河道生態(tài)污染的微生物為Pedospumella encystans。篩選真核生物中特別關(guān)注的物種（相對豐度前10 的種）進行物種分類樹統(tǒng)計，進行展示，其物種分類樹如圖6 所示。

圖5 顯微鏡觀察結(jié)果

圖6 樣本中特定物種分類樹

3 討 論

3.1 高通量測序技術(shù)的應(yīng)用

該河道微生物的優(yōu)勢種個體較小，通過顯微鏡難以準確判斷其類別，而高通量測序技術(shù)具有能夠檢測數(shù)量較少、體積微小且不宜培養(yǎng)的微生物的能力［13］，用于檢測環(huán)境樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的生物多樣性［4］。目前江蘇省浮游藻類監(jiān)測主要建立在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，本研究采用高通量測序技術(shù)對河道原核生物及真核生物的群落組成進行研究，同時結(jié)合形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)引起本次河道生態(tài)污染的微生物為一種體積較小，難以通過傳統(tǒng)顯微鏡鑒定種類的真核浮游藻類。高通量測序技術(shù)可以彌補顯微鏡觀察中難以判斷的物種信息，從而提高了浮游藻類監(jiān)測的綜合能力［14］。

3.2 水環(huán)境因子對生物群落結(jié)構(gòu)的影響

本研究中，河道的水質(zhì)參數(shù)如表5 所示。由表5可知，該河道水體屬于劣5 類水體，相比其他指標化學(xué)需氧量濃度較低（5 類水40 mg／L），氨氮（5 類水2.0 mg／L）與總磷（5 類水0.4 mg／L）濃度較高，均超過5類水要求5 倍以上，可生化性較差（可生化處理的水質(zhì)推薦的碳氮比為100∶5，該河道碳氮比為1∶1，推測有工業(yè)廢水排入），對活性微生物繁殖造成影響，致使水體的自凈能力得到影響，當有少數(shù)微生物能夠適應(yīng)該水質(zhì)條件時，該微生物易成為優(yōu)勢種。

表5 該河道水質(zhì)理化指標

3.3 優(yōu)勢種Pedospumella encystans

金藻是生態(tài)學(xué)和生態(tài)生理學(xué)的原生模式種，一部分種類是水體中的初級生產(chǎn)力，另一部分是水體中部分細菌的捕食者，通常最佳生長條件為溫度較低，透明度較好且有機物含量較低的水體［15］，在初春、晚秋或冬季多有發(fā)現(xiàn)，多數(shù)存活于水體的中下層，有研究表明在冰面下某些金藻種類仍能存活［16］。

近幾年，系統(tǒng)發(fā)育樹和大系統(tǒng)分類學(xué)顯示了金藻門所包含種類的復(fù)雜性，許多種類為光合自養(yǎng)和異養(yǎng)生物之間的過渡［17］，其中異養(yǎng)型金藻與自養(yǎng)型金藻相比，具有較小的基因組和細胞體積，相對表面積較大，能夠高效利用環(huán)境中的營養(yǎng)鹽且所需代謝時間短于其它藻類。Pedospumella encystans 屬于金藻綱（Chrysophyceae），色金藻目（Chromulinales），Chromulinales科，Pedospumella 屬，屬于一種異養(yǎng)型微型浮游藻類［15］，細胞無細胞壁，僅含有一條鞭毛，Pedospumella encystans在中國發(fā)現(xiàn)較少，在已有研究中有報道，當水質(zhì)的可生化性較差時，自養(yǎng)型微生物難以生存的條件下該種類易成為優(yōu)勢種［18］。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，運用高通量測序技術(shù)結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定能夠揭示水環(huán)境中微生物的多樣性及群落組成，得到更客觀、更準確的監(jiān)測結(jié)果，在水生態(tài)監(jiān)測和水質(zhì)評價方面具有較好的應(yīng)用潛力。

（1）對張家港生態(tài)污染河道進行形態(tài)學(xué)鑒定，群落組成單一，可見的微生物基本為同一種類。

（2）用高通量測序技術(shù)對18S rRNA 基因V4 區(qū)測序，結(jié)果顯示數(shù)量較多且群落組成單一，Pedospumella encystans 占93.94%。用高通量測序技術(shù)對16S rRNA 基因V4 區(qū)測序，結(jié)果顯示數(shù)量相對較少且群落分布較為均勻，由此得出主要的微生物為Pedospumella encystans。

（3）對該河道水質(zhì)進行分析，推測該河道有工業(yè)廢水混入，可生化性較差，同時冬季河道水質(zhì)不利于常規(guī)藻類生長，使得Pedospumella encystans 成為優(yōu)勢種，導(dǎo)致了本次河道生態(tài)污染事件。