N-乙酰半胱氨酸對(duì)軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解和骨關(guān)節(jié)炎的作用研究

張衛(wèi)華，張建業(yè)，葉恒，李永壽

(1.武漢市漢陽(yáng)醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430050；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 十堰 442000)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨變性、骨質(zhì)疏松及滑膜炎為特征的慢性骨關(guān)節(jié)疾病，中老年人較為常見，臨床主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限等，甚至可導(dǎo)致殘疾，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。OA病理特征主要以軟骨基質(zhì)的降解和破壞為主，其與衰老、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和分解代謝相關(guān)的基因表達(dá)有關(guān)[3-4]。目前，臨床骨關(guān)節(jié)炎并無(wú)特效治療，因此，尋找用于治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物是一項(xiàng)重要目標(biāo)。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是一種谷胱甘肽前體，可以通過(guò)靶向于活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生抗氧化作用，并且對(duì)許多ROS相關(guān)的疾病動(dòng)物模型均有良好的抗氧化作用[5-6]。但是，NAC對(duì)于治療骨關(guān)節(jié)炎的作用及其相關(guān)機(jī)制研究較少，因此，本研究通過(guò)建立體內(nèi)外模型探討了NAC的抗骨關(guān)節(jié)炎作用及其相關(guān)的分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)(ST316)，碘化吡啶(propidium iodide，PI)染色液(P0137)，ROS檢測(cè)試劑盒(S0033)，蛋白裂解液(P0013C)，蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物(P1046)，超氧化物(superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒(S0060)，總谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)檢測(cè)試劑盒(S0058)購(gòu)自碧云天生物科技有限公司(中國(guó))；Anti-基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotinase，MMP)-3(#14351)，Anti-MMP-9(#13667)，Anti-MMP-13(#69926)，Anti-GAPDH(#5174)購(gòu)自Cell Signaling生物公司(美國(guó))；Anti-ADAMTS 4(PA1-1749A)購(gòu)自賽默飛生物科技有限公司(美國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人軟骨細(xì)胞(HC-A)購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))，用含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、100U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，于5% CO2和37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱(賽默飛，美國(guó))中培養(yǎng)。

1.3 MTT試驗(yàn) 以1×106個(gè)/mL密度將HC-A細(xì)胞接種于96孔板，過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，將細(xì)胞分為對(duì)照組、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-β及IL-β+NAC(2.5、5、10 mmol/L)組，用不同濃度的NAC預(yù)處理2 h，然后用IL-1β處理24 h，根據(jù)制造商說(shuō)明書使用MTT液檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.4 PI染色 以1×106個(gè)/mL密度將HC-A細(xì)胞接種于24孔板(預(yù)先放入細(xì)胞爬片)，過(guò)夜培養(yǎng)，將細(xì)胞分為對(duì)照組和NAC(10 mmol/L)組，NAC組加入10 mmol/L NAC，對(duì)照組加入無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液，于37℃培養(yǎng)24 h，隨后棄掉培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(phosphate Buffered Saline，PBS)洗滌1次，加入PI和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染液進(jìn)行染色30 min，棄掉染液，用PBS洗滌3次，5 min/次，然后用4%多聚甲醛室溫固定20 min，用PBS洗滌3次，5 min/次，最后使用共聚焦熒光顯微鏡觀察拍照檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè) 以1×106個(gè)/mL密度將HC-A細(xì)胞接種于96孔板，過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)將細(xì)胞分為對(duì)照組、IL-β及IL-β+NAC(2.5、5、10 mmol/L)組，用不同濃度的NAC預(yù)處理2 h，然后用IL-1β處理24 h，棄掉培養(yǎng)基，加入2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2'，7'-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)熒光探針于37℃反應(yīng)20 min，使用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)488/525 nm檢測(cè)熒光值。

1.6 SOD和GPX活性檢測(cè) 細(xì)胞處理結(jié)束后，根據(jù)制造商要求使用商業(yè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的SOD和GPX活性。

1.7 蛋白免疫印跡 buffer(4×)于100℃煮沸5 min，然后采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)分離蛋白，電泳條件：80 V，30 min；120 V，60 min。隨后采用100 V，90 min將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏佛乙烯(poly vinylidene fluoride，PVDF)膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，TBST洗滌5次，5 min/次，用一抗(MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS 4及GAPDH，按1︰1 000稀釋)4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌5次，5 min/次，用二抗[辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記山羊抗兔IG和HRP標(biāo)記山羊抗鼠IG，按1︰10 000稀釋]室溫孵育90 min，TBST洗滌5次，5 min/次，用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影檢測(cè)，Image J分析灰度值。

1.8 軟骨細(xì)胞基質(zhì)的形態(tài)學(xué)檢測(cè) 以1×106個(gè)/mL密度將HC-A細(xì)胞接種于24孔板(預(yù)先放入細(xì)胞爬片)，過(guò)夜培養(yǎng)，將細(xì)胞分為對(duì)照組、IL-1β組和IL-1β+NAC組，先用NAC預(yù)處理2 h，然后用IL-1β處理24 h，棄掉培養(yǎng)基，細(xì)胞在95%乙醇中固定，然后在室溫下用1%阿爾新藍(lán)染料(pH 1.0)染色過(guò)夜，隨后使用倒置顯微鏡觀察拍照。

1.9 OA動(dòng)物模型 采用右膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶切斷術(shù)建立OA大鼠模型，在第0天造模，提前禁食12 h，戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定于實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)，右膝關(guān)節(jié)刮毛備皮后用碘伏消毒。在無(wú)菌情況下，于膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切約1 cm縱向切口，打開關(guān)節(jié)腔，同時(shí)切斷前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶和內(nèi)側(cè)半月板，縫合傷口。術(shù)后連續(xù)肌肉注射4 d抗生素(氨芐青霉素，4×104U/d)，假手術(shù)組在沒有其他任何處理的情況下，縫合傷口，以手術(shù)當(dāng)天為第0天。

1.10 給藥與分組 SPF級(jí)別SD雄性大鼠48只(220～250 g)購(gòu)于湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、NAC-12.5 mg/kg、NAC-25 mg/kg、NAC-50 mg/kg及陽(yáng)性對(duì)照組(雙氯芬酸鈉腸溶片，4 mg/kg)，n=8。手術(shù)后2周(即第14天)開始灌胃給藥，每天1次，模型組和假手術(shù)組灌胃給予等體積的CMCNa(0.5%)，連續(xù)給藥3周，在第35天行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后腹主動(dòng)脈取血，脫頸椎處死，分離大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織。

1.11 機(jī)械性痛閾值(paw withdrawal mechanical threshold，PWT)檢測(cè) 采用電子自動(dòng)爪觸覺測(cè)試儀測(cè)定實(shí)驗(yàn)大鼠的機(jī)械刺激縮爪閾值PWT(單位：g)，每周測(cè)量1次，將刺激針對(duì)準(zhǔn)足底并逐漸增加刺激力量，大鼠感覺到痛覺后移開刺激針，設(shè)備記錄并顯示足瞬間移開的最大值，即PWT，隔5 min測(cè)量1次，連續(xù)測(cè)量3次，取其平均值。

1.12 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè) 分離和收集實(shí)驗(yàn)大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨組織，稱取約30mg，加入1 mL Trizol裂解液，組織研磨儀勻漿，提取組織總RNA，用NanoDrop 2000 Spectrophotometer檢測(cè)RNA的濃度和純度，用PrimeScript RT試劑盒和gDNA Eraser(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，日本)將RNA(1 μg)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用配有SYBRs Green Master Mix(諾唯贊，中國(guó))的CFX ConnectTMReal-Time系統(tǒng)(BioRad，美國(guó))進(jìn)行qRT-PCR定量分析。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，60 ℃延伸30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，最后根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算MMP-3、MMP-9、MMP-13、GAPDH mRNA的表達(dá)水平，引物序列：MMP-3 Forward：5’-AGTCTTCCAATCCTACTGTTGCT-3’，MMP-3 Reverse：5’-TCCCCGTCACCTCCAATCC-3’；MMP-9 Forward：5’-TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3’，MMP-9 Reverse：5’-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3’；MMP-13 Forward：5’-ACTGAGAGGCTCCGAGAAATG-3’；MMP-13 Reverse：5’-GAACCCCGCATCTTGGCTT-3’；GAPDH Forward：5’-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3’，GAPDH Reverse：ACACCATGTATTCCGGGTCAAT。

1.13 組織病理學(xué) 采用番紅固綠染色檢測(cè)大鼠軟骨組織病理變化，分離收集實(shí)驗(yàn)大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨組織，置于10%福爾馬林固定24 h，然后用EDTA脫鈣液(0.5 M，pH=8)脫鈣15 d，隔3 d換1次液，石蠟包埋，切成4 μm薄片，番紅固綠染色并觀察軟骨病理變化。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 NAC對(duì)軟骨細(xì)胞細(xì)胞活力的影響 首先采用MTT法檢測(cè)了IL-1β和NAC對(duì)軟骨細(xì)胞HC-A細(xì)胞活性的影響，表明IL-1β(1 ng/mL)或IL-1β(1 ng/mL)+NAC(2.5、5、10 mmol/L)與對(duì)照組相比，對(duì)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞活力均無(wú)影響(P>0.05，見圖1a)，同時(shí)PI染色結(jié)果表明NAC(10 mmol/L)也不能夠引起細(xì)胞凋亡(見圖1b)，因此，2.5、5、10 mmol/L的NAC及L-1β(1 ng/mL)應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 NAC對(duì)IL-1β誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的影響 大量ROS產(chǎn)生在軟骨基質(zhì)炎癥病理變化過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，本研究結(jié)果表明IL-1β能夠引起軟骨細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS，預(yù)先給予NAC呈劑量依賴性降低ROS含量(P<0.05，見圖2a)。同時(shí)，NAC預(yù)處理也能夠抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞GPX和SOD活性(P<0.05，見圖2b和2c)，這表明在軟骨細(xì)胞中NAC能夠抑制IL-1β誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

2.3 NAC對(duì)IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞MMP表達(dá)及基質(zhì)降解的影響 采用蛋白印跡法檢測(cè)了NAC對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞MMP表達(dá)的影響，結(jié)果表明IL-1β顯著上調(diào)軟骨細(xì)胞MMP-3、MMP-9、MMP-13及ADAMTS 4的蛋白表達(dá)水平，NAC預(yù)處理顯著下調(diào)IL-1β誘導(dǎo)的MMP-3、MMP-9、MMP-13及ADAMTS 4蛋白上調(diào)(P<0.05，見圖3a)，同時(shí)，NAC也能夠抑制IL-1β引起的軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解(見圖3b)。

2.4 NAC對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠PWT和膝關(guān)節(jié)直徑的影響 結(jié)果表明模型組大鼠的PWT值較假手術(shù)組顯著減小，灌胃給予NAC呈劑量性顯著增加OA大鼠的PWT值(P<0.05，見圖4a)；同時(shí)，膝關(guān)節(jié)直徑結(jié)果表明模型組大鼠的膝關(guān)節(jié)直徑顯著增加，但灌胃給予NAC呈劑量依賴性顯著減小OA大鼠的膝關(guān)節(jié)直徑(P<0.05，見圖4b)，這表明本研究成功建立了OA大鼠模型，同時(shí)表明NAC對(duì)OA具有潛在的保護(hù)作用。

2.5 NAC對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨組織MMP表達(dá)及基質(zhì)降解的影響 RT-PCR結(jié)果表明模型組大鼠軟骨組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達(dá)水平顯著上調(diào)，但給予NAC呈劑量依賴性下調(diào)OA大鼠軟骨組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達(dá)水平(P<0.05，見圖5a～c)。同時(shí)，番紅固綠染色結(jié)果表明模型組大鼠的軟骨基質(zhì)出現(xiàn)降解和破壞，給予NAC能夠顯著緩解OA大鼠的軟骨基質(zhì)破壞和降解(見圖5d)。

a 軟骨細(xì)胞的MTT細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果 b 軟骨細(xì)胞的PI染色結(jié)果(×40；紅色：PI，藍(lán)色：DAPI)

a 軟骨細(xì)胞中ROS的含量 b 軟骨細(xì)胞中GPX的活性 c 軟骨細(xì)胞中SOD的活性

a 軟骨細(xì)胞MMP的蛋白表達(dá)水平

b 軟骨細(xì)胞基質(zhì)染色結(jié)果(×40，阿爾法新藍(lán))

a OA大鼠的PWT值 b OA大鼠的膝關(guān)節(jié)直徑

a OA大鼠軟骨組織中MMP-3的表達(dá)水平 b OA大鼠軟骨組織中MMP-9的表達(dá)水平 c OA大鼠軟骨組織中MMP-13的表達(dá)水平

d OA大鼠軟骨組織染色結(jié)果(番紅固綠染色)

3 討 論

關(guān)節(jié)軟骨組織主要由軟骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)組成，在正常生理?xiàng)l件下，其處于一種穩(wěn)態(tài)水平，供氧量極少[7-8]。然而，機(jī)體發(fā)生異常時(shí)能夠產(chǎn)生許多有害因子，其能夠激活機(jī)體氧化應(yīng)激，引起ROS的過(guò)量產(chǎn)生[9]。大量ROS能夠通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路包括細(xì)胞因子受體、受體酪氨酸激酶及G蛋白耦聯(lián)受體等引起ECM降解。除此之外，ROS也能夠通過(guò)激活有絲分裂原激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[10]。最終，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過(guò)介導(dǎo)膠原酶活化的MMP引起ECM降解[11]。

IL-1作為第一個(gè)被鑒定的IL，其能夠影響所用的細(xì)胞及器官，且是自身炎癥、免疫及傳染性和退行性疾病的主要影響因子[12]。IL-1β作為IL-1的亞型之一，是一種重要的促炎細(xì)胞因子，其能夠通過(guò)Ⅰ型IL-1受體(IL-1R1)發(fā)揮效應(yīng)，在OA的病理發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，研究表明IL-1R1受體拮抗劑可用于關(guān)節(jié)炎的治療[13]。IL-1β信號(hào)通路能夠通過(guò)加速ECM降解并誘導(dǎo)過(guò)量ROS產(chǎn)生以及前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)和一氧化氮(nitric oxide，NO)的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)OA的病理發(fā)展[14]。因此，本研究首先采用IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞模型探討了NAC對(duì)軟骨基質(zhì)降解的作用及相關(guān)分子機(jī)制，本研究表明在軟骨細(xì)胞中NAC能夠抑制IL-1β引起的ROS產(chǎn)生、GPX及SOD活性，上述表明NAC能抑制細(xì)胞發(fā)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)。研究表明ROS對(duì)于降解ECM相關(guān)的MMPs是至關(guān)重要的，ROS能夠通過(guò)細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起MMP的表達(dá)，進(jìn)而引起膠原酶的活化，導(dǎo)致ECM降解[11]。本研究表明在軟骨細(xì)胞中NAC能夠下調(diào)IL-1β誘導(dǎo)的MMP-3、MMP-9、MMP-13及ADAMTS 4的表達(dá)，同時(shí)抑制IL-1β誘導(dǎo)的ECM降解。上述表明NAC可能通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)ROS抑制MMP的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生抗ECM降解作用。

氧化應(yīng)激引起的ECM降解在OA的病理發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用，由于體外結(jié)果表明NAC能夠通過(guò)抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激緩解ECM降解，這暗示著NAC具有潛在治療骨關(guān)節(jié)炎作用[15]，因此，接下來(lái)本研究采用骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型評(píng)價(jià)了NAC的抗骨關(guān)節(jié)炎作用及其對(duì)ECM降解的影響。首先，根據(jù)之前的研究采用膝關(guān)節(jié)交叉韌帶切斷術(shù)建立骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型用于后續(xù)的藥物干預(yù)研究[16]。結(jié)果表明模型組大鼠的膝關(guān)節(jié)腫脹顯著增大，同時(shí)PWT小于假手術(shù)組，這表明本研究成功建立了OA大鼠模型，為后面的實(shí)驗(yàn)干預(yù)研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同時(shí)，研究表明NAC呈劑量和時(shí)間依賴性增加OA大鼠的PWT，減小膝關(guān)節(jié)直徑，上述說(shuō)明NAC能夠緩解OA大鼠的關(guān)節(jié)腫脹和疼痛，對(duì)OA具有一定的潛在療效。同時(shí)，體內(nèi)結(jié)果表明灌胃給予NAC能夠顯著下調(diào)軟骨組織中MMP-3、MMP-9及MMP-13的表達(dá)，上述表明NAC對(duì)OA具有潛在的治療效果，并且與可能與抑制MMPs表達(dá)有關(guān)。

總的來(lái)說(shuō)，本研究結(jié)果表明NAC對(duì)OA具有潛在的治療作用，且這種作用與抑制MMP介導(dǎo)的ECM降解有關(guān)。但是，NAC是否能夠通過(guò)影響其他的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生抗骨關(guān)節(jié)炎效應(yīng)依然是未知的，因此，仍需進(jìn)一步探索。