bFGF聯(lián)合膠原膜對(duì)硬腭軟組織缺損大鼠病理及創(chuàng)面愈合的影響

馬 超，焦建軍

臨床上對(duì)口腔軟組織進(jìn)行修復(fù)時(shí)多采用自體游離皮瓣、肌皮瓣、黏膜瓣等，選用皮瓣、膜瓣能顯著提高移植物的存活率，但口腔環(huán)境較為特殊，移植組織無(wú)法與缺損區(qū)域完全結(jié)合時(shí)可能造成組織畸形，如移植后組織瓣出現(xiàn)毛發(fā)、汗腺等結(jié)構(gòu)，可能需進(jìn)行二次移植手術(shù)，多次手術(shù)給患者帶來(lái)巨大痛苦、延誤病情[1-3]。隨著組織修復(fù)研究的深入，膠原膜作為一種生物相容性、降解能力較好的組織修復(fù)材料，目前已在臨床上得到了較為廣泛的應(yīng)用，在口腔黏膜損傷、牙齦缺損、萎縮等領(lǐng)域中取得了較好的效果[4-5]。組織再生、修復(fù)過(guò)程中血管新生是極其重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)能對(duì)其起到促進(jìn)作用[6]。有研究證實(shí)，bFGF對(duì)創(chuàng)傷愈合、骨組織生長(zhǎng)、韌帶愈合均有一定的促進(jìn)作用，在骨肌腱愈合上同樣療效顯著，但有關(guān)bFGF結(jié)合膠原膜對(duì)硬腭軟組織缺損修復(fù)的相關(guān)報(bào)道仍較為罕見(jiàn)[7]。基于此，本文通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行建模分組實(shí)驗(yàn)，探討bFGF聯(lián)合膠原膜對(duì)大鼠硬腭軟組織缺損病理及創(chuàng)面愈合的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只SPF級(jí)健康Wistar大鼠，6周齡，平均體質(zhì)量(200.94±10.22)g，購(gòu)自長(zhǎng)沙天勤生物，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(湘)2019-0006。

1.2 主要試劑和儀器 bFGF與膠原膜(煙臺(tái)正海生物)，結(jié)合bFGF/膠原膜(中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所)、Trizol試劑(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司)，RT-PCR試劑盒(上海優(yōu)予生物科技有限公司)，油酸(上海士鋒生物科技有限公司)，ECL電化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯，日本)，熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，凝膠電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 模型制備 建模方法參考劉雙喜等[8]的研究，對(duì)30只大鼠予以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，撐開(kāi)大鼠口腔后，于口腔內(nèi)硬腭第一磨牙中心處至第三磨牙遠(yuǎn)中軟組織中央，采用切齦刀切3 mm直徑的圓形缺損，再以探針將缺損邊緣膜瓣去除，實(shí)驗(yàn)中切勿造成骨面損傷，處理完后以無(wú)菌棉球壓迫止血，整個(gè)實(shí)驗(yàn)于無(wú)菌條件下操作。

1.4 分組處理 將30只模型大鼠隨機(jī)分為3組：Bf組、Dd組、Nc組，每組各10只，Bf組大鼠采用結(jié)合bFGF/膠原膜植入，Dd組僅采用膠原膜植入，大小(5 mm×7 mm)基底膜向外粗糙面，面向骨面，邊緣處利用探針進(jìn)行貼合處理，將膠原膜與黏骨模板做縫合處理，Nc組不進(jìn)行植入修復(fù)處理。術(shù)后3組大鼠均連續(xù)給予5萬(wàn)單位青霉素肌注，并在飲水中添加甲硝唑預(yù)防感染，術(shù)后一周內(nèi)給予軟質(zhì)飲食，同時(shí)給予營(yíng)養(yǎng)液。

1.5 HE染色 術(shù)后2周斷頭處死大鼠，取其整個(gè)上頜骨，切取硬腭部分，采用4%甲醛溶液固定36 h，EDTA脫鈣處理后再用乙醇溶液脫水，以每個(gè)標(biāo)本矢狀面中央切開(kāi)，從中央到兩邊行5 μm連續(xù)矢狀面切片，蘇木精和伊紅染色液分別復(fù)染6～8 min，在10×40倍顯微鏡下觀察硬腭組織形態(tài)改變情況，將剩余硬腭組織保存于-80 ℃，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)中提取蛋白。

1.6 創(chuàng)面愈合率 在10×40的高倍光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色切片，采用Image Pro Express 6.0圖像處理軟件測(cè)量創(chuàng)面兩端上皮組織間的距離，計(jì)算每張切片創(chuàng)面愈合率，百分比越高創(chuàng)面愈合率越好，根據(jù)創(chuàng)面愈合率=(3-上皮組織間距離)/3×100%公式進(jìn)行計(jì)算。

1.7 微血管計(jì)數(shù) 在10×40的高倍光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色切片，隨機(jī)選取3個(gè)視野計(jì)算新生血管的數(shù)目，血管形態(tài)完整、管腔中含有紅細(xì)胞、管壁有內(nèi)皮細(xì)胞的即為新生血管，將所選擇視野的新生血管數(shù)取平均值。

1.8 RT-PCR檢測(cè)硬腭組織膠原 mRNA表達(dá)量將大鼠硬腭組織剪碎，加入胰蛋白酶消化，PBS溶液沖洗，滴入0.9%Nacl溶液，Trizol法提取總RNA，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ⅰ型膠原(TypeⅠ Collagen,ColⅠ)、ColⅢ mRNA表達(dá)水平，按說(shuō)明書(shū)步驟操作。內(nèi)參采用β-action，實(shí)驗(yàn)條件為：60 ℃、10 min；95 ℃、72 ℃，各30 s ；95℃，5 min；循環(huán)40次，ColⅠ基因正向引物5′-GAGCTGGTGTAATGGGTCCT-3′，反向引物5′-GAGACCCAGGAAGACCTCTG-3′；ColⅢ基因正向引物5′-CTCAGCACTAGAATCTGTCC-3′，反向引物5′-TGGTGTTGGAGCCGCTGCCA-3′；β-actin正向引物5′-GACGTAGCACAGCTTCTCCTTAATG-3′，反向引物5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′。以2-ΔΔCT法計(jì)算ColⅠ、ColⅢ相對(duì)表達(dá)量。

1.9 Westernblot法檢測(cè)硬腭組織膠原蛋白表達(dá) 將大鼠硬腭組織剪碎，加入胰蛋白酶消化，PBS沖洗，提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)、封閉、添加一抗過(guò)夜、酶標(biāo)二抗孵育、電化學(xué)發(fā)光顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，軟件自動(dòng)計(jì)算灰度值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察 3組大鼠硬腭組織均有較多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。Bf組可發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生成增多，明顯新生血管生成，僅見(jiàn)少量膠原膜；Dd組新生血管數(shù)量及成纖維細(xì)胞較Bf組少；Nc組新生血管數(shù)量及成纖維細(xì)胞少于其他兩組，圖1。

圖1 HE染色(×200)

2.2 創(chuàng)面愈合率 與Nc組、Dd組比較，Bf組愈合率有所升高，3組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 3組創(chuàng)面愈合率的比較*#分別表示與Bf組、Db組比較，P<0.05

2.3 微血管計(jì)數(shù)比較 與Nc組比較，Bf組新生血管數(shù)量增加，與Dd組比較，Bf組新生血管數(shù)量亦有所增多，3組新生血管數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 3組新生血管數(shù)目的比較*#分別表示與Bf組、Db組比較，P<0.05

2.4ColⅠ、ColⅢmRNA表達(dá)情況的比較 與Bf組比較，Dd組大鼠ColⅠ、ColⅢmRNA水平顯著升高，與Dd組比較，Nc組大鼠ColⅠ、ColⅢmRNA水平顯著升高，3組ColⅠ、ColⅢmRNA表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

圖4 3組ColⅠ、ColⅢ mRNA表達(dá)情況*#分別表示與Bf組、Db組比較，P<0.05

2.5 硬腭組織ColⅠ、ColⅢ蛋白表達(dá)的比較 與Bf組比較，Dd組大鼠ColⅠ、ColⅢ蛋白表達(dá)增加明顯，與Dd組比對(duì)，Nc組大鼠ColⅠ、ColⅢ蛋白表達(dá)有所增加，Nc組ColⅠ、ColⅢ蛋白表達(dá)最高，Dd組其次，Bf組最低，3組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

圖5 硬腭組織ColⅠ、ColⅢ蛋白表達(dá)*#分別表示與Bf組、Db組比較，P<0.05

3 討論

口腔軟組織缺損誘發(fā)因素較多，如先天畸形、外傷、腫瘤切除等，修復(fù)后組織易出現(xiàn)僵硬、癱痕等，嚴(yán)重者甚至?xí)适Э谇还δ?，出現(xiàn)語(yǔ)言障礙、張口困難，還可能造成上頜發(fā)育異常，因此軟組織缺損修復(fù)與重建仍是臨床口腔外科工作者的研究重心之一[9]。近年來(lái)，膠原膜以其較好的生物相容性和可降解特性從多種修復(fù)材料中脫穎而出，它不僅能促進(jìn)凝血，還可以增加細(xì)胞附著能力，適用范圍愈發(fā)寬廣[10]。研究發(fā)現(xiàn)膠原膜能結(jié)合多種生長(zhǎng)因子，使這些因子緩慢釋放于缺損部位，進(jìn)而發(fā)揮更強(qiáng)的促修復(fù)效能，成為近年來(lái)臨床研究熱點(diǎn)之一。bFGF是成纖維生長(zhǎng)因子家族成員之一，臨床實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)bFGF能促進(jìn)細(xì)胞增殖與分裂，介導(dǎo)新生血管生成，并且參與了人體多種組織的修復(fù)過(guò)程[11]。本研究主要探討了膠原膜與bFGF的結(jié)合用于口腔硬腭軟組織缺損的修復(fù)效果及其可能的分子機(jī)制，以期為臨床口腔軟組織缺損修復(fù)提供參考。

本研究通過(guò)大鼠建模與分組修復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Bf組大鼠硬腭組織缺損處可發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生成增多，明顯新生血管生成，膠原膜也發(fā)生一定吸收，Dd組新生血管數(shù)量及成纖維細(xì)胞較Bf組少，而未接受任何植入修復(fù)的Nc組新生血管數(shù)量及成纖維細(xì)胞最少。定量比較發(fā)現(xiàn)Bf組創(chuàng)面愈合率及微血管數(shù)最高，Dd組其次，Nc組創(chuàng)面愈合率最低。在軟組織缺損修復(fù)時(shí)，血管新生是十分重要的一個(gè)過(guò)程，新生的血管可以為創(chuàng)傷組織輸送血液、氧及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還會(huì)將組織代謝產(chǎn)物運(yùn)出損傷區(qū)域，促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化，進(jìn)而促進(jìn)了損傷區(qū)域的修復(fù)[12-13]。膠原膜為異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，其成分主要為細(xì)胞外基質(zhì)與膠原，可連接血管內(nèi)皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞，為其提供優(yōu)良的生存環(huán)境，使得細(xì)胞能在其支架上生長(zhǎng)、增殖，并分泌新的細(xì)胞外基質(zhì)，從而完成對(duì)缺損部位的修復(fù)與重建[14-15]。bFGF屬于促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在誘導(dǎo)毛細(xì)血管生成、刺激組織細(xì)胞生長(zhǎng)中具有重要作用，機(jī)體損傷后可自發(fā)分泌bFGF，但分泌量較少，而采用膠原膜結(jié)合bFGF，能使其在缺損部位達(dá)到有效濃度，同時(shí)在較長(zhǎng)一段時(shí)間能維持緩慢釋放，bFGF對(duì)上皮細(xì)胞增殖有明顯效用，使得損傷邊緣向中心生長(zhǎng)修復(fù)，創(chuàng)面明顯縮小，傷口愈合率能明顯升高[16-17]。既往劉雙喜等[8]采用bFGF/膠原膜復(fù)合材料亦達(dá)到了提高創(chuàng)面愈合率與新生血管數(shù)的效果，與本研究一致。

此外，本研究通過(guò)對(duì)3組大鼠相關(guān)分子表達(dá)進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，Nc組ColⅠ、ColⅢ mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平最高，Dd組其次，Bf組最低。ColⅠ、ColⅢ是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，反映了膠原代謝狀況，文獻(xiàn)報(bào)道創(chuàng)傷后瘢痕形成與ColⅠ、ColⅢ在體內(nèi)過(guò)渡沉積有關(guān)，損傷修復(fù)停止后，膠原蛋白合成就會(huì)增加，促使局部生長(zhǎng)因子過(guò)度分泌，引發(fā)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，刺激局部細(xì)胞增生、肥大，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成，阻礙組織修復(fù)進(jìn)程[18-20]。有研究者發(fā)現(xiàn)，bFGF結(jié)合膠原膜修復(fù)軟組織損傷促進(jìn)血管新生，為損傷區(qū)域提供充分的血供，將創(chuàng)傷愈合期間產(chǎn)生的膠原Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ等代謝物運(yùn)出損傷區(qū)，加快組織修復(fù)，明顯提高創(chuàng)面愈合速度，這與本研究結(jié)果中Bf組ColⅠ、ColⅢ表達(dá)下調(diào)一致[21]。

綜上所述，bFGF聯(lián)合膠原膜能進(jìn)一步促進(jìn)硬腭軟組織缺損的修復(fù)，提高創(chuàng)面愈合率，該作用可能與下調(diào)ColⅠ、ColⅢ表達(dá)有關(guān)。未來(lái)可以從膠原蛋白表達(dá)的信號(hào)通路繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，以進(jìn)一步明確bFGF對(duì)膠原蛋白的調(diào)控機(jī)制如何影響組織修復(fù)重建過(guò)程。