消瘀泄?jié)犸媽KD2～4 期患者免疫調(diào)節(jié)功能及微炎癥狀態(tài)的影響

王安妮 魯科達(dá) 夏璁 朱夢潔 來潔 何靈芝

1.杭州市中醫(yī)院 杭州 310007 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 3.浙江綠城心血管病醫(yī)院4.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院

微炎癥狀態(tài)是一種非微生物感染引起的、以促炎癥因子釋放增加為關(guān)鍵環(huán)節(jié)的持續(xù)而輕微的炎癥反應(yīng)。 研究認(rèn)為，微炎癥狀態(tài)能夠刺激循環(huán)免疫復(fù)合物生成，加重營養(yǎng)不良、貧血狀態(tài)，增加心血管事件發(fā)生風(fēng)險等， 從多方面加速慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）的進(jìn)展[1－3]。“消瘀泄?jié)犸嫛毕祰壹壝嗅t(yī)李學(xué)銘教授治療慢性腎衰竭氣虛夾瘀濁證的自擬方，本課題組通過前期研究證明“消瘀泄?jié)犸嫛蹦軌蚪档痛傺滓蜃影捉樗兀?（interleukin－6，IL－6）、白介素－17（interleukin－17，IL－17）水平，升高抑炎因子白介素－10（interleukin－10，IL－10）水平，從而改善CKD患者的微炎癥狀態(tài)[4]。IL－17由輔助性T細(xì)胞17（helper T cell 17，Th17） 特異性分泌，IL－17水平升高提示患者體內(nèi)Th17細(xì)胞比例升高；IL－10是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg） 發(fā)揮免疫抑制作用的重要參與因子，IL－10水平降低預(yù)示著Treg的不足。Th17、Treg在維持人體免疫平衡中起到重要作用。 維甲酸相關(guān)孤兒受體γt（retinoid－related orphan receptor γt，RORγt）、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子p3（forkhead box p3，F(xiàn)oxp3） 分別是Th17、Treg的特異性轉(zhuǎn)錄因子， 在Th17、Treg分化發(fā)育、分泌效應(yīng)因子等過程中發(fā)揮重要作用[5－6]。 本研究擬觀察消瘀泄?jié)犸媽KD 2～4期患者免疫平衡及微炎癥狀態(tài)的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 對象和方法

1.1 病例資料 選取2015年11月1日至2018年9月30日在浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎病科門診及住院診治的CKD2～4期患者80例， 采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和治療組各40例。 兩組患者的性別、 年齡、病程、分期、原發(fā)病差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。 見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)、 排除標(biāo)準(zhǔn)與退出標(biāo)準(zhǔn) 本研究已通過浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理審查委員會審查。

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）符合改善全球腎臟病預(yù)后（Kidney Disease Improving Global Outcomes，KDIGO）組織2012年發(fā)布的《KDIGO慢性腎臟病評價管理臨床實踐指南》[7]中“慢性腎臟病定義與分期”CKD 2～4期標(biāo)準(zhǔn)，即15mL·min－1≤雙腎腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）＜90mL·min－1。 本研究中雙腎GFR以99m锝－二乙三胺五乙酸腎動態(tài)顯像法測定。（2）中醫(yī)證型為氣虛夾瘀濁證，辨證分型參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[8]。 （3）年齡18～65歲。 （4）自愿參與臨床研究，并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）6個月內(nèi)使用過血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑/血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、 激素和免疫抑制劑者；（2） 急性腎功能衰竭以及行腎臟替代治療者；（3）合并酸中毒、水電解質(zhì)紊亂、難以糾正的感染或出血者，以及臟器功能嚴(yán)重受損者；（4）合并惡性腫瘤者；（5）妊娠或哺乳期女性。

1.2.3 剔除標(biāo)準(zhǔn) （1）依從性差，不規(guī)律用藥者或?qū)λ幬锍煞诌^敏者；（2）治療過程中出現(xiàn)血肌酐（serum creatinine，sCr）持續(xù)升高，達(dá)到或超過707μmol·L－1者；（3）治療過程中出現(xiàn)難以糾正的酸中毒、 高血鉀、腫瘤、腦血管意外、重癥感染等嚴(yán)重合并癥者；（4）治療過程中發(fā)生妊娠者。

1.2.4 脫落標(biāo)準(zhǔn) （1）治療過程中主動退出臨床試驗者；（2）隨訪過程中聯(lián)系中斷者。

1.3 干預(yù)方案

1.3.1 對照組 予基礎(chǔ)治療， 主要包括：（1）規(guī)律起居，避免劇烈運(yùn)動；（2）優(yōu)質(zhì)低蛋白飲食（蛋白質(zhì)攝入量0.6～0.8g·d－1）；（3）復(fù)方α－酮酸制劑口服，1片/5kg體重（北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品， 劑量：0.63g/片，國藥準(zhǔn)字：H20041442）；（4）控制血壓，目標(biāo)為130/80mmHg。

1.3.2 治療組 在對照組基礎(chǔ)上，結(jié)合中醫(yī)辨證加用消瘀泄?jié)犸嬛委?，藥物統(tǒng)一由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供。 具體組成：生黃芪30g，牛膝12g，桃仁12g，地龍12g，制大黃10g，車前草20g。隨癥加減：尿中蛋白多者，加蟬衣6～9g、僵蠶9g；鏡下血尿多者，加茜草12g、白茅根15g、蒲黃炭10g；水腫明顯者，加茯苓皮30g、車前子30g；納呆苔膩，加米仁30g、六神曲12g；腰酸腰痛者，加炒川斷15g、炒狗脊15g、制川烏6g；夜尿多者，加覆盆子15～30g、金櫻子15g、芡實10g；寐差者，加丹參15g、五味子6g。 用法：1劑/d，水煎服，分溫二服，共服12周。

1.4 指標(biāo)評估

1.4.1 安全性指標(biāo) 入組前及治療開始后每14d監(jiān)測患者血壓、心電圖和肝功能、電解質(zhì)水平。

1.4.2 療效性指標(biāo) 入組前及治療后分別以反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)檢測RORγt、Foxp3 mRNA相對表達(dá)量，以免疫比濁法檢測超敏C反應(yīng)蛋白（high sensitivity－C reactive protein，hs－CRP）水平。 sCr、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、24h尿蛋白定量（24－h(huán)our urinary protein quantity，24Upr）水平檢測采用全自動生化分析儀完成。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 計量資料以x±s表示，兩組間比較，滿足正態(tài)分布和方差齊性的采用t檢驗， 不滿足的采用Wilcoxon Mann－Whitney秩和檢驗； 兩組治療前后組內(nèi)比較，滿足正態(tài)分布的采用配對t檢驗，不滿足的采用配對秩和檢驗。 計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者治療前后RORγt mRNA、Foxp3 mRNA表達(dá)比較 治療前兩組患者RORγt mRNA、Foxp3 mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 與治療前比較， 治療組治療后RORγt mRNA水平下降、Foxp3 mRNA水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組治療后RORγt mRNA、Foxp3 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。兩組治療前后指標(biāo)差值組間比較， Foxp3 mRNA差值、RORγt mRNA差值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見表2。

表2 兩組患者治療前后RORγt mRNA、Foxp3 mRNA表達(dá)比較（×10-4）

2.2 兩組患者治療前后hs－CRP水平比較 治療前兩組hs－CRP水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 與治療前比較，治療組治療后hs－CRP水平下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組hs－CRP水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 兩組治療前后指標(biāo)差值組間比較，hs－CRP水平差值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見表3。

2.3 兩組患者治療前后sCr、BUN、24Upr水平比較 治療前兩組sCr、BUN、24Upr水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 與治療前比較，治療組治療后sCr、BUN、24Upr水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組治療后sCr、BUN、24Upr水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。兩組治療前后指標(biāo)差值組間比較，sCr、BUN水平差值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；24Upr水平差值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表4。

2.4 安全性指標(biāo) 本研究期間，對照組有1例患者血鉀輕度升高，予利尿排鉀治療后，血鉀恢復(fù)正常。 兩組均無患者退出研究。

3 討論

消瘀泄?jié)犸嬍菄壹壝嗅t(yī)李學(xué)銘教授治療慢性腎衰竭氣虛夾瘀濁證的自擬方， 全方由生黃芪、制大黃、牛膝、桃仁、地龍、車前草組成。 方中重用生黃芪，使氣旺血行、瘀去絡(luò)通；制大黃蕩滌腸胃積滯，使邪從大便而去，共為君藥。 牛膝活血化瘀，性善下行，使小便通利、大便易瀉；地龍善走竄，通經(jīng)絡(luò)，利小便，可引諸藥通行腎絡(luò)；桃仁祛瘀通便；車前草通下利水，四藥共用，可蕩滌瘀濁，使邪從二便而去，共為臣藥。方中六藥同行，共奏益氣行血、祛瘀化濁之效。 研究表明，黃芪能夠上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2表達(dá)，下調(diào)轉(zhuǎn)化生 長 因 子－β1（transforming growth factor－β1，TGFβ1）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1和血管緊張素Ⅱ的表達(dá)，抑制p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，p38 MAPK）信號通路，并能降低氧化應(yīng)激損傷，從而保護(hù)腎臟[9－10]。 大黃能通過改善氨基酸循環(huán)、胰島素抵抗和血脂紊亂狀態(tài)來改善腎功能[11－12]。牛膝可下調(diào)p53基因表達(dá)， 上調(diào)鼠雙微體2（murine double minute 2，mdm2）基因表達(dá)，抑制腎組織細(xì)胞凋亡[13]。地龍可通過抗氧化和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平來抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖，降解細(xì)胞外基質(zhì)[14]。 桃仁能降低核因子－κB（nuclear factor－κB，NF－κB）和腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）水平，延緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程[15]。車前草能夠通過增強(qiáng)蛋白分子CD2相關(guān)蛋白（CD2－associated protein，CD2AP）及nephrin的表達(dá)， 從而維持腎足細(xì)胞的生物學(xué)功能[16]?？梢娤鲂?jié)犸嬆軓恼{(diào)節(jié)免疫功能、減少氧化應(yīng)激損傷、改善營養(yǎng)物質(zhì)代謝等多方面延緩腎病進(jìn)展。 本研究結(jié)果亦提示消瘀泄?jié)犸嬙诟纳泼庖哒{(diào)節(jié)功能及微炎癥狀態(tài)方面起著積極作用， 其機(jī)制可能與下調(diào)RORγt mRNA、 上調(diào)Foxp3 mRNA水平、 調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡相關(guān)。

表3 兩組患者治療前后hs-CRP比較（mg·L-1）

表4 兩組患者治療前后sCr、BUN、24Upr比較

Th17由初始CD4+T細(xì)胞在TGF－β、IL－6誘導(dǎo)下分化而來，并在RORγt作用下產(chǎn)生促炎因子IL－17。 微炎癥狀態(tài)下，Th17的分化、RORγt mRNA的表達(dá)及IL－17的分泌均會增加[17]。IL－17可促進(jìn)單核細(xì)胞趨化蛋白－1（monocyte chemoattractant protein－1，MCP－1/CCL2）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白－1α（macrophage inflammatory protein－1α，MIP－1α/CCL3）等的釋放，招募T淋巴細(xì)胞和單核－巨噬細(xì)胞在腎小球系膜細(xì)胞附近浸潤[18]；并可誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL－6、TNF－α等炎性因子， 促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤和組織損傷； 還能誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡， 造成腎功能減退[19]。Eller等[20]研究發(fā)現(xiàn)，抑制Th17活化、減少IL－17表達(dá)可延緩糖尿病腎病發(fā)展。

Treg細(xì)胞通過直接抑制及分泌IL－10等細(xì)胞因子抑制免疫應(yīng)答。 Foxp3是Treg的特征性轉(zhuǎn)錄因子，在Treg細(xì)胞的分化及細(xì)胞因子分泌過程中起重要作用。微炎癥狀態(tài)可能會減弱Treg細(xì)胞的免疫抑制效應(yīng)。有研究指出，促炎因子IL－6能夠抑制誘導(dǎo)性Treg在外周的發(fā)育， 該過程可能與上調(diào)miR－34a及miR－31的表達(dá)、促進(jìn)NF－κB磷酸化，導(dǎo)致Foxp3 mRNA翻譯受阻有關(guān)[21]。 另外也有研究證明，抑制Foxp3基因表達(dá)會導(dǎo)致Treg抑炎因子IL－10的產(chǎn)生和分泌下降， 其機(jī)制可能是與其他轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)蛋白如活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）、NF－κB、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1 （runt related transcription factor 1，Runx1）等形成蛋白復(fù)合體相關(guān)[22]。 Foxp3的表達(dá)下降引起Treg細(xì)胞及IL－10水平降低， 使免疫平衡向炎癥方向傾斜，進(jìn)一步加重微炎癥狀態(tài)。

Foxp3 mRNA對RORγt mRNA的表達(dá)也有一定影響。Ryba－stanistawowska等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度的TGF－β作用下，F(xiàn)oxp3 mRNA的特定結(jié)構(gòu)域能夠競爭性結(jié)合維甲酸相關(guān)孤兒核受體C （retinoic acid receptor related orphan C，RORC）， 招募乙?；D(zhuǎn)移酶（Tat－interactive protein，TIP）和去乙?；?，致使靶基因組蛋白轉(zhuǎn)錄沉默， 從而抑制RORγt mRNA的轉(zhuǎn)錄活性。 微炎癥狀態(tài)下，F(xiàn)oxp3表達(dá)下降，對RORγt的抑制作用減弱，使Th0更趨向于分化為Th17，產(chǎn)生促炎因子， 進(jìn)一步加重微炎癥狀態(tài)。 有研究發(fā)現(xiàn)，增加Treg細(xì)胞損耗， 降低IL－10水平會增加小鼠模型尿蛋白/肌酐比值， 從另一角度證明適當(dāng)提高Treg細(xì)胞比例和IL－10水平對腎功能具有保護(hù)作用[20]。

既往觀點(diǎn)認(rèn)為hs－CRP是一種非特異的炎癥標(biāo)志物，隨著認(rèn)識的深入現(xiàn)已將其作為CKD微炎癥狀態(tài)的重要評判指標(biāo)[24]，而且其本身也參與到腎臟損害的過程中。 作為促炎因子，hs－CRP主動參與炎癥反應(yīng)，能與腎小管上皮細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，釋放趨化因子C－X3－C基元配體1（C－X3－C motif chemokine ligand 1，CX3CL1）和TGF－β1，使基質(zhì)中Ⅰ型膠原蛋白含量增加，加速腎臟纖維化[25]。 本研究證明消瘀泄?jié)犸嬆軌蚪档虲KD2～4期患者h(yuǎn)s－CRP水平，減輕微炎癥狀態(tài)。 同時本研究也提示消瘀泄?jié)犸嬆軌蚪档蛃Cr、BUN、24Upr水平， 證明其具有增加代謝產(chǎn)物排泄、保護(hù)腎功能的作用，與既往研究結(jié)果一致[26－27]。

綜上所述， 消瘀泄?jié)犸嬆軌蚋纳艭KD2～4期患者Th17/Treg細(xì)胞平衡及微炎癥狀態(tài)，從而延緩腎臟病進(jìn)展。 在日后的研究中，可以采用流式細(xì)胞檢測技術(shù)直接檢測Th17、Treg細(xì)胞水平，進(jìn)一步完善實驗結(jié)果。