骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移大鼠模型建立及清肺固金湯的干預(yù)研究

徐葉峰 劉云霞 姚勇偉 王翌慶 楊潔文

杭州市第三人民醫(yī)院 杭州 310009

骨肉瘤（osteosarcoma）好發(fā)于兒童及青少年，是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤。 骨肉瘤惡性程度極高，易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，肺是其最常見的轉(zhuǎn)移部位。 肺轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致骨肉瘤治療失敗及低生存率的根本原因，約85%～90%的患者就診時已存在微小轉(zhuǎn)移灶[1]。 目前臨床上骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的治療主要依靠大劑量多藥聯(lián)合化療，甲氨蝶呤、多柔比星、順鉑和異環(huán)磷酰胺是常用的化療藥物。 近年來，盡管靶向、免疫治療有了較大發(fā)展，骨肉瘤患者的總體預(yù)后仍然較差，Ⅳ期患者5年生存率低于20%。 骨肉瘤屬于中醫(yī)學(xué)中的“骨瘤”“骨疽”“下石疽”等病證范疇，多由稟賦不足，正氣虧虛，邪氣趁虛而入，隨經(jīng)絡(luò)氣血走行，深入骨髓，導(dǎo)致氣血凝滯，經(jīng)絡(luò)受阻，傷筋蝕骨，日久結(jié)毒成瘤。 邪毒乘虛隨經(jīng)氣或血脈流竄，客于臟腑，日久成積而導(dǎo)致骨肉瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。 本病以肺（氣）虛為本，痰阻為標(biāo)，肺氣虛后期形成的“痰濁”是肺組織免疫抑制微環(huán)境形成的重要條件，隨著病情進(jìn)展，最終形成適宜轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞定植生長的“土壤”，促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。本課題組在臨床上選用清肺固金湯（黃芪、浙貝、薏苡仁、白花蛇舌草、桔梗）化裁防治骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移，獲得良好的療效[2]。 為了進(jìn)一步明確該復(fù)方對骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的作用， 本研究針對骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的核心病機(jī)，構(gòu)建“肺虛痰阻證”骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移病證結(jié)合大鼠模型，以期闡明清肺固金湯對骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的干預(yù)作用及其內(nèi)在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和實驗動物 大鼠骨肉瘤細(xì)胞株UMR-106購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心提供。雄性無特殊病原體（special pathogen free，SPF）級SD大鼠80只，6周齡，體質(zhì)量（180±20）g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號碼：SCXK（滬）2018-0006]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心[實驗動物使用許可證號碼：SYXK（浙）2018-0012]SPF級環(huán)境，籠具、墊料、飲水、 飼料等均嚴(yán)格消毒。 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗。

1.2 藥物與試劑 清肺固金湯由生黃芪30g（產(chǎn)地內(nèi)蒙古，批號：160412）、浙貝母10g（產(chǎn)地浙江，批號：160517）、薏苡仁30g（產(chǎn)地浙江，批號：160328）、白花蛇舌草30g（產(chǎn)地浙江，批號：160201）和桔梗6g（產(chǎn)地安徽，批號：160301），共5味中藥組成，所有藥材均購于華東醫(yī)藥公司， 將以上藥物濃煎為生藥濃度2.0g·mL-1的藥液，調(diào)整pH值至7.0～7.2，分裝后0.22μm過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?胎牛血清、洛斯維爾帕克紀(jì)念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）1640培養(yǎng)基均購于Gibco公司（批號：42F6555K、AAJ206662）；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）購于Hyclone公司（批號：NAH1449）；胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素雙抗均購于北京索萊寶科技有限公司 （批號：20160431、20160318）； 二甲基亞砜購于Amersco公司（批號：0564C328）；白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、 轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒均購于酶免生物公司（批號：MM-0181R1、MM-0195R1）；趨化因子受體4（CXC motif receptor 4，CXCR4）抗體購于Novus公司（批號：NB100-56437）。

1.3 儀器 LDZ5-2型自動平衡離心機(jī)購于北京醫(yī)用離心機(jī)廠；HEPA Class100型培養(yǎng)箱購于Thermo公司；生物安全柜為Thermo公司產(chǎn)品；雙缸中藥煎藥機(jī)ZG-280購于吉首市中誠制藥機(jī)械廠；RE-300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器為上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；MLS-3750高壓滅菌鍋購于日本SANYO 公司；Thermo Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀購于Thermo公司；Nikon Eclipse 80i顯微鏡購于Nikon公司；Carl Zeiss Imaging Systems為Carl Zeiss公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 動物分組、 造模 將80只SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、骨肉瘤模型組、骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型組、清肺固金組4組，每組20只。 實驗第1天，將對數(shù)生長期的UMR-106細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×108個/mL。 除空白對照組外，在無菌條件下用25μL微量進(jìn)樣器將腫瘤細(xì)胞接種于其余3組大鼠右后肢脛骨近端骨髓腔內(nèi)，接種量為20μL/只，即5×106個細(xì)胞。接種第8天起， 骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型組和清肺固金組大鼠以冷風(fēng)刺激加煙熏法建立“肺虛痰阻證”模型，將兩組大鼠置于較飼養(yǎng)環(huán)境溫度低5℃的冷風(fēng)下刺激10min，然后置于煙熏柜中，將0.2g硫磺粉均勻撒于半根清艾條內(nèi)，點燃艾條，艾條燃盡后2h取出大鼠。 以上操作2次/d，共30d。

1.4.2 動物模型判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.2.1 骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移大鼠模型判定 骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移大鼠模型判定參照骨肉瘤患者臨床、影像、病理三結(jié)合的診斷原則，具體如下：（1）患肢脛骨干增粗，伴有周圍軟組織腫脹；（2）患肢X線檢查提示病灶部位存在骨質(zhì)破壞現(xiàn)象，骨密度增高，呈梭形改變；（3）腫塊部位及肺結(jié)節(jié)病灶病理提示細(xì)胞核大深染， 異型性明顯，局部腫瘤中心有壞死[3]。

1.4.2.2 “肺虛痰阻證”大鼠模型判定 判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）大鼠毛發(fā)枯槁，口鼻分泌物增多，精神萎靡，活動遲緩，出現(xiàn)咳嗽或咳痰，可聞及明顯痰鳴音，伴氣促，飲食、飲水量增加，體質(zhì)量增加緩慢；（2）病理切片提示有氣道上皮脫失、杯狀細(xì)胞和腺體增生等表現(xiàn)[4]。

1.4.3 干預(yù)方法 空白對照組大鼠正常飼養(yǎng)，不進(jìn)行藥物干預(yù)；骨肉瘤模型組與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型組接種后第8天開始以0.9%氯化鈉溶液2.5mL/250g灌胃，1次/d，持續(xù)8周；清肺固金組以清肺固金湯2.5mL/250g灌胃，1次/d，持續(xù)8周。 清肺固金湯劑量按《中藥藥理研究方法學(xué)》[5]中人鼠等效劑量進(jìn)行換算，成人體質(zhì)量以60kg計算，SD大鼠體質(zhì)量以250g計算，清肺固金湯為106g/（劑·d），計算得出人鼠等效劑量為20g/（kg·d）。

1.4.4 檢測指標(biāo) 各組大鼠末次灌胃后4h，腹主動脈取血，3 000r/min離心15min后， 小心吸取上層血清，滅活后過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩⑷⊙蟮暮闪龃笫笾糜诒?，迅速開胸分離雙側(cè)肺組織，并取右側(cè)脛骨，剝離瘤塊，測量原發(fā)灶及各轉(zhuǎn)移灶瘤體直徑，同時稱取瘤體質(zhì)量。 采用橢球體體積公式計算瘤體體積，瘤體體積（mm3）=a×b2/2（a為長徑，b為短徑）。 以0.9%氯化鈉溶液沖洗后分別保存，用于后續(xù)病理及ELISA檢測。 甲醛溶液固定的骨組織及肺組織以石蠟包埋，逐級乙醇脫水，依次進(jìn)行1%蘇木素染色，分化，伊紅染色，脫水，透明封片后光鏡下觀察

1.4.4.1 原發(fā)灶評估 依據(jù)瘤體體積計算體積抑瘤率，體積抑瘤率（%）=1-（清肺固金組平均瘤體體積/各模型組平均瘤體體積）×100%。 依據(jù)原發(fā)灶瘤塊質(zhì)量計算質(zhì)量抑瘤率，質(zhì)量抑瘤率（%）=1-（清肺固金組平均瘤體質(zhì)量/各模型組平均瘤體質(zhì)量）×100%。

1.4.4.2 轉(zhuǎn)移灶評估 在40倍光鏡下觀察并計數(shù)肺臟表面及內(nèi)部轉(zhuǎn)移灶數(shù)量，取典型病灶，行常規(guī)蘇木素伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色，由高年資病理科醫(yī)師確認(rèn)診斷。 以刀片小心分離所有轉(zhuǎn)移灶，游標(biāo)卡尺測定大小，并進(jìn)行分級。 轉(zhuǎn)移灶分級標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ級，直徑＜0.5mm；Ⅱ級，直徑0.5～1.0mm；Ⅲ級，直徑1.0～2.0mm；Ⅳ級，直徑＞2.0mm。 總轉(zhuǎn)移級數(shù)=Ⅰ級×1+Ⅱ級×2+Ⅲ級×3+Ⅳ級×4。 肺轉(zhuǎn)移率（%）=發(fā)生轉(zhuǎn)移的例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4.4.3 ELISA法檢測血清及瘤體IL-10、TGF-β1含量各組分別取10份采集后凍存的血清，采用ELISA雙抗體夾心法檢測血清IL-10、TGF-β1含量， 在多功能全波長酶標(biāo)儀450nm處讀取數(shù)據(jù)。 再分別取對應(yīng)的10份腫瘤組織， 充分勻漿后采用同樣的方法檢測瘤體內(nèi)IL-10、TGF-β1含量。

1.4.4.4 Western blot法檢測大鼠右脛骨組織CXCR4蛋白表達(dá) 各組分別取另10份右脛骨組織，脫鈣后每20mg加入放射免疫沉淀 （radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液200μL，充分研磨，勻漿后提取組織蛋白質(zhì)，Lowry法測定蛋白質(zhì)濃度。 每孔上樣量為60μg/20μL，電泳后轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉后加入目標(biāo)蛋白一抗，4℃孵育過夜，洗滌后加入二抗，最后以電 化 學(xué) 發(fā) 光 技 術(shù)（electrochemiluminesence，ECL）檢測，以甘油醛-3-磷酸脫氧酶（glyceraldehyde-3-phosphote dehydrogenase， GAPDH） 為內(nèi)參照計算各目標(biāo)蛋白灰度值，檢測CXCR4蛋白相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以x±s表示，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，滿足方差齊性時，組間兩兩比較采用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法；方差不齊時，采用Games-Howell法。 多因素比較采用析因設(shè)計的方差分析。 等級資料組間比較采用秩和檢驗。 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型建立結(jié)果 與空白對照組比較，下肢X線檢查提示，骨肉瘤模型組大鼠右脛骨干骺端骨質(zhì)破壞，呈團(tuán)片狀密度增高影， 局部可見成骨性軟組織腫塊。解剖后可見腫瘤位于右脛骨干骺端， 切面呈灰白色，質(zhì)地硬，并向骨髓腔內(nèi)浸潤性生長。 兩肺表面可見多處散發(fā)灰白色轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)，邊界清楚，形態(tài)、大小、質(zhì)地不一，觸之較硬，有顆粒感。 病理檢查可見骨肉瘤模型組右脛骨存在大量核大深染的異型細(xì)胞，核質(zhì)比增大，核分裂像多見；肺組織內(nèi)肺泡結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞異型性增加，可見骨母細(xì)胞，伴鈣化。 結(jié)合影像學(xué)表現(xiàn)，符合骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移，證明大鼠骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型成功建立。 見圖1、2。

圖1 大鼠下肢X線攝片及右脛骨及肺大體形態(tài)Fig.1 X－ray film of lower limbs and gross morphology of right tibia and lung of rats

圖2 空白對照組及骨肉瘤模型組右脛骨及肺組織病理切片（HE染色，10×）Fig.2 Blank control group and osteosarcoma model group right tibia and lung pathology（HE staining， 10×）

進(jìn)一步建立“肺虛痰阻證”病證結(jié)合模型發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型組大鼠毛發(fā)枯槁，活動遲緩，精神萎靡，口鼻分泌物增多，常出現(xiàn)咳嗽或咳痰，可聞及明顯痰鳴音，伴氣促，飲食、飲水量增加，但體質(zhì)量增加緩慢。 而空白對照組大鼠毛發(fā)潔白光澤， 活潑好動，反應(yīng)靈敏，食欲旺盛，無咳嗽氣促、痰鳴等異常表現(xiàn)。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、 瘤體質(zhì)量及抑瘤率比較 給藥前各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。藥物干預(yù)8周后，各組間總體比較，大鼠體質(zhì)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 與空白對照組比較，骨肉瘤模型組、骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型組、清肺固金組大鼠體質(zhì)量均減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），其中骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型組平均體質(zhì)量最輕，清肺固金組平均體質(zhì)量最重，接近于空白對照組。與骨肉瘤模型組比較，骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型組瘤體質(zhì)量增加18.70%， 體積增大31.85%；清肺固金組瘤體質(zhì)量減輕6.5%，體積減少31.26%。 與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型組比較，清肺固金組瘤體質(zhì)量、 體積均明顯減低， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。 見表1。

2.3 轉(zhuǎn)移灶評估結(jié)果 骨肉瘤模型組、 骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型組、清肺固金組均可見肺轉(zhuǎn)移灶，兩肺表面可見多處散發(fā)灰白色肺轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)，形態(tài)、大小、質(zhì)地不一，觸之較硬，有顆粒感。 骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型總轉(zhuǎn)移級數(shù)及（Ⅲ+Ⅳ）肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目最高，骨肉瘤模型組次之，清肺固金組最低；而清肺固金組（Ⅰ+Ⅱ）較低級別肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目最高，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表2。

2.4 各組大鼠血清及瘤體IL－10、TGF－β1含量比較 空白對照組血清中IL－10、TGF－β1均有一定表達(dá)。 與空白對照組比較，骨肉瘤模型組、骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型組血清中IL－10、TGF－β1明顯上調(diào)， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。 與骨肉瘤模型組比較，骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型組血清及瘤體內(nèi)IL－10、TGF－β1含量均增加，清肺固金組含量均有降低， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01，P＜0.05）。 與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型組比較，清肺固金組血清及瘤體內(nèi)IL－10、TGF－β1含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。 見表3。2.5 各組大鼠右脛骨組織CXCR4表達(dá)比較 與空白對照組比較，骨肉瘤模型組與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型組的CXCR4蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）。 與骨肉瘤模型組比較，骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移組的CXCR4蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 與兩模型組比較，清肺固金組蛋白表達(dá)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。 見圖3、表4。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、瘤體質(zhì)量及抑瘤率比較Tab.1 Comparison of body weight， tumor weight and tumor inhibition rate in each group

表2 各組大鼠肺轉(zhuǎn)移情況及肺轉(zhuǎn)移灶大小比較Tab.2 Pulmonary metastasis and size of pulmonary metastases in each group

表3 各組大鼠血清及瘤體IL-10、TGF-β1含量比較（x±s）Tab.3 Comparison of the contents of IL-10，TGF-β1 in serum and tumor in each group（x±s）

圖3 各組右脛骨組織中CXCR4蛋白表達(dá)Fig.3 CXCR4 protein expression in right tibial tissue in each group

表4 各組大鼠CXCR4總光密度值比較（x±s，×106）Tab.4 Comparison of total optical density of CXCR4 in each group（x±s， ×106）

3 討論

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，好發(fā)于兒童及青少年，每年發(fā)病率約為2～3/100萬人，占所有骨惡性腫瘤的35%[6]。 在我國，每年約新增6 000～7 000例患者[7]，嚴(yán)重威脅兒童和青少年的身心健康。 骨肉瘤惡性程度極高，容易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，雖然有手術(shù)、化療等綜合治療手段，仍有32%～46%患者發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，Ⅳ期患者5年生存率低于20%[8]。 因此，肺轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致骨肉瘤治療失敗及患者低生存率的根本原因，也是目前限制療效的最主要因素。 尋找安全有效的藥物以改善肺組織局部微環(huán)境，降低遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率，已成為當(dāng)前骨肉瘤研究新的突破方向。

骨肉瘤屬于中醫(yī)學(xué)中的 “骨瘤”“骨疽”“下石疽”等病證范疇。 本病多由稟賦不足，正氣虧虛，邪氣趁虛而入，隨經(jīng)絡(luò)氣血走行，深入骨髓，導(dǎo)致氣血凝滯，經(jīng)絡(luò)受阻，傷筋蝕骨，日久結(jié)毒成瘤。 如李中梓[9]在《醫(yī)宗必讀》中云：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之。 ”邪毒乘虛隨經(jīng)氣或血脈流竄，客于臟腑，日久成積， 從而導(dǎo)致骨肉瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。 肺主一身之氣，調(diào)節(jié)全身氣機(jī)，宣發(fā)肅降，布散全身津液；肺朝百脈，全身血液朝會于肺， 故不論是氣的走行還是津液、血液的運(yùn)行，均通過經(jīng)脈上達(dá)于肺；且肺為嬌臟，五臟華蓋，不耐寒熱，易被邪侵，因此肺首當(dāng)其沖成為骨瘤最易侵襲轉(zhuǎn)移的部位。 化療、 手術(shù)治療后脾胃受損，運(yùn)化失司，氣血生化乏源，常引起肺氣不足。 《素問·六節(jié)藏象論》謂：“肺者，氣之本，魄之處也。 ”肺氣虛，不能行氣運(yùn)血、布津化痰，進(jìn)而痰濁阻滯、痰瘀互結(jié)，復(fù)感癌毒，肺積乃成。正如《醫(yī)門法律》所言：“肺氣清肅，則周身之氣莫不服從而順行；肺氣壅濁，則周身之氣易致橫逆而犯上。 ”[10]本病以肺（氣）虛為本，痰阻為標(biāo)，本虛標(biāo)實，由此筆者推測，肺氣虛后期形成的“痰濁”等病理產(chǎn)物可能是導(dǎo)致肺組織免疫抑制微環(huán)境形成的重要條件，隨著病情進(jìn)展，最終形成適宜循環(huán)腫瘤細(xì)胞定植生長的“土壤”，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。 因此，在腫瘤治療中，特異性地保護(hù)靶器官微環(huán)境，正契合中醫(yī)治未病思想，“未病先安未受邪之地”[11]， 調(diào)整氣血陰陽平衡，阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的途徑，對于預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移有著重要的實踐價值。

本課題組依據(jù)中醫(yī)有關(guān)骨肉瘤的病因病機(jī)，結(jié)合肺轉(zhuǎn)移的病理基礎(chǔ)，采用浙江省名中醫(yī)劉云霞的經(jīng)驗方“清肺固金湯”配合化療預(yù)防骨肉瘤術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，取得了顯著的療效[2]。 全方由黃芪、浙貝、薏苡仁、白花蛇舌草、桔梗組成，其中黃芪、浙貝、薏苡仁均入肺經(jīng)，桔梗更是肺之引經(jīng)藥，共奏化痰清肺、益氣固金之效，能夠有效防治骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移。 張紅翠[12]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可通過提高淋巴細(xì)胞增殖率，增強(qiáng)自然殺傷（natural kiuer，NK）細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活性，進(jìn)而提高機(jī)體的免疫功能，發(fā)揮抗腫瘤的作用。 薏苡仁多糖對腫瘤細(xì)胞不僅具有直接殺傷作用，還能通過激活免疫細(xì)胞如NK細(xì)胞、T細(xì)胞等間接攻擊腫瘤細(xì)胞，并且在相對濃度較低情況下就可以表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)作用[13]。 白花蛇舌草包括171種化合物，包括環(huán)烯醚萜、三萜類、黃酮類、蒽醌類等，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗成纖維細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)等多種作用，并能調(diào)節(jié)多個基因的表達(dá)[14]。

腫瘤轉(zhuǎn)移是在多基因調(diào)控、多靶點作用下的復(fù)雜病理過程，包括腫瘤細(xì)胞運(yùn)動遷移、免疫逃逸、歸巢定植、黏附浸潤、新生血管生成等[15-17]。 對于骨肉瘤患者，肺組織作為循環(huán)腫瘤細(xì)胞特異性親和器官，其局部微環(huán)境中免疫活性細(xì)胞的種類、密度、分布和功能狀態(tài)與腫瘤的發(fā)展和預(yù)后都有著極其密切的聯(lián)系。腫瘤微環(huán)境中聚集的大量免疫抑制細(xì)胞及其分泌的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)因子是其發(fā)揮免疫監(jiān)視逃逸效應(yīng)的主體。研究表明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regulatory cells，Tregs）作為最典型的免疫抑制細(xì)胞，在腫瘤病變部位普遍存在，可大量分泌TGF-β1、IL-10等負(fù)性免疫調(diào)節(jié)因子，其免疫抑制作用已被證實[18-19]。 TGF-β1和IL-10通過促進(jìn)叉頭框蛋白P3（forkhead box protein P3，F(xiàn)oxP3）和細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原-4 （cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）的表達(dá)來增強(qiáng)誘導(dǎo)型Treg的分化，從而促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸[20]。Sawant等[21]研究報道，在腫瘤微環(huán)境中Tregs細(xì)胞亞群分泌IL-10和IL-35， 并通過調(diào)節(jié)多種抑制性受體表達(dá)，協(xié)同促進(jìn)腫瘤內(nèi)T細(xì)胞功能衰竭。 TGF-β1在免疫抑制微環(huán)境形成過程中起先導(dǎo)作用，其主要通過抑制機(jī)體的免疫功能[22]，造成Treg/Th失衡，進(jìn)而募集髓源抑制性細(xì)胞（myeloid derived suppressor cell，MDSC），抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞 （cytotoxic T lymphocyte，CTL）及NK細(xì)胞浸潤， 促使循環(huán)腫瘤細(xì)胞 （circulating tumor cells，CTCs）逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視；同時上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)，增加新生血管生成，從而促進(jìn)腫瘤的惡化和轉(zhuǎn)移[23]。

CXCR4是編碼352個氨基酸的G蛋白偶聯(lián)受體，有7個跨膜結(jié)構(gòu)域，高度保守，其基因位于第4號染色體。 研究表明，CXCR4在超過23種惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，普遍存在于骨肉瘤細(xì)胞中，與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[24-25]。 CXCR4的異常表達(dá)與腫瘤的存活增殖、血管生成、歸巢轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 研究顯示，CXCR4在胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌等腫瘤中均呈高表達(dá)狀態(tài)，同時與生存率密切相關(guān)[26-27]。 在骨與軟組織肉瘤中，薈萃分析證實了CXCR4表達(dá)與較高的轉(zhuǎn)移率及不良預(yù)后密切相關(guān)[25]。Pollino等[28]研究也顯示，骨肉瘤中CXCR4的高表達(dá)使腫瘤復(fù)發(fā)的可能性更高。 動物實驗發(fā)現(xiàn)，阻斷趨化因子配體12（cxcligand 12，CXCL12）/CXCR4表達(dá)可以減少小鼠骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生[29]。 因此，CXCR4可能是監(jiān)測患者預(yù)后的重要預(yù)測因子。

本研究成功建立了“肺虛痰阻證”骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移病證結(jié)合大鼠模型，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與骨肉瘤模型組比較，骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型組體質(zhì)量減輕，清肺固金組體質(zhì)量增加。 說明清肺固金湯在維持荷瘤大鼠體質(zhì)量、提高生存質(zhì)量方面具有明顯的作用。 與骨肉瘤模型組、骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型組比較，清肺固金組瘤體質(zhì)量、體積均明顯減少。 病理檢查發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型組的肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目最多，Ⅲ+Ⅳ級結(jié)節(jié)比例最高，而清肺固金組肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目及Ⅲ+Ⅳ級結(jié)節(jié)比例均為最低。 該結(jié)果提示，清肺固金湯對骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移行為均具有顯著的抑制作用。 ELISA及Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組比較，骨肉瘤模型組、 骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型組的血清IL-10、TGF-β1含量以及右脛骨CXCR4蛋白表達(dá)均增加； 與骨肉瘤模型組比較，骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型組血清及瘤體內(nèi)IL-10、TGF-β1含量，右脛骨CXCR4蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加，而清肺固金組能夠抑制IL-10、TGF-β1含量及CXCR4蛋白表達(dá)。 由此可見，清肺固金湯具有較好的抗骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移作用，其作用可能與下調(diào)肺組織免疫微環(huán)境相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1表達(dá)， 抑制趨化因子受體CXCR4表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究初步探討了清肺固金湯通過調(diào)控肺組織免疫微環(huán)境及靶向CXCR4受體發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，但其具體有效作用成份及結(jié)合位點尚不明確， 有待進(jìn)一步深入研究。 本研究的開展，為揭示中醫(yī)藥靶向治療的可行性及科學(xué)內(nèi)涵，以及清肺固金湯等中藥復(fù)方更好地研究開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了可靠的理論和實驗依據(jù)。