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    柿葉片中單寧含量的動(dòng)態(tài)變化研究*

    2021-02-27 09:14:56李泯錕程洪斌竇思遠(yuǎn)
    科技與創(chuàng)新 2021年3期
    關(guān)鍵詞:柿葉單寧兒茶素

    李泯錕,程洪斌,宋 超,竇思遠(yuǎn),王 耘,黃 雯

    (1.金陵科技學(xué)院園藝園林學(xué)院,江蘇 南京210038;2.南京市蔬菜科學(xué)研究所,江蘇 南京210042)

    柿葉味苦、澀,富含多酚類、黃酮類、萜類、鞣質(zhì)等化學(xué)成分[1],具有活血化瘀、降血壓等功效[2],已被開發(fā)為保健柿葉茶[3-4]??扇苄詥螌幨且饾兜闹饕镔|(zhì),也存在于柿果實(shí)中[5],是一種重要的食品功能成分,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療等領(lǐng)域[6]。目前柿單寧提取多以果實(shí)為原料,柿葉利用較少,而韓衛(wèi)娟等[5]的研究結(jié)果顯示部分品種的葉片可溶性單寧年均含量高于果實(shí)。因此柿葉可作為提取柿單寧的原料,減少對(duì)果實(shí)資源的浪費(fèi)。

    黑柿是黑色柿品種,果實(shí)含糖量高,軟化后味濃甜,枝條拱形生長,具有觀賞價(jià)值[7]。黑柿分布少,關(guān)于黑柿葉單寧含量動(dòng)態(tài)變化和成分相關(guān)的報(bào)道極少,前期的研究發(fā)現(xiàn)黑柿葉中單寧含量較紅柿葉高,是一種較好的新資源。本研究以黑柿和紅柿柿葉為主要測定對(duì)象,對(duì)比不同時(shí)期葉片中可溶性單寧含量的變化規(guī)律,鑒定單寧含量最高時(shí)期的組分,該結(jié)果無論對(duì)最佳采樣時(shí)期,還是對(duì)原材料的選擇都具有重要的指導(dǎo)作用,為充分開發(fā)黑柿子資源中功能性成分提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集

    供試材料:紅柿(富有甜柿)、黑柿。從2019-07—2019-11采樣于金陵科技學(xué)院園藝站,共計(jì)12 次。液氮速凍后,置于-80 ℃保存。待測樣品于95 ℃下烘干至恒重,研磨成粉末過40 目篩,密封置于干燥器中,待后續(xù)測定實(shí)驗(yàn)使用。

    1.2 材料與儀器

    材料包括沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%,合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)、福林酚試劑(源葉生物公司)、無水乙醇、無水碳酸鈉、乙腈、甲醇、甲酸、醋酸銨,均為國產(chǎn)分析純。

    儀器包括超低溫冰箱、超高效液相系統(tǒng)(Vanquish,Thermo,USA)、高分辨質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(Q exactive,Thermo)、UV-5500 型紫外可見分光光度計(jì)、高速離心機(jī)、恒溫烘干箱。

    1.3 測定方法

    1.3.1 柿葉單寧的提取及測定

    參照韓衛(wèi)娟等[5]和于曉銳等[8]的提取方法,略作修改,具體如下:稱取0.200 0 g 樣品,用10 mL、60%乙醇在超聲波清洗儀中恒溫60 ℃萃取40 min,定容至25 mL,離心取上清液待測。以牛廣財(cái)?shù)萚9]福林-酚比色法測定,略作修改,利用飽和碳酸鈉溶液提供穩(wěn)定的堿性環(huán)境、靜置顯色反應(yīng)時(shí)間為2 h。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并進(jìn)行樣品測定。

    柿單寧含量為:

    式(1)中:x為利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得到的濃度,mg/mL;V為定容的容量,mL;N為稀釋倍數(shù);m為樣品質(zhì)量,g。

    1.3.2 單寧清除DPPH 自由基能力的測定

    采用DPPH 法測定[10],用無水乙醇配制成質(zhì)量濃度為0.065 mmol/L 的DPPH 溶液。將提取所得的柿葉單寧梯度稀釋為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL,以相同濃度Vc 為對(duì)比。將待測液分別與DPPH 溶液避光反應(yīng)30 min,在517 nm 處測定溶液的吸光度,并通過下式計(jì)算DPPH 自由基清除率。

    抑制率計(jì)算如下:

    式(2)中:Ac為乙醇代替樣品的吸光度;Ai為DPPH 加提取物吸光度;Aj為無水乙醇代替DPPH 溶液的吸光度。

    1.3.3 單寧組分測定

    1.3.3.1 樣本預(yù)處理

    取200 mg 樣品,加入2M 鹽酸,80C 酸解3 h;取酸解液200 μL,旋轉(zhuǎn)濃縮干燥;加入1 mL 的50%甲醇溶液復(fù)溶;14 000 r/min 離心10 min,取上清液用C8 SPE 小柱純化。

    1.3.3.2 色譜條件

    色譜系統(tǒng)采用的是超高效液相系統(tǒng),根據(jù)化合物的性質(zhì),采用Waters HSS T3(50×2.1 mm,1.8 μm)液相色譜柱,進(jìn)樣量為2 μL,柱溫為40 ℃;流動(dòng)相A(0.1%甲酸-乙腈),流動(dòng)相B(0.1%甲酸-水)。流動(dòng)相梯度如表1 所示。

    表1 流動(dòng)相梯度

    1.3.3.3 質(zhì)譜參數(shù)

    鞘氣40,輔助氣10,離子噴霧電壓為2 800 V,溫度為350 ℃,離子傳輸管溫度為320 ℃。

    1.3.4 保存條件對(duì)單寧含量的影響

    采摘后將柿葉干燥處理,低溫組中,將葉片置于-80 ℃;干燥組中,將葉片置于干燥器中室溫避光保存,7 d 后按照1.3.3 的方法進(jìn)行含量測定。

    1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

    采用SPSS10.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及制圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線

    沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示,沒食子酸的質(zhì)量濃度在0~0.10 mg/mL 內(nèi)與A765吸光值呈良好的線性關(guān)系,在此范圍內(nèi)的線性回歸方程為y=15.235x+0.0617,R2=0.998 3。

    2.2 柿葉單寧含量動(dòng)態(tài)變化

    監(jiān)測期內(nèi)兩種柿葉動(dòng)態(tài)變化規(guī)律大致相同,均呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)。兩種柿葉7 月份含量較低且穩(wěn)定,隨后8 月份開始下降,此時(shí)果實(shí)處于幼果至膨大期,可溶性單寧會(huì)富集于果實(shí)中,8 月中旬含量出現(xiàn)最低點(diǎn),9 月中下旬含量迅速上升。紅柿葉于10 月中旬含量達(dá)到最高后下降,黑柿葉9 月下旬出現(xiàn)快速富集,且持續(xù)上升,在落葉前含量未見下降,是潛在的優(yōu)質(zhì)資源。柿葉單寧含量的變化如圖2 所示。

    圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

    圖2 柿葉單寧含量的變化

    2.3 柿葉單寧的抗氧化性

    DPPH 自由基是一種較穩(wěn)定的自由基,常應(yīng)用于抗氧化能力的測定。如圖3 所示,兩種柿葉醇提物對(duì)DPPH 氧化都具有抑制作用,且存在劑量效應(yīng)。在相同濃度下,黑柿葉提取液抑制率較紅柿葉高。5 μg/mL 黑柿葉提取物對(duì)DPPH 自由基清除率為42.17%,同濃度Vc 對(duì)DPPH 自由基清除率為24.09%,與紅柿葉提取物清除率相近。20 μg/mL 濃度下三者對(duì)DPPH 自由基都有較好的清除效果,高于20 μg/mL 后Vc 的清除效果最好。黑柿葉單寧提取物、紅柿單寧提取物和抗壞血酸的IC50分別為6.33 μg/mL、11.16 μg/mL 和11.40 μg/mL,因此,黑柿葉提取物有較好的抗氧化能力。柿葉單寧對(duì)DPPH 清除能力如圖3 所示。

    圖3 柿葉單寧對(duì)DPPH 清除能力

    2.4 柿葉單寧組分分析

    由圖3 可知,柿葉中檢測出8 種單寧組分,分別是沒食子兒茶素(Gallocatechin,GC)、表沒食子兒茶素(Epigallocatechin,EGC)、兒茶素(Catechin,CA)、表兒茶素((Epicatechin,EC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(Gallocatechin gallate,GCG)、表兒茶素沒食子酸酯(Epicatechin gallate,ECG)和鞣花酸(Ellagic acid),其中GC 和CA 含量最多,尤其是常溫貯藏7 d 的黑柿葉其中GC 含量(23.43 ng/mg)是紅柿葉的(3.1 ng/mg)7 倍多,CA 含量達(dá)到了37.65 ng/mg 是紅柿葉的5 倍多。通過貯存試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),無論常溫還是低溫,7 d 后GC、EGC、CA、EC 出現(xiàn)含量上升的現(xiàn)象,常溫貯藏條件更利于黑柿葉中成分富集,而低溫利于紅柿葉;有研究表明水不溶性酚類物質(zhì)在貯藏期間可轉(zhuǎn)化為可溶性物質(zhì),部分酚類物質(zhì)的氧化中間產(chǎn)物也可能被還原[11],導(dǎo)致含量升高,但是具體原因還需要進(jìn)一步研究。EGCG、GCG、ECG 和鞣花酸含量在貯藏過程中降低。此外柿葉中槲皮素-3-O-呋喃葡萄糖苷和槲皮素兩種黃酮類物質(zhì)含量非常豐富,烘干的紅柿葉中槲皮素-3-O-呋喃葡萄糖苷含量可達(dá)到230.73 ng/mg,槲皮素含量為278.23 ng/mg,烘干的黑柿葉中槲皮素-3-O-呋喃葡萄糖苷含量為151.53 ng/mg,槲皮素含量為124.02 ng/mg。但是黑柿葉中蘆丁和芹菜素含量非常少,因此,成分的測定可為開發(fā)柿葉新功能奠定基礎(chǔ)。

    黑柿葉中單寧組分的變化如圖4 所示。紅柿葉中單寧組分的變化如圖5 所示。

    圖4 黑柿葉中單寧組分的變化

    圖5 紅柿葉中單寧組分的變化

    3 討論與結(jié)論

    柿葉中含有黃酮甙類、二萜類、茶多酚、橙皮甙等活性物質(zhì)[12],本試驗(yàn)利用超聲波輔助提取法對(duì)柿葉中的單寧進(jìn)行提取,結(jié)果表明,柿葉中單寧的積累隨著生長發(fā)育時(shí)期的不同而變化,且具有一定的規(guī)律性。富有甜柿和黑柿葉中單寧含量動(dòng)態(tài)變化規(guī)律大致相同,均呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)。7月份含量較低且穩(wěn)定,隨后8 月中旬含量下降出現(xiàn)最低點(diǎn),這可能是果實(shí)的生長和其中單寧富集有關(guān),9 月中下旬迅速回升此時(shí)果實(shí)逐漸成熟。富有甜柿葉在10 月中旬達(dá)到最高峰,而黑柿葉自9 月下旬至落葉前一直呈增長趨勢(shì),尤其是落果后黑柿葉中單寧含量豐富,可作為單寧提取的資源,既可避免資源浪費(fèi),又可提高經(jīng)濟(jì)效益。柿果中單寧含量在7—8 月達(dá)到峰值,與柿葉單寧出現(xiàn)錯(cuò)峰,即葉片中含量自幼果期緩慢下降后,成熟后期迅速升高,但是關(guān)于柿果與葉片中單寧成分和含量是否存在相關(guān)性尚需進(jìn)一步研究。

    該研究對(duì)兩種柿葉中單寧的抗氧化活性進(jìn)行探究,在設(shè)定的濃度范圍內(nèi),單寧與DPPH 清除率呈現(xiàn)劑量關(guān)系,較低的值表明更高的自由基清除能力,IC50說明黑柿葉提取物是一種較好的抗氧化物質(zhì)。

    分析兩種柿子葉成分得知,黑柿葉和紅柿葉中單寧的存在形式和含量并不一致。其中GC 和CA 含量在單寧物質(zhì)中最豐富,黑柿葉中這兩種成分含量都高于紅柿葉,貯藏7 d后含量還會(huì)升高。同時(shí)柿葉中還含有槲皮素及其衍生物等多種黃酮類物質(zhì)。中國柿品種豐富,資源開發(fā)利用潛力巨大,今后應(yīng)在開發(fā)、推廣新資源的基礎(chǔ)上深入研究有效成分及生物生產(chǎn)特性,為柿資源的進(jìn)一步深加工和利用奠定基礎(chǔ)。

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