GC-MS測定不同采收期酸棗仁中脂肪油成分

馬東來，李新蕊，司明東，溫子帥，鄭玉光，邱峰

（1.河北中醫(yī)學院河北省中藥炮制技術創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050200；2.天津中醫(yī)藥大學中藥學院，天津 300193）

酸棗仁為鼠李科植物酸棗 [Ziziphous jujuba Mill.Var.Spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chow]的干燥成熟種子，為藥食同源的傳統(tǒng)中藥，具有養(yǎng)心補肝、寧心安神、斂汗、生津等功效[1]?，F(xiàn)代化學及藥理研究表明[2-3]，酸棗仁中主要有效成分有脂肪油、三萜皂苷、黃酮、多糖、生物堿和氨基酸等，其中酸棗仁中脂肪油在失眠、陣痛等領域療效顯著，有“東方睡油”美譽[4]。隨著酸棗仁臨床用藥需求的增加，部分酸棗仁產(chǎn)區(qū)藥農(nóng)為了爭取最大的經(jīng)濟效益，出現(xiàn)嚴重的“搶青”現(xiàn)象，導致酸棗仁藥材顆粒不飽滿、質量不合格，嚴重影響了酸棗仁臨床療效[5]。因此規(guī)范和確定酸棗仁最佳采收時間對于保證酸棗仁質量有重要意義。

氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術為研究中藥材中脂肪油類成分提供便捷方法[6-7]，雖對酸棗仁中脂肪油的GC-MS技術測定已有相關研究[8-9]，但尚未見采用GC-MS對不同采收期酸棗仁中脂肪油成分進行動態(tài)分析和確定采收期的報道。因此本課題組在前期研究基礎上，利用GC-MS分析不同采收期酸棗仁中脂肪油成分進行動態(tài)分析，以期為酸棗仁最佳采收時間的優(yōu)選提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸棗仁分別在7月15日（果實半紅期，S1）、8月15日（果實脆熟期，S2）和9月15日（果實完熟期，S3）采自河北省邢臺縣東川口村，經(jīng)河北中醫(yī)學院藥學院鄭玉光教授鑒定為真品；正己烷（色譜純）：天津市大茂化學試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（Agilent 7890A-5977B）：美國安捷倫科技有限公司；電子分析天平（BSA224SCW）：賽多利斯科學儀器有限公司；超聲波清洗儀（KQ-250DE）：昆山市超聲儀器有限公司；加熱磁力攪拌器（RCT Basic）：德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 酸棗仁脂肪油成分提取

精密稱取3個時期酸棗仁粉末（過60目篩）2.0 g，置索氏提取器中，加入正己烷100 mL，水浴回流提取4 h，減壓蒸出溶劑，得黃綠色脂肪油，稱重，計算得率。在上述脂肪油中加入5 mL 0.5 mol/L NaOH的甲醇溶液，回流反應1 h后，加入8 mL BF3乙醚溶液繼續(xù)反應30 min，反應結束后，用正己烷萃取和飽和NaCl溶液洗滌有機相，有機相用無水Na2SO4干燥，并定容于25mL容量瓶中，備用。

1.3.2 GC-MS色譜條件

氣相色譜條件[10]為色譜柱：HP-5柱（50m×250μm×0.25 μm）；程序升溫：起始溫度 60 ℃，保持 2 min，以3℃/min升溫至165℃，再以20℃/min升溫至280℃，保持5 min；載氣為高純氮氣，載氣流量為1.0 mL/min；進樣量 1 μL，分流進樣，分流比為 10∶1；汽化室溫度為250℃。

質譜條件為EI離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；四極桿質量監(jiān)測器，溫度150℃；掃描范圍m/z：40 amu～500 amu；溶劑延遲 4 min；載氣為氦氣（純度99.999%）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

經(jīng)GC-MS分析得到3個采收期的酸棗仁樣品的總離子流圖，各峰經(jīng)質譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索并與NIST 11標準質譜檢索庫和參考有關文獻數(shù)據(jù)進行定性分析，采用峰面積歸一法測定各成分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 GC-MS色譜條件方法學考察

對3個采收期的酸棗仁樣品的代表性總離子流圖如圖1所示。

酸棗仁脂肪油成分及其相對百分含量見表1。

圖1 不同時期酸棗仁中脂肪油組分的GC-MS代表性總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of fatty oil components of ziziphi spinosae semen in three seasons

表1 3個時期酸棗仁脂肪油化合物的組成和相對含量Table 1 The compositions a-relative contents of fatty oil components among ziziphi spinosae semen with three seasons processed

2.1.1 精密度試驗

取酸棗仁樣品（S3），按“1.3.1”項條件下制備供試品，在“1.3.2”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，以棕櫚酸甲酯（峰a）為參照，測得6個共有峰（相對含量＞1%）的相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值均＜0.47%，表明儀器精密度良好。

2.1.2 重復性試驗

取酸棗仁樣品（S3），共 6份，按“1.3.1”項條件下制備供試品，在“1.3.2”項色譜條件下分別進樣，以棕櫚酸甲酯（峰a）為參照，測得6個共有峰（相對含量＞1%）的相對保留時間的RSD值均＜0.86%，相對峰面積的RSD值均＜2.76%，表明該方法重復性良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗

取同批酸棗仁樣品（S3）的供試品溶液，在“1.3.2”項色譜條件下分別于 0、2、4、8、12、24 h 進樣，以棕櫚酸甲酯（峰a）為參照，測得6個共有峰（相對含量＞1%）的相對保留時間的RSD值均＜0.56%，相對峰面積的RSD值均＜2.32%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 不同時期酸棗仁中脂肪油的組成特點

由表1可知，酸棗仁S1、S2和S3樣品中脂肪油量分別為23.17%、28.35%和29.25%，共檢出并鑒定到29種脂肪油成分，酸棗仁S1、S2和S3樣品中分別檢測出20、17和23種脂肪油成分，包括脂肪酸類14種、碳氫化合物8種、醇類4種、醛類1種、含氮化合物1種和含硫化合物1種。

脂肪油成分的種類與相對含量隨著時間的推移逐漸增加，其中酸棗仁S3樣品中脂肪油成分種類與含量均為最多，共23種，總含量為292.5 mg/g，其次為酸棗仁S1樣品，共20種，含量231.7 mg/g，酸棗仁S2樣品中最少，共17種，含量283.5 mg/g。

由圖1和表1可知，酸棗仁S1、S2和S3樣品中脂肪油物質主要以脂肪酸類、碳氫化合物和醇類化合物為主，其中酯類物質種類最多，脂肪油成分含量較高，在酸棗仁 S1、S2、S3 中分別檢測鑒定到 11、11、13 種，相對含量分別為92.85%、97.29%、95.99%；其次是碳氫化合物，在酸棗仁S1、S2、S3中分別檢測鑒定到4、1、7種，相對含量分別為1.29%、0.36%、1.43%；再是醇類物質，在酸棗仁S1、S2、S3中分別檢測鑒定到 3、4、2種，相對含量分別為2.10%、0.71%、0.40%。

3 結論與討論

酸棗仁是我國傳統(tǒng)的中藥，其種植和用藥歷史已有幾千年，近年開發(fā)的酸棗仁油被譽為“東方睡油”，具有較好的治療失眠的功效。酸棗仁的生長發(fā)育階段對其有效成分調(diào)控和積累，其中脂肪性類化合物的種類、數(shù)量和含量隨著酸棗仁的發(fā)育而逐漸升高，在果成熟時達到高峰[9]。本試驗采用GC-MS技術對河北省道地酸棗仁不同采收期的脂肪油成分進行測定，共鑒定出29種成分，分為不飽和脂肪酸類、飽和脂肪酸類、碳氫化合物和醇類化合物這4大類組分。3個不同時期酸棗仁分別檢測出20、17、23種脂肪油成分，由此可見脂肪油成分在種類數(shù)量上相差不大，但各類脂肪油成分的相對含量存在一定差異。不同時期的10個共有脂肪油成分表現(xiàn)出4種變化趨勢：（1）呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢有3種：反式油酸甲酯、順式-11-二十碳烯酸甲酯、山崳酸甲酯；（2）呈現(xiàn)出持續(xù)下降的趨勢有3種：棕櫚酸甲酯、花生酸甲酯、硬脂酸甲酯；（3）呈現(xiàn)出高-低-高的復雜變化有3種：硫酸二乙酯、葉綠醇、2，5-二叔丁基酚；（4）呈現(xiàn)出低-高-低的變化趨勢有3種：亞油酸甲酯、反油酸乙酯、花生酸甲酯。

酸棗仁中的許多飽和/不飽和脂肪酸類物質對人類健康有益，有很強商業(yè)價值，越來越受到醫(yī)藥、保健品企業(yè)的重視。本研究初步闡述了酸棗仁不同時期脂肪油成分的變化，其中S3樣品中脂肪油量最高，且鑒定出23種成分。該結論與課題組前期[11]對酸棗仁的高效液相色譜分析斯皮諾素和酸棗仁皂苷A的結果十分相似，即9月中旬后酸棗果實變?yōu)槿t后其含量最高，也進一步確定酸棗仁在9月中旬后再進行采收比較合理。