水產(chǎn)品中志賀氏菌雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法建立與應(yīng)用

朱芳茜，何擴(kuò)*，張秀媛，李育峰，陳一，王云峰，王碩，趙瑞平

（1.河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000；2.南開大學(xué)，天津 300000）

志賀氏菌（Shigella）通稱痢疾桿菌，在我國(guó)感染性腹瀉病原菌中高居首位，它主要侵染人體的結(jié)腸，引發(fā)腸道炎癥、潰瘍以及頻繁的黏液性血性腹泄，少數(shù)嚴(yán)重可導(dǎo)致驚厥、低鈉血癥、低血糖、溶血性尿毒綜合征、腸穿孔和死亡[1-2]。每年全世界有1.6億人感染此類疾病，約有110萬(wàn)人死亡，其中5歲以下兒童為主要受害者[3]。由于水源或食品受到志賀氏菌污染會(huì)引起痢疾、腹瀉等疾病[4]。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確的志賀氏菌檢測(cè)方法顯得尤為重要。目前，志賀氏菌常用檢測(cè)方法主要有兩大類：一是傳統(tǒng)生化培養(yǎng)法，二是快速檢測(cè)法。傳統(tǒng)生化培養(yǎng)法結(jié)果準(zhǔn)確，且無復(fù)雜設(shè)備等特點(diǎn)，但由于步驟繁瑣、周期長(zhǎng)、試劑繁多等缺陷，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代快速檢測(cè)的需要[5-6]?；诰酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)、分子生物學(xué)原理的各種快速檢測(cè)法具有準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但由于其需要昂貴的試劑和設(shè)備、有時(shí)需帶回專業(yè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)等缺陷，無法滿足現(xiàn)場(chǎng)分析的需要[7-9]。經(jīng)典的免疫學(xué)分析方法具備靈敏度高、特異性強(qiáng)、周期短、操作簡(jiǎn)單和成本低等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于食品有毒有害物的檢測(cè)中，其中酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）最為常用[10]。針對(duì)以上情況，本研究以廣泛污染水產(chǎn)品的志賀氏菌抗原免疫動(dòng)物獲取多克隆抗體，在此基礎(chǔ)上建立雙抗夾心ELISA方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)水產(chǎn)樣品的志賀氏菌定性及定量快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、卵清蛋白（ovalbumins，OVA）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑：美國(guó) Sigma 公司；石蠟油、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine，TMB）：Biosharp 公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；志賀氏菌培養(yǎng)基、聚乙二醇 1500 （polyethylene glycol1500，PEG1500）：Gibco公司；新西蘭大耳白兔（雌性，兩月齡）：軍事科學(xué)研究院；志賀氏菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌及副溶血弧菌菌株：河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存制備；LB肉湯培養(yǎng)基：青島天祺生物科技有限公司；蛋白純化柱（Protein A-Sepharose 4B）：美國(guó)Amersham公司；扇貝：市購(gòu)；其它試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Fisher Multiskan酶標(biāo)儀：美國(guó)thermo公司；RH-KT加熱磁力攪拌器：美國(guó)IKA公司；Profinia蛋白純化儀、Powerpac蛋白電泳儀：美國(guó)BIO-RAD公司；SPH-300D恒溫?fù)u床：上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 免疫原制備

將實(shí)驗(yàn)室保存的志賀氏菌（ATCC12022）活化后，挑取菌種接種到LB肉湯培養(yǎng)基（200 mL）中，搖床200r/min，37℃振蕩培養(yǎng)24h，培養(yǎng)后的菌液5000r/min離心10min，收集的菌體用0.01mol/LpH7.4磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌兩次，加入 30 mL 0.5%福爾馬林，室溫20℃下作用24 h滅活菌體，5 000 r/min 離心 10 min，收集菌體[11-12]。

1.3.2 抗志賀氏菌多克隆抗體制備

以滅活的志賀氏菌為免疫原，選擇新西蘭大白兔（雌性，兩月齡）進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)免疫。首免時(shí)，50 μL菌液與等體積的弗氏完全佐劑乳化后，按劑量100μL/只進(jìn)行注射；兩周后，同樣劑量加強(qiáng)免疫，佐劑換成為弗氏不完全佐劑，之后進(jìn)行第3次免疫。每次免疫后10 d，靜脈采血檢測(cè)血清的效價(jià)。待血清中抗體效價(jià)達(dá)到80 000左右后動(dòng)脈取血，采用以Protein A-Sepharose 4B作親合層析介質(zhì)純化抗血清并用Western Blot檢測(cè)抗體，最后測(cè)定其蛋白濃度后分裝保存于-20℃冰箱中作為捕獲抗體[13]。

1.3.3 酶標(biāo)抗體制備

稱取4 mg HRP溶于0.5 mL蒸餾水中，加入1 mL 0.06mol/LNaIO4新配溶液，4℃下磁力攪拌混勻30min。加入0.6 mL 0.16 mol/L乙二醇溶液，4℃下磁力攪拌再次混勻30 min。加入4 mg抗志賀氏菌多克隆抗體，混合均勻后裝入透析袋中，4℃下放入1 000 mL碳酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH9.6）中透析 12 h，中間換取緩沖液3次。將透析袋中液體取出，加入0.2 mL 5 mg/mL NaBH4溶液，4℃下緩慢混勻2 h。然后采用飽和硫酸銨沉淀法純化，沉淀物用1 mL PBS溶解，4℃下透析12 h，中間換取緩沖液3次。后加入等體積甘油，-20℃冰箱中保存作為檢測(cè)抗體[14-15]。

1.3.4 雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的建立

采用棋盤滴定法優(yōu)化捕捉抗體與檢測(cè)抗體稀釋度，將純化后的志賀氏菌多克隆抗體按照優(yōu)化稀釋度稀釋4℃包被過夜（100 μL/孔），磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate tween buffered solution，PBST） 洗滌 3 次，0.5%脫脂乳粉封閉液封閉（100 μL/孔），37℃封閉 1 h。棄去封閉液，PBST洗滌3次，加入梯度稀釋的志賀氏菌菌液，100 μL/孔，并設(shè)置空白對(duì)照和陰性對(duì)照，37℃孵育30 min，PBST洗滌4次。將酶標(biāo)抗體按優(yōu)化結(jié)果稀釋，100 μL/孔，37 ℃孵育 1 h，PBST 洗滌 4 次，加入TMB底物顯色液進(jìn)行顯色，100μL/孔，37℃孵育15min；加入終止液（2 mol/L H2SO4），50 μL/孔，終止顯色反應(yīng)；在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD450nm值[16]。

1.3.5 雙抗夾心ELISA檢測(cè)志賀氏菌的特異性

將大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌及副溶血弧菌稀釋成1×106cfu/mL，采用建立的雙抗夾心ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)立志賀氏菌為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)作陰性對(duì)照，重復(fù)試驗(yàn)3次，得出平均值，以檢驗(yàn)雙抗夾心ELISA體系的特異性。

1.3.6 人工接種扇貝的檢測(cè)

扇貝是經(jīng)檢測(cè)不含志賀氏菌的陰性樣品。扇貝樣品的制備：無菌條件下，將扇貝肉打成肉泥，稱取扇貝肉泥10 g，接入志賀氏菌不同濃度的菌懸液，按10、1、0.1 cfu/g樣品接種量接種，并以無菌生理鹽水作陰性對(duì)照。在上述各樣品中加入100 mL肉湯培養(yǎng)基，混勻，37℃，轉(zhuǎn)速180 r/min的恒溫?fù)u床上分別增菌培養(yǎng)5、10、20 h后取樣檢測(cè)OD值，同時(shí)用空白血清作陰性對(duì)照，大于陰性對(duì)照2.1倍（實(shí)驗(yàn)組OD值∶對(duì)照組OD值≥2.1）則為陽(yáng)性[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以M±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 志賀氏菌多克隆抗血清效價(jià)的測(cè)定

選擇4只新西蘭大白兔（雌性，兩月齡）分別編號(hào)為1、2、3、4。將制備好的免疫原同時(shí)免疫4只大白兔，每次免疫后10 d，靜脈采血后，采用間接ELISA對(duì)志賀氏菌免疫大白兔的抗血清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，其中3號(hào)大白兔的抗血清效價(jià)最好，3號(hào)大白兔的抗血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果見圖1。

圖1 3號(hào)大白兔的抗血清效價(jià)Fig.1 Antiserum titer of the third rabbit

由圖1可以看出，3號(hào)大白兔隨著免疫次數(shù)的增加，抗血清效價(jià)都有不同程度的增長(zhǎng)，尤其是在第4次免疫后，其抗血清效價(jià)提高到81 000左右，最終選擇3號(hào)大白兔的血清作為捕獲抗體。

2.2 抗體純化與檢測(cè)

抗體純化與Western Blot免疫檢測(cè)結(jié)果見圖2。

圖2 抗體純化與Western Blot免疫檢測(cè)Fig.2 Antibody purification and immunologic detection of Western Blot

由圖2A可知，圖中出現(xiàn)兩條清晰的條帶，一條大小為55 kDa，為重鏈帶。另一條大小為26 kDa，為輕鏈帶。且聚丙酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）中沒有明顯的雜帶，說明其純化效果好。取志賀氏菌菌體懸液進(jìn)行12%SDS-PAGE，轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜后用純化后的抗血清進(jìn)行Western Blot免疫檢測(cè)，結(jié)果如圖2B所示。從圖中可以看出，每個(gè)菌株都出現(xiàn)了多條條帶，說明制備的志賀氏菌多克隆抗體對(duì)菌體有較好的識(shí)別能力，同時(shí)說明志賀氏菌菌株中有多個(gè)蛋白可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

2.3 雙抗夾心體系

棋盤滴定優(yōu)化結(jié)果見表1。

表1 棋盤滴定法優(yōu)化OD結(jié)果Table 1 OD results of checkerboard titration

從表1可以看出，當(dāng)捕捉抗體和檢測(cè)抗體的濃度分別為3.125 g/mL和2.5 μg/mL時(shí)，測(cè)定的OD值為1.007，這個(gè)數(shù)值在所有OD值中最接近1。表明該體系志賀氏菌多克隆抗體作為捕獲抗體的最佳包被質(zhì)量濃度為3.125 g/mL，辣根過氧化物酶標(biāo)記志賀氏菌多克隆抗體作為檢測(cè)抗體的最佳稀釋質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL。

2.4 雙抗夾心體系標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

根據(jù)雙抗夾心體系優(yōu)化的結(jié)果，最終確定的工作條件：捕獲抗體的包被量為0.3125 g/孔，4℃下包被過夜，0.5%脫脂乳粉封閉液封閉，37℃封閉1 h，加入志賀氏菌菌液，從1×107cfu/mL開始用PBS緩沖液10倍梯度進(jìn)行稀釋，100 μL/孔室溫20℃下反應(yīng)1 h，加入酶標(biāo)抗體，37℃孵育1 h，37℃顯色15 min。最后用終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm下讀取吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。根據(jù)計(jì)算可得線性方程為y=6×10-7x+0.142，根據(jù)方程可計(jì)算檢測(cè)限（limit of detection，LOD）為4.12×104cfu/mL，檢測(cè)曲線的線性范圍為 4.12×104cfu/mL～3.4×106cfu/mL。

圖3 志賀氏菌雙抗夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve line of double antibody sandwich ELISA

2.5 雙抗夾心體系的特異性

在雙抗夾心ELISA體系中檢測(cè)大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌及副溶血弧菌，同時(shí)檢測(cè)陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照志賀氏菌，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，志賀氏菌陽(yáng)性對(duì)照正常顯色并檢出，而其它菌株均不顯色。說明建立的雙抗夾心ELISA體系與大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌及副溶血弧菌無交叉反應(yīng)性，具有良好的特異性。

圖4 檢測(cè)不同菌屬菌株的交叉反應(yīng)Fig.4 detection of the cross-reaction of different strains of bacteria

2.6 扇貝樣品人工接種志賀氏菌檢測(cè)

扇貝樣品人工接種志賀氏菌檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 雙抗夾心ELISA檢測(cè)扇貝中人工接種的志賀氏菌Table 2 Detection of Shigella in artificial inoculation of scallop by sandwich ELISA

由表2可以得出，當(dāng)樣品增菌培養(yǎng)5 h時(shí)，取樣經(jīng)雙抗夾心體系檢測(cè)獲得試驗(yàn)組和對(duì)照組OD值，根據(jù)ELISA檢測(cè)判斷標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)接種量為0.1、1 cfu/100 g時(shí)，試驗(yàn)組/對(duì)照組＜2.1，結(jié)果為陰性，當(dāng)接種量為10 cfu/100 g時(shí)，呈弱陽(yáng)性。增菌培養(yǎng)10 h取樣檢測(cè)時(shí)，接種量為0.1 cfu/100 g和1 cfu/100 g的扇貝樣品試驗(yàn)組/對(duì)照組＜2.1，結(jié)果為陰性，接種量為10 cfu/100 g的扇貝樣品試驗(yàn)組/對(duì)照組≥2.1，可檢測(cè)到志賀氏菌的存在。當(dāng)增菌培養(yǎng)20 h時(shí)取樣檢測(cè)，接種量為0.1 cfu/100 g、1 cfu/100 g和10 cfu/100 g的扇貝樣品試驗(yàn)組/對(duì)照組≥2.1，結(jié)果均為陽(yáng)性。因此建立的雙抗夾心ELISA檢測(cè)體系的檢測(cè)樣品，經(jīng)過10 h后增菌志賀氏菌檢出限（LOD）為105cfu/mg。

3 結(jié)論

以志賀氏菌多克隆抗體為捕獲抗體進(jìn)行包被，以HRP標(biāo)記抗志賀氏菌多克隆抗體作為檢測(cè)抗體，建立了志賀氏菌的雙抗夾心ELISA檢測(cè)體系，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好，R2=0.999 4，檢測(cè)限（LOD）為 4.12×104cfu/mL，檢測(cè)曲線的線性范圍為4.12×104cfu/mL～3.4×106cfu/mL。在扇貝樣品的添加試驗(yàn)中，建立的雙抗夾心ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，接種量105cfu/mg的樣品在培養(yǎng)10 h后可檢出陽(yáng)性結(jié)果，表明本方法具有良好的靈敏度與特異性。