聚能超聲-醇鹽雙水相耦合提取藜麥總黃酮

鄒維 ，崔恩浩，丁崗芯，石峰，高云濤，2，3*，熊華斌，李曉芬

（1.云南民族大學化學與環(huán)境學院，云南 昆明 650500；2.云南民族大學云南省跨境民族地區(qū)生物質(zhì)資源清潔利用國際聯(lián)合研究中心，云南 昆明 650500；3.云南民族大學生物基材料綠色制備技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 昆明 650500）

藜麥（ChenopodiumquinoaWilld.）是藜科藜屬植物，原產(chǎn)于南美洲，是印第安人的傳統(tǒng)主食，是一種營養(yǎng)全面的偽谷物。藜麥蛋白質(zhì)含量豐富，接近牛奶蛋白價值，具有適宜人類吸收利用的氨基酸組成和比例[1-2]。藜麥礦物質(zhì)營養(yǎng)含量高，油脂中富含人體所必需的ω-3和ω-6等多不飽和脂肪酸[3]。研究表明，藜麥中含有豐富的黃酮類成分[4]，黃酮類化合物具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、降血壓、降血脂和增強機體免疫力等諸多功能活性[5]。目前，藜麥黃酮提取工藝主要集中在溶劑提取[6-8]、超聲波輔助提取[9-11]和微波輔助提取[12]。

聚能超聲采用變幅器將超聲振動的振幅加大、速度加快，并將超聲能量集中在較小的面積，超聲空穴效應可使細胞組織破壁、加快液-固之間傳質(zhì)，縮短反應時間，在生物活性物質(zhì)提取中具有良好的應用前景[13-15]，但聚能超聲具有較強的細胞破碎作用，提取過程產(chǎn)生大量的細微組織顆粒物，釋放出大量蛋白質(zhì)、淀粉等成分，分散于提取溶液中，用于藜麥等富含蛋白質(zhì)、淀粉的樣品提取，極易導致提取溶液呈現(xiàn)糊化膠狀，難以進行后續(xù)的固液分離，亦對后續(xù)的分析測試尤其是光譜分析產(chǎn)生嚴重干擾，制約了聚能超聲在生物活性物質(zhì)提取中的應用。小分子醇-鹽雙水相分離體系與超聲輔助提取耦合技術對黃酮等生物活性成分具有良好的提取分離能力[16-17]，已經(jīng)在生物活性成分的提取中得到廣泛應用，是一種極具前途的分離技術，被廣泛應用在蛋白質(zhì)[18]、食品等[19-20]領域。

在前期研究中發(fā)現(xiàn)，正丙醇-氯化鈉雙水相體系可將聚能超聲輔助提取過程產(chǎn)生的細微組織顆粒物、蛋白的膠體、淀粉糊狀物分配于鹽水相，而黃酮等生物活性成分分配于富醇相，展現(xiàn)了良好的分離效率，據(jù)此，本文提出一種聚能超聲-小分子醇-鹽雙水相耦合的新方法，應用于藜麥黃酮類化合物的提取，并利用響應面分析對提取條件進行優(yōu)化，在獲得較傳統(tǒng)水浴超聲更高提取效率的同時，可有效解決聚能超聲輔助提取液后續(xù)固液分離及分析測試干擾問題，為聚能超聲在食品領域的應用提供試驗基礎，為生物活性成分的高效快速制備提供一種新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥：山西忻州五臺山；蘆丁標準品：北京索萊寶科技有限公司；DPPH：美國Sigma公司；無水乙醇、氫氧化鈉、抗壞血酸、氯化鈉（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；正丙醇（分析純）：西隴化工股份有限公司；亞硝酸鈉（分析純）：汕頭市達濠精細化學品有限公司；硝酸鋁（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；蒸餾水：云南民族大學化學與環(huán)境學院實驗室自制。

1.2 儀器與設備

SJIA-2012聚能式超聲波細胞粉碎機：寧波市鄞州雙嘉儀器有限公司；SG1200HE超聲清洗器：上海冠特超聲儀器有限公司；FA 2004電子分析天平：上海天平儀器廠；XZ-6G低速離心機：長沙湘智離心機儀器有限公司；TU-1950型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 聚能超聲雙水相

對市售藜麥粉過100目篩備用，稱取1.00 g均勻的藜麥粉樣品，放于100 mL燒杯中，加入一定量的正丙醇-氯化鈉和適量蒸餾水，置于低溫恒溫槽外置冷阱中，設定燒杯中樣品的初始溫度，將變幅桿超聲換能器與超聲波細胞粉碎機連接，工具頭置入燒杯樣品中，采用脈沖處理方式進行聚能超聲雙水相萃取，提取完成后，將整個提取體系靜置至完全分離，將富醇相與鹽水相分離，富醇相用于后續(xù)的總黃酮得率及DPPH自由基清除率測定。

1.3.2 單因素試驗考察

分別探究氯化鈉加入量、醇水體積比、超聲時間以及液固比這4種單因素對藜麥總黃酮得率的影響。

1.3.3 抗氧化活性測定

1.3.3.1 總黃酮得率測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法，以蘆丁為標準品，參考文獻[21-22]的方法測定總黃酮得率，在510 nm波長處測定吸光度，得線性回歸方程：y＝0.018 1x＋0.000 9（R2＝0.999 6）。計算藜麥總黃酮得率。

藜麥總黃酮得率按下式計算。

式中：Y為樣品總黃酮得率，%；c為蘆丁濃度，mg/mL；v為樣品提取液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為藜麥粉樣品質(zhì)量，g。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力的測定

參考文獻[23]的測定方法并作如下修改，準確配制吸光度為0.7±0.02的DPPH乙醇溶液。用移液槍準確移取DPPH乙醇溶液1 mL，分別加入體積分數(shù)為1%、2%、3%、4%、5%的樣品水溶液各1 mL，充分混勻，在室溫25℃下避光反應30 min，4℃、4 000 r/min條件下離心10 min，取上清液待測，于517 nm波長處測定吸光度（Ai），同時將1 mL DPPH乙醇溶液和1 mL無水乙醇混勻按上述方法測定吸光度（Ac），以及1mL無水乙醇溶液和1 mL樣品水溶液混勻按上述方法測定吸光度（Aj），根據(jù)下式計算DPPH自由基清除率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.5軟件進行相關曲線擬合；通過Excel 2010軟件分析整理數(shù)據(jù)；采用Design Expert8.0軟件設計響應面試驗方案，建立模型并進行多元回歸分析。每個試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 聚能超聲輔助提取及雙水相分離

聚能超聲裝置及雙水相分離體系見圖1。

圖1 聚能超聲裝置及雙水相分離體系Fig.1 Shaped energy ultrasonic device and two aqueous phase separation system

這種聚能超聲裝置能量集中，持續(xù)式的超聲作用方式可導致體系迅速升溫，因此，本文采用脈沖式超聲作用方式，并在裝置中的提取杯外增加了強制降溫冷阱，提取過程的初始溫度設置為-20℃，能有效對提取過程溫度進行控制。超聲功率為400 W，超聲時間25 min時，當通斷比≤1 ∶4（脈沖作用 1 s，休止4 s）時，總黃酮得率較低，當通斷比為1∶2（脈沖作用1 s，休止2 s）時，總黃酮得率達最高，且易于控制過程溫度，當通斷比大于2∶3時，終點溫度明顯較高，這與沈志燕等[24]的結果是一致的。因此，本文選擇通斷比為1∶2，即脈沖作用1 s，休止2 s的超聲作用方式。

使用圖1的聚能超聲裝置，400 W超聲功率，通斷比為1∶2，初始溫度設置為-20℃，將藜麥粉樣品經(jīng)聚能超聲-雙水相提取分離后的萃取液狀態(tài)和紫外吸收光譜見圖2。

經(jīng)聚能超聲輔助萃取后，藜麥粉樣品在萃取體系中形成低透光的膠體狀，即使長時間離心也很難將其中固體與液體分離，其吸收曲線具有很大的背景吸收物和雜峰。其原因可能是藜麥含有近10%的蛋白質(zhì)，在聚能超聲輔助萃取過程進入溶液形成分散膠體體系，加之部分藜麥粉體在超聲作用下破碎細小顆粒分散于溶液中，蛋白質(zhì)膠體物質(zhì)對光譜分析的入射光具有較強的散射作用，嚴重干擾總黃酮得率或抗氧化活性測定，這導致難以進行后續(xù)分離純化或色譜分析。針對上述問題，本文提出聚能超聲-雙水相萃取耦合的方式，選擇正丙醇-氯化鈉雙水相體系[25]。

圖2 聚能超聲萃取液及吸收光譜Fig.2 Shaped ultrasonic extraction and absorption spectrum

2.2 單因素試驗結果

氯化鈉加入量、醇水體積比、超聲時間和液固比4種因素對總黃酮得率的影響結果見圖3。

從圖3a可知，在1.0 g～1.5 g范圍內(nèi)，隨著氯化鈉加入量的增加，總黃酮得率逐漸上升，當氯化鈉加入量超過1.5 g，總黃酮得率逐漸降低，因此本文選擇氯化鈉的加入量為1.5 g。

醇水體積比即正丙醇和鹽水相初始體積之比，分相所需的氯化鈉不同，醇水體積比越大所需的氯化鈉就越少。由于鹽析作用，在正丙醇和水體系中加入一定量的氯化鈉后會出現(xiàn)兩相，即醇相和含鹽水相。由圖3b可知，隨著醇水體積比的增加，正丙醇相體積增加，藜麥總黃酮得率逐漸增加，在醇水體積比為1∶1時達到最大值，超過1∶1時，過多的醇相可能存在稀釋效應，導致藜麥總黃酮得率反而降低。

圖3c的結果顯示，超聲時間在5 min～25 min，隨著超聲時間增加，總黃酮得率逐漸增加，超聲時間大于25 min，總黃酮得率慢慢下降。這是因為隨著超聲時間增加，聚能超聲作用方式可導致體系升溫速率過快，終點溫度較高，對釋放的總黃酮存在一定破壞作用，因此本文選擇25 min作為適宜的超聲時間。

圖3 氯化鈉加入量、醇水比、超聲時間和液固比對總黃酮得率的影響Fig.3 Effects of sodium chloride addition，alcohol-water ratio，ultrasonic time and liquid-solid ratio on the total flavonoid yield

由圖3d看出，液固比由20∶1（mL/g）增加到25∶1（mL/g），總黃酮得率迅速提高，在液固比 25 ∶1（mL/g）時，總黃酮得率達到最大，此時提取出來的總黃酮全部溶于正丙醇中。當液固比大于25∶1（mL/g）時，總黃酮得率隨著液固比的增加而減少，這是由于隨著液固比的增加，上相的體積也逐漸增加，藜麥與正丙醇接觸面積也逐漸增大，但是藜麥粉的質(zhì)量有限，溶解能力有限，提取不充分，故總黃酮得率反而降低。因此選擇 25 ∶1（mL/g）作為適宜液固比。

2.3 響應面優(yōu)化

2.3.1 響應面優(yōu)化的試驗設計與結果

根據(jù)單因素試驗結果，本文固定超聲功率為400W，通斷比為1∶2，氯化鈉加入量為1.5 g，以總黃酮得率（Y）為響應值，選擇超聲時間（A）、液固比（B）和醇水體積比（C）3個因素進行響應面優(yōu)化，試驗設計的因素水平見表1。

采用Box-Behnken模型，運行Design-Expert8.0軟件，得到響應面試驗結果見表2。

對表2的結果進行多元回歸分析，獲得二次多項回歸方程：Y=-92.36A2-107.82B2-130.30C2+15.75AB+35.75AC+23.86BC-3.92A+1.47B+66.96C+427.58。

表1 因素水平Table 1 Factor levels

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface test

回歸方程的R2=0.996 7，表明方程擬合度較高，回歸方程可以較好描述響應值與3個因素之間真實關系。方差分析見表3。

從表3可知模型P＜0.000 1，失擬項P=0.126 1，模型具有高度顯著性，且失擬項不顯著，表明回歸方程擬合程度較好，可以用該回歸方程優(yōu)化預測提取工藝。單一的影響因素中，醇水體積比對總黃酮得率的影響具有高度顯著性，液固比和超聲時間的影響并不顯著。交互項的 P 值依次為：AC（＜0.000 1）＜BC（0.000 2）＜AB（0.002 2），表明3個影響因素之間的交互作用均具有顯著性，尤其是超聲時間（A）和醇水體積比（C）之間具有高度顯著關系。

2.3.2 總黃酮得率的響應面分析

圖4顯示了各因素交互作用對總黃酮得率影響變化的等高線圖和響應面圖。

表3 回歸模型方程的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

圖4 超聲時間、液固比、醇水體積比對總黃酮得率的等高線圖和響應面圖Fig.4 Contour plots and response surface plots of ultrasound time，liquid-solid ratio，alcohol-water ratio versus total flavonoid yield

從圖4可以看出，對于A和B，A因素方向等高線的密度和響應面曲率稍高于B因素方向，說明超聲時間較液固比有顯著影響。同樣，從圖4b、圖4c的等高線和響應面可以看出，醇水體積比（C）的影響顯著高于超聲時間（A）、液固比（B），AB、AC和 BC 3個響應面圖形均呈現(xiàn)較明顯的交互作用特征，這與表3的結果一致。

在本試驗條件下，醇水體積比不僅是對總黃酮得率影響最顯著的因素，而且還對影響不顯著的液固比和超聲時間產(chǎn)生了顯著的交互作用，表明在一定強度的超聲作用下，雙水相的組成是總黃酮提取最關鍵的工藝參數(shù)，醇水體積比在1∶1時，總黃酮更易溶出，當醇水體積比超過1∶1時，有更多的水分子進入正丙醇相中，導致提取率降低。液固比和超聲時間本身并不是顯著因素，但存在較顯著交互作用，可能的原因是超聲時間增加總黃酮不斷從藜麥固體傳質(zhì)至富醇的上相，而液固比可改變富醇的上相對總黃酮萃取容量，進而產(chǎn)生交互作用。

2.3.3 響應面優(yōu)化預測及驗證

基于獲得的多元回歸模型，應用Design-Expert8.0軟件Optimization下的Point Prediction模塊進行優(yōu)化預測，得到最優(yōu)預測條件：超聲時間25.8 min、液固比28.3 ∶1（mL/g）、醇水體積比 0.89 ∶1，在該最優(yōu)預測條件下總黃酮得率為0.375%。為方便操作，將各參數(shù)調(diào)整為：超聲時間 26 min，液固比 28 ∶1（mL/g），醇水體積比0.9∶1。驗證最優(yōu)預測條件下總黃酮含量，并與傳統(tǒng)清洗式超聲輔助提取（操作和條件與本法一致）對比。結果顯示，總黃酮得率實測值與預測值接近，為0.361%（n=3）。在相同條件下，與清洗式超聲輔助提?。傸S酮得率為0.301%）對比，總黃酮得率明顯增加。

2.4 藜麥粉的抗氧化活性

不同體積分數(shù)藜麥總黃酮提取物對DPPH自由基清除率結果如圖5所示。

圖5 藜麥總黃酮提取物對DPPH自由基的清除作用Fig.5 TheclearanceeffectoftotalflavonoidsfromquinoaonDPPH radical

由圖5可知，隨著藜麥總黃酮提取物體積分數(shù)的增加，DPPH自由基清除率也隨之增加，當樣品體積分數(shù)為5%時，DPPH自由基清除能力為59.46%，其半數(shù)抑制濃度（IC50）為4.012 7 mg/mL，略高于對照物VC（2.506 7 mg/mL）。表明本試驗獲得的藜麥總黃酮提取物對DPPH自由基清除能力與公認的強清除劑VC相似。

3 結論

本文采用桿式超聲變幅器裝置，浸入正丙醇-氯化鈉雙水相提取體系內(nèi)，建立了一種新型聚能超聲-雙水相集成提取方法，應用于藜麥總黃酮的提取，與已有采用清洗式超聲裝置的超聲-雙水相集成方法相比，本方法提取時間縮短，總黃酮得率明顯增加，提取物表現(xiàn)了良好的自由基清除能力。通過正丙醇-氯化鈉雙水相萃取體系有效將藜麥蛋白質(zhì)鹽析分離，消除了提取物中藜麥蛋白質(zhì)膠體形成對總黃酮得率和DPPH自由基清除率測定產(chǎn)生的光譜干擾，本文的研究為天然產(chǎn)物活性成分的高效提取分離提出了一種新的研究思路，具有較好的應用前景。