熟地黃對(duì)視網(wǎng)膜損傷小鼠的影響

李麗維，王玥，周王誼，王艷華，劉垚杰，徐詠全，王浩*，楊志國(guó)

（1.天士力研究院，天津 300410；2.天津天士力（遼寧）制藥有限責(zé)任公司，遼寧 阜新 123000；3.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

視疲勞又稱為“眼疲勞綜合征”或“眼疲勞”，為目前眼科常見(jiàn)的疾病之一，是一組表現(xiàn)為用眼后出現(xiàn)視覺(jué)障礙、眼部不適及全身癥狀以致不能正常進(jìn)行視覺(jué)作業(yè)的癥候群，是眼及全身器質(zhì)性因素與精神心理因素相互交織的綜合征[1]。根據(jù)臨床調(diào)查，屈光未得到正確矯正和調(diào)節(jié)過(guò)度及光源亮度不充分、環(huán)境亮度不均勻等是產(chǎn)生視疲勞的主要原因，且現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分析其產(chǎn)生的根本原因可能為眼部產(chǎn)生的自由基得不到有效清除所造成的損傷進(jìn)而導(dǎo)致視疲勞的發(fā)生[1-2]。晶狀體是眼球中重要的屈光間質(zhì)，對(duì)光線有屈光效果，具有過(guò)濾紫外線，保護(hù)視網(wǎng)膜的作用。晶體后面和玻璃體接觸，光線通過(guò)晶狀體后，通過(guò)玻璃體而到達(dá)視網(wǎng)膜，最終將捕獲的光信號(hào)傳至大腦。研究發(fā)現(xiàn)，晶狀體與視疲勞之間具有密切的關(guān)系[3]。晶狀體內(nèi)沒(méi)有血管，它所需的營(yíng)養(yǎng)來(lái)自房水，當(dāng)房水的代謝或晶狀體囊出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，原本透明的晶狀體會(huì)變得不透明，最終影響視力，引起視疲勞及其它眼科疾病。現(xiàn)在緩解視疲勞的方法很多，但效果都不是十分理想。陳艷麗、谷炎培等研究顯示過(guò)強(qiáng)的光照會(huì)引起視力的損傷，經(jīng)常伴隨色素紊亂[4]，并引起晶狀體渾濁及皮膚光老化現(xiàn)象。桑傳蘭等[5]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)強(qiáng)的光照會(huì)使肝臟功能受損，其機(jī)制可能是因?yàn)檫^(guò)強(qiáng)的光照促使體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧自由基，引起蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過(guò)氧化[6-7]，導(dǎo)致體內(nèi)肝細(xì)胞受損。

熟地黃為生地黃的炮制加工品。熟地黃味甘，微溫，歸肝、腎經(jīng)。具有補(bǔ)血滋明，益精填髓的功效，現(xiàn)代研究表明熟地黃具有抗氧化[8]、提高免疫力[9-10]，促進(jìn)造血[11]，抗疲勞[12]等功能。熟地黃水提物及熟地黃多糖均為目前研究的熱點(diǎn)，熟地黃水提液可提高谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性，提高機(jī)體抗氧化能力[13]，研究發(fā)現(xiàn)熟地黃多糖同樣具有抗氧化作用[14-15]，可顯著提高血超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）及GSH-Px活力水平，且劑量上呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系[16]。熟地黃常與枸杞、菊花等聯(lián)用于治療眼疾，如經(jīng)典名方杞菊地黃丸，現(xiàn)代研究也表明熟地黃與枸杞當(dāng)歸等復(fù)配湯劑具有緩解視疲勞[17]、抑制視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞損傷[18]、保護(hù)視網(wǎng)膜[19]等功效，而在眼科學(xué)研究方面以熟地黃單方為研究的相對(duì)較少。為了探究熟地黃對(duì)視疲勞的緩解作用，本研究以光損傷小鼠為模型，以熟地黃水提物及水提醇沉物為原料，通過(guò)檢測(cè)晶狀體與肝臟抗氧化指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)熟地黃對(duì)視疲勞的緩解作用。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器

基礎(chǔ)飼料、實(shí)驗(yàn)小鼠：斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、SOD、CAT、GSHPx、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid disodium，BCA）試劑盒：南京建成生物工程研究所；三氯乙醛（AR＞99%）：上海麥克林生化科技有限公司；復(fù)方托吡卡胺滴眼液：參天制藥（中國(guó)）有限公司；氧氟沙星眼膏：沈陽(yáng)興齊眼藥股份有限公司；LED燈：深圳市愛(ài)圖仕影像器材有限公司；U-3900型紫外分光光度計(jì)：日本HITACHI公司。

1.2 熟地黃提取物來(lái)源

制備方法：稱取熟地黃（符合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)），每次提取水量為熟地黃體積的6倍，提取3次，合并提取液，提取液濃縮得到水提物浸膏，將一部分水提物浸膏干燥制得熟地黃水提物，將另一部分水提物浸膏中加入適量乙醇，進(jìn)行醇沉，收集沉淀物，干燥醇沉沉淀物制得熟地黃水提醇沉提取物（每克熟地黃水提取物與熟地黃水提醇沉提取物分別相當(dāng)于熟地黃2.04 g與3.14 g）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

健康雄性 C57BL/6J小鼠，6 周齡，（18±1）g，許可證號(hào)為SCXK（京）2016—0002，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[（23±2）℃，相對(duì)濕度55%～75%]。小鼠置于聚丙烯塑料籠中，每籠3只，每組2籠。動(dòng)物房從早上7點(diǎn)至晚上7點(diǎn)給予正常光照，其余時(shí)間無(wú)光照，實(shí)驗(yàn)期間為動(dòng)物提供充足的食物和水。本研究的所有實(shí)驗(yàn)程序均按照天津科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。

1.4 光損傷模型制備及動(dòng)物分組

動(dòng)物適應(yīng)一周后，實(shí)驗(yàn)分組，設(shè)立5個(gè)實(shí)驗(yàn)分組，分別為正常對(duì)照組（NOR），光損傷模型組（MOD），熟地黃水提醇沉提取物低（S1L）和高（S1H）劑量組，熟地黃水提取物組（S2），每組6只，期間采用灌胃方式分別對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，NOR組和MOD組每天灌胃等量的溶媒，S1L組和S1H組給藥劑量分別為每天360 mg/kg和450 mg/kg，S2組的給藥劑量690 mg/kg（每天）。連續(xù)給藥8周。喂養(yǎng)8周后，除NOR組外，其余4組小鼠在第9周開(kāi)始，在（9 000±500）Lux光強(qiáng)下，每天照射4 h，連續(xù)照射 7 d，光照期間正常進(jìn)食與飲水，光誘導(dǎo)損傷結(jié)束后，對(duì)小鼠相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 體重及攝食量記錄

體重及攝食量自給藥開(kāi)始后進(jìn)行記錄，其體重每周稱量1次，共計(jì)8周，攝食量每天測(cè)量1次并記錄。

1.6 晶狀體中相關(guān)抗氧化能力的檢測(cè)

小鼠在脫頸處死后立即摘取眼球，在高倍顯微鏡下，將晶狀體從眼球中剝離出來(lái)，剝離過(guò)程在冰盤(pán)上進(jìn)行。加入勻漿介質(zhì)用勻漿器勻漿，4℃環(huán)境離心10 min（12 000 r/min），收取上清液，供待檢測(cè)指標(biāo)（GSH-Px、T-AOC）使用。各項(xiàng)步驟按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)上步驟進(jìn)行。

1.7 肝組織中相關(guān)抗氧化能力指標(biāo)檢測(cè)

將小鼠體內(nèi)取出的肝組織立即放入-80℃冰箱中保存，供檢測(cè)生化指標(biāo)（SOD、MDA、CAT、GSH-Px）使用。制備肝組織勻漿時(shí)，取出于低溫保存的肝組織，按1∶9（g/mL）加冰生理鹽水，在低溫環(huán)境下用研磨棒將EP管中的肝組織研磨成組織勻漿。4℃、3 000 r/min低溫高速離心機(jī)離心10 min，取上清液備用。各項(xiàng)指標(biāo)根據(jù)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以±s表示，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果分析

2.1 體重與攝食量

小鼠體重與攝食量見(jiàn)表1。

如表1所示，初始體重NOR、S1L、S1H和S2組與MOD組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。最終體重NOR、S1L、S1H、S2組較MOD組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。攝食量上看，NOR、S1L、S1H和S2組較MOD組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 體重與攝食量Table 1 Weight and food intake in each group

2.2 熟地黃提取物對(duì)晶狀體抗氧化結(jié)果分析

熟地黃提取物對(duì)晶狀體抗氧化結(jié)果分析見(jiàn)表2。

表2 各組晶狀體抗氧化指標(biāo)Table 2 Antioxidant index of lens in each group

如表 2所示，分析小鼠在（9 000±500）Lux的光強(qiáng)下，不同種類與劑量的熟地黃提取物對(duì)小鼠晶狀體抗氧化能力的影響。從GSH-Px和T-AOC兩個(gè)抗氧化指標(biāo)上看，藥物干預(yù)組抗氧化值高于模型組。與NOR組比較，給予光誘導(dǎo)損傷的小鼠其GSH-Px和T-AOC值均顯著降低（P＜0.05）。與MOD組比較，S1L組和S1H組和S2組小鼠的GSH-Px和T-AOC值均顯著升高，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2.3 熟地黃提取物對(duì)光損傷小鼠肝組織中MDA含量的影響

熟地黃提取物對(duì)光損傷小鼠肝組織MDA含量的影響，結(jié)果如圖1所示。

從圖1結(jié)果上看，NOR組和MOD組的MDA含量分別為（0.8±0.1）nmol/mg prot和（1.6±0.15）nmol/mg prot，而攝入低和高劑量的熟地黃水提醇沉提取物和熟地黃水提取物后，與模型組相比，MDA含量分別下降16.88%、13.75%和12.5%，其中，與MOD組相比較，S1L組、S1H組和S2組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

圖1 熟地黃提取物對(duì)光損傷小鼠肝組織MDA含量的影響Fig.1 Effects of the extract on MDA content in liver tissue of light-damaged mice

2.4 熟地黃提取物對(duì)小鼠肝組織中SOD活力的影響

熟地黃提取物對(duì)小鼠肝組織中SOD活力的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 受試物對(duì)光損傷小鼠肝組織SOD活力的影響Fig.2 Effects of the extract on SOD activity in liver tissue of lightdamaged mice

圖2結(jié)果顯示，過(guò)強(qiáng)的光照導(dǎo)致肝組織中SOD活力降低，NOR 組 SOD 酶活力為（68.27±8.32）U/mgprot，而MOD 組為（34.95±5.28）U/mg prot，有顯著性差異（P＜0.05），而S1L組、S1H組和S2組小鼠肝組織中的SOD活力較MOD組明顯上升，分別提高79.44%、35.25%和20.03%。其中，與MOD組比較，S1L組、S1H組和S2組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

2.5 熟地黃提取物對(duì)小鼠肝組織中CAT活力的影響

熟地黃提取物對(duì)光損傷小鼠肝組織CAT活力的影響，結(jié)果如圖3所示。

強(qiáng)的光照引起肝組織中CAT活力明顯降低，NOR組（73.65±10.95）U/mg prot，而 MOD 組為（30.51±4.25）U/mg prot。藥物干預(yù)組方面，與MOD組比較，S1L組、S1H組和S2組小鼠肝組織中的CAT活力明顯上升，分別提高38.81%、45.12%和16.66%。與MOD組相比，熟地黃提取物各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

圖3 熟地黃提取物對(duì)光損傷小鼠肝組織CAT活力的影響Fig.3 Effects of the extract on CAT activity of liver tissue in photoinjured mice

2.6 熟地黃提取物對(duì)肝組織中GSH-Px活力的影響

熟地黃提取物對(duì)肝組織中GSH-Px活力的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 熟地黃提取物對(duì)光損傷小鼠肝組織GSH-Px活力的影響Fig.4 Effects of the extract on GSH-Px activity in liver tissue of light-damaged mice

圖4實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，光損傷之后導(dǎo)致肝組織中GSH-Px活力明顯降低，NOR組為（1 719.12±92.2）U/mg prot，MOD 組為（1 420±76.94）U/mg prot。藥物干預(yù)組與MOD組比較，肝組織中的GSH-Px活力明顯上升，S1L、S1H與S2組分別提高69.51%、19.44%和53.94%，與MOD組比較，S1L、S1H與S2組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異差異（P＜0.05）。

3 結(jié)論與討論

熟地黃具有補(bǔ)血滋明，益精填髓的功效，有研究也發(fā)現(xiàn)以熟地黃為主要原料的杞菊地黃湯具有保護(hù)光感受細(xì)胞[20]、緩解視人體視疲勞[21]的作用，目前的研究發(fā)現(xiàn)熟地黃具有較強(qiáng)的抗氧化能力，這可能是其起到緩解視疲勞作用的機(jī)理之一，所以本課題通過(guò)研究2種熟地黃提取物對(duì)光損傷模型小鼠的晶狀體與肝抗氧化指標(biāo)，探討熟地黃在緩解視疲勞方面的作用。光損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，熟地黃水提物和水提醇沉物均能夠明顯減輕（9 000±500）Lux光強(qiáng)引起的氧化應(yīng)激損傷，對(duì)小鼠的視力具有一定的改善作用。通過(guò)對(duì)小鼠晶狀體中抗氧化能力的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，熟地黃水提取物與水提醇沉提取物均可以明顯提高GSH-Px和TAOC活力，且水提醇沉提取物在干預(yù)劑量的范圍內(nèi)隨著劑量的升高其對(duì)晶體抗氧化效果也在增強(qiáng)。通過(guò)測(cè)定肝臟的抗氧化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，2種熟地黃提取物均可以明顯降低肝臟MDA含量，升高SOD、CAT和GSH-Px活力。這說(shuō)明熟地黃提取物的抗氧化能力不僅體現(xiàn)在晶狀體中，還可能體現(xiàn)在其它組織中，說(shuō)明熟地黃提取物在體內(nèi)具有抗氧化能力。由于晶狀體的生理狀態(tài)與視疲勞有密不可分的關(guān)系，提示2種熟地黃提取物均具有緩解視疲勞的功效。