菊花對光氧化應(yīng)激的緩解作用

劉垚杰，劉瑩，李麗維，周王誼，徐閻，王玥，徐詠全，王浩*

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.天士力研究院，天津 300410）

菊花具有疏散風(fēng)熱、清熱解毒的功效，在諸多本草古籍中均有記載，是一種藥食同源性的植物。其主要活性因子包括總黃酮和揮發(fā)油類等物質(zhì)[1]。于慧[2]研究發(fā)現(xiàn)菊花具有抗氧化作用。除此以外，菊花水提液能明顯抑制D-半乳糖導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化，降低血中丙二醛含量，提高血中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活力[3]。水提法是中藥有效成分提取的常用方法，謝占芳[4]對該法提取菊花黃酮的成分分析發(fā)現(xiàn)，除黃酮類化合物外，粗提物中還包括一些水溶性淀粉、黏液質(zhì)等無效成分。

引起視疲勞發(fā)生的因素很多，氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)視疲勞發(fā)生的主要內(nèi)因之一。唐瓊[5]和王志玲等[6]研究發(fā)現(xiàn)，視疲勞作為一種眼部綜合癥，主要表現(xiàn)為眼癢干澀、畏光流淚等癥狀，而自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物是視疲勞發(fā)生的病理基礎(chǔ)。Sun Liyang等[7]、李濤等[8]和程昱[9]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物能有效地激活肝臟組織中抗氧化基因的表達，促進機體內(nèi)相關(guān)抗氧化物質(zhì)的釋放。Naresh等[10]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)光進入細胞后，立即被線粒體中的細胞色素c氧化酶吸收，導(dǎo)致呼吸鏈反應(yīng)增加，引發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。Song Delu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，10 000 Lux光強能夠明顯加劇眼球內(nèi)部的氧化應(yīng)激損傷，并且能夠引起視力功能上的損害。谷炎培等[12]和SONG D等[13]研究顯示長時間強光照射會引起晶狀體的損傷，伴隨色素紊亂，并引起晶狀體渾濁現(xiàn)象，其原因可能是眼球內(nèi)部的晶狀體囊受到過量活性氧自由基的攻擊，導(dǎo)致晶狀體代謝出現(xiàn)失衡。

肝臟是人體最重要的代謝和解毒器官。王幼生等[14]發(fā)現(xiàn)，肝組織的不正常代謝與視疲勞有緊密的聯(lián)系，氧化應(yīng)激引起的肝功損傷會導(dǎo)致維生素A的代謝失衡，從而降低眼對外界刺激的抵抗能力。桑傳蘭等[15]、KRIGEL A等[16]和TANITO M等[17]研究發(fā)現(xiàn)，過強光照誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生過量的活性自由基，進而導(dǎo)致肝細胞脂質(zhì)氧化，造成肝功受損。為探討菊花的抗氧化效果，本文采用菊花粗提物為原料，以C57BL/6J小鼠為實驗動物，經(jīng)強光照射后，檢測晶狀體與肝組織抗氧化指標(biāo)，探討其對氧化應(yīng)激相關(guān)的視疲勞的緩解作用。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid disodium，BCA）試劑盒：南京建成生物工程研究所；三氯乙醛（分析純，純度＞99%）：上海麥克林生化科技有限公司；復(fù)方托吡卡胺滴眼液：參天制藥（中國）有限公司；氧氟沙星眼膏：沈陽興齊眼藥股份有限公司。

1.2 菊花粗提物來源

通過水提法制備菊花粗提物[18]（每4.255 g菊花可制得菊花粗提物1 g），采用SN/T 4592—2016《出口食品中總黃酮的測定》中植物源性食品總黃酮的測定方法，測定提取物總黃酮含量為5.0%。

1.3 實驗動物

健康雄性 C57BL/6J小鼠，6 周齡，（18±1）g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司（許可證號為SCXK（京）2016-0002），飼養(yǎng)于天津科技大學(xué)實驗動物中心[（23±2）℃，相對濕度55%～75%]。小鼠被放置在白色塑料籠中，每籠4只，每組3籠。動物房于7∶00～19∶00給予正常光照，其余時間無光照。實驗期間為動物提供充足的食物和水。本研究的所有實驗程序均按照天津科技大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)的方案進行。

1.4 動物分組及光損傷模型制備

設(shè)立5個實驗分組，每組12只，期間采用灌胃方式給藥，其中正常對照組和光損傷模型組每天每只灌胃無菌生理鹽水0.2 mL；菊花粗提物低、中和高劑量組的給藥劑量分別為230、300、380 mg/kg bw，連續(xù)給藥8周。

給藥結(jié)束后進行強光造模。造模過程中無外界光源干擾。每只小鼠被單獨放置在由亞克力透明板制成的小方格中，每個格子的長、寬、高分別為10、10、8 cm，并在光照前對小鼠眼球進行涂抹眼藥處理，避免眼球表面由于長時間光照引起脫水。將光照器懸掛于小鼠頂端50 cm處，采用垂直照射方式照射，并在與小鼠同一高度處放置溫度計，保證溫度維持在（23±2）℃范圍內(nèi)，排除溫度升高引起小鼠眼球光熱損傷的可能。根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，照射光強為（9 000±500）Lux，照射時間為 14 ∶00～18 ∶00，連續(xù)照射 7 d，光照期間正常進食與飲水。

正常組、模型組和菊花粗提物低、中、高劑量組分別用NOR、MOD、JHL、JHM和 JHH表示。

1.5 體重及攝食量記錄

體重及攝食量自給藥開始后進行記錄，其體重每周稱量一次，共計8周，攝食量每天測量一次并記錄。

1.6 晶狀體中相關(guān)抗氧化能力的檢測

小鼠在脫頸處死后立即摘取眼球，于高倍顯微鏡下，將晶狀體從眼球中分離出來，分離過程在4℃環(huán)境中進行。將分離得到的晶狀體組織勻漿，4℃離心10 min（12 000 r/min），吸取上清液，供待檢測生化指標(biāo)（GSHPx、T-AOC）使用。測定參照試劑盒操作說明書進行。

1.7 肝組織中相關(guān)抗氧化能力指標(biāo)檢測

參考劉佳維等[19]的研究方法，通過小鼠處死后解剖得到肝臟組織，并立即放入-80℃冰箱中保存，供待檢測生化指標(biāo)（MDA、SOD、CAT、GSH-Px）使用。制備肝組織勻漿時，取出放置于低溫保存的肝組織，稱取0.1 g肝組織并與0.9 mL無菌生理鹽水混合，在冰浴中將肝組織勻漿。在4℃、3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液備用。各項指標(biāo)根據(jù)試劑盒說明檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果分析

2.1 菊花粗提物對光損傷小鼠體重與攝食量的影響

菊花粗提物對光損傷小鼠體重與攝食量的影響如表1所示。

表1 菊花粗提物對小鼠體重及攝食量的影響Table 1 Effect of crude extract of chrysanthemum on body weight and food intake of mice

從起始體重和最終體重結(jié)果上看，各組之間的起始體重和最終體重均不顯著（P＞0.05）。從日均攝入量結(jié)果上看，各組小鼠日均攝入量在4 g左右，且各組之間的日均攝食量均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 菊花粗提物對光損傷小鼠晶狀體抗氧化結(jié)果分析

菊花粗提物對光損傷小鼠晶狀體抗氧化結(jié)果見表2。

表2 各組晶狀體抗氧化指標(biāo)Table 2 Antioxidant index of lens in each group

如表2所示，與正常組比較，模型組小鼠晶狀體內(nèi)GSH-Px活力明顯下降，具有顯著差異（P＜0.05），說明強光照射能夠引起晶狀體抗氧化能力的降低。菊花粗提物各劑量組的晶狀體內(nèi)GSH-Px活力明顯高于模型組，并且菊花粗提物高劑量組的GSH-Px的活力要高于菊花粗提物低劑量組，呈劑量依賴性。與模型組比較，菊花粗提物低、中和高劑量組均差異顯著（P＜0.05）。

T-AOC測定發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組小鼠晶狀體內(nèi)總抗氧化能力明顯下降，具有顯著差異（P＜0.05）。菊花粗提物低、中和高劑量組的總抗氧化能力明顯高于模型組，具有顯著差異（P＜0.05）。低、中和高劑量的菊花粗提物均對光損傷小鼠晶狀體具有不同程度的保護作用，并且呈劑量依賴性。

2.3 菊花粗提物對光損傷小鼠肝組織中各抗氧化指標(biāo)的影響

菊花粗提物對光損傷小鼠肝組織中各抗氧化指標(biāo)的影響見表3。

表3 各組小鼠肝組織抗氧化指標(biāo)Table 3 Antioxidant index of liver in each group

2.3.1 菊花粗提物對光損傷小鼠肝組織中MDA含量的影響

強光照射會誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，其中包括醛基、羰基等。這些過量的活性氧自由基會破壞體內(nèi)原有的氧化應(yīng)激平衡體系，并且對生物體內(nèi)DNA的合成及轉(zhuǎn)錄造成影響，使體內(nèi)出現(xiàn)一系列應(yīng)激反應(yīng)[20-21]。表3結(jié)果表明，長時間過強的光照會引起小鼠肝組織中MDA含量顯著增加，而攝入菊花粗提物后，與模型組相比，其MDA含量分別下降16.9%、21.9%和24.4%，并具有顯著差異（P＜0.05）。

2.3.2 菊花粗提物對光損傷小鼠肝組織中SOD活力的影響

超氧化物歧化酶在生物體內(nèi)廣泛存在，具有良好的清除自由基的能力，其在體內(nèi)的水平高低與體內(nèi)氧化應(yīng)激水平直接相關(guān)[22]。表3結(jié)果顯示，長時間過強的光照會導(dǎo)致肝組織中SOD活力明顯降低。與模型組比較，菊花粗提物低、中和高劑量組小鼠肝組織中的SOD活力明顯上升，分別提高27.9%、35.5%和42.2%。其中，與模型組比較，均差異顯著（P＜0.05）。

2.3.3 菊花粗提物對光損傷小鼠肝組織中CAT活力的影響

過氧化氫酶的主要作用是催化H2O2分解為H2O與O2，能夠減緩氧化應(yīng)激引起的損傷[23]。表3結(jié)果顯示，與正常組相比，光照會引起肝組織中CAT活力明顯降低（P＜0.05）。給予菊花粗提物連續(xù)干預(yù)8周后，小鼠肝組織中的CAT活力明顯上升，分別提高12.2%、17.3%和32.10%。與模型組相比，菊花粗提物各劑量組均差異顯著（P＜0.05）。

2.3.4 菊花粗提物對光損傷小鼠肝組織中GSH-Px活力的影響

谷胱甘肽過氧化物酶是機體中一種重要的過氧化物分解酶[24]。表3結(jié)果顯示，光損傷之后導(dǎo)致肝組織中GSH-Px活力明顯降低。給予菊花粗提物連續(xù)干預(yù)8周后，肝組織中的GSH-Px活力明顯上升，分別提高9.2%、12.0%和13.5%。與模型組相比，菊花粗提物各劑量組均具有顯著性差異（P＜0.05）。

3 結(jié)論

研究結(jié)果顯示，（9 000±500）Lux光強可以明顯加劇晶狀體和肝組織氧化應(yīng)激過程，引起小鼠晶狀體和肝組織抗氧化能力的下降。光損傷動物實驗評價發(fā)現(xiàn)，230、300、380 mg/kg bw劑量的菊花粗提物均能夠增強小鼠的抗氧化能力。晶狀體氧化結(jié)果顯示，菊花粗提物干預(yù)組的GSH-Px活力與T-AOC值明顯高于模型組，呈劑量依賴性。肝臟抗氧化結(jié)果顯示，與模型組相比，低、中和高劑量的菊花粗提物明顯降低了肝組織中MDA含量，升高了SOD、CAT和GSH-Px 3種抗氧化酶的活力，說明3種劑量的菊花粗提物對肝組織的抗氧化能力均有增強作用。視疲勞是一種眼部綜合癥，晶狀體和肝組織的異常代謝是導(dǎo)致其發(fā)生的重要內(nèi)因，本研究結(jié)果提示，菊花粗提物對氧化應(yīng)激相關(guān)的損傷具有緩解功能，將為菊花視疲勞類視力保護產(chǎn)品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。