比色法測定遠(yuǎn)志成分含量研究*

田 盛，吳雨晴，李佳興，唐 弘，王海波

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連116600）

遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志（Polygala tenuifolia Willd.）或卵葉遠(yuǎn)志（P. sibirica L.）的干燥根，性溫，味苦、辛，歸心、腎、肺經(jīng)，具有安神益智、交通心腎、祛痰消腫的功效[1]。遠(yuǎn)志含有皂苷類、多糖、生物堿、酮等多種類型化合物成分，有增強學(xué)習(xí)記憶、抗癡呆、抗衰老、抗氧化、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗抑郁、祛痰鎮(zhèn)咳、抑菌抗炎、抗誘變、保護(hù)心腦血管等多種藥理活性，在治療阿爾茨海默病、抑郁癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面具有顯著的開發(fā)價值[2-7]。本文采用紫外分光光度法對遠(yuǎn)志的皂苷、多糖、生物堿及酮類成分含量進(jìn)行測定[8]，為遠(yuǎn)志藥材質(zhì)量全面評價提供研究支持，更好地保證遠(yuǎn)志藥材臨床效果。

1 實驗材料

1.1 儀器

TD2002C 型電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司）；KQ5200DB 型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；AS3120A 型超聲波清洗器（奧特賽恩斯儀器有限公司）；JP-1000B-8 型高速多功能粉碎機（永康市久品工貿(mào)有限公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；GZX-9070 MBE 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；紫外分光光度計（日本日立科技有限公司）；石英比色皿（宜興市偉鑫儀器有限公司）；移液器（20～200μL，100～1000μL，大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司）。

1.2 試劑與試藥

乙醇（AR 天津富宇試劑廠）；甲醇（AR 天津市進(jìn)豐化工有限公司）；NaOH（AR 遼寧新興試劑有限公司）；葡萄糖（批號20161026 天津市大茂化學(xué)試劑廠）；Al（NO3）3（AR 北京化工廠）；HClO4（批號20180915 天津政成化學(xué)制品有限公司）；HAc（批號20181016 天津市大茂化學(xué)試劑廠）；香草醛（批號20181024 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；苯酚（批號1820089 上海阿拉丁試劑有限公司）；溴麝香草酚藍(lán)（批號20180322 天津市大茂化學(xué)試劑廠）；濃H2SO4（批號20180907 天津市大茂化學(xué)試劑廠）；純凈水（批號20181206 大連遼東半島飲品有限公司）；鹽酸小檗堿（批號20171122 成都曼思特生物制藥有限公司）；遠(yuǎn)志酮ⅢA 對照品（批號20150605 成都曼思特生物制藥有限公司）；遠(yuǎn)志皂苷元對照品（批號20150122 成都曼思特生物科技有限公司）；遠(yuǎn)志藥材來源見表1，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定，為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志P. tenuifolia Willd.的干燥根。

表1 遠(yuǎn)志藥材來源信息表Tab.1 Source information of polygala medicinal materials

2 方法與結(jié)果

2.1 總皂苷含量測定

（1）對照品溶液制備 取遠(yuǎn)志皂苷元對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL 含1mg 的溶液，即得。

（2）供試品溶液制備 將不同批次遠(yuǎn)志分別粉碎后過40 目篩，取遠(yuǎn)志粉末1g，加入75%乙醇溶液25mL，超聲提取50min，濾過，取續(xù)濾液備用。

（3）溶液測定 取對照品溶液或供試品溶液適量，置于具塞磨口試管中，精密加入0.2mL 5%香草醛-HAc（現(xiàn)用現(xiàn)配制）、0.8mL HClO4，震蕩搖勻，60℃加熱 15min 后，冰水中冷卻，加入 5mL HAc，搖勻，靜置15min 后，580nm 處測定吸光度。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取對照品溶液60、65、70、75、80、85、90μL，按 2.1（3）項下方法分別測定。以遠(yuǎn)志皂苷元的質(zhì)量X（μg）為橫坐標(biāo)，以吸光度A 為縱坐標(biāo)，得出回歸方程為y=0.0174x-0.7124，r=0.9990，在60～90μg 范圍內(nèi)于吸光度線性關(guān)系良好。

（5）測定結(jié)果 將（2）項下供試品溶液按（3）項下方法分別測定吸光度，計算總皂苷含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品中各組分含量表（mg·g-1）Tab.2 Contents of each component in the sample

2.2 總多糖含量測定

（1）對照品溶液制備 精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖對照品,加H2O 溶解成0.25mg·mL-1的對照品溶液備用。

（2）供試品溶液制備 分別取不同批次遠(yuǎn)志粉末30g 加蒸餾水至500mL。加熱回流3h，過濾，溶液定容至250mL，精密吸取1mL，加蒸餾水稀釋至25mL，備用。

（3）溶液測定 取對照品溶液或供試品溶液適量，置于具塞磨口試管中，加純凈水稀釋至1.0mL，精密加入1mL 5%苯酚試液，迅速加入5mL 濃H2SO4，混勻，靜置5min，于40℃水浴上加熱15min，取出，室溫靜置20min，于490nm 處測定吸光度。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 分別置于 6 支具塞磨口試管中，按照2.2（3）項下方法分別測定吸光度。以多糖的質(zhì)量X（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度A 值為縱坐標(biāo)，得出回歸方程 y=8.969x+0.1462，r=0.9990，在 50～250μg 范圍內(nèi)于吸光度線性關(guān)系良好。

（5）測定結(jié)果 將（2）項下供試品溶液按（3）項下方法分別測定，通過計算得出遠(yuǎn)志中多糖含量，其測定結(jié)果如表2。

2.3 總生物堿含量測定

（1）對照品溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇配制成每1mL 含0.5mg 的對照品溶液，備用。

（2）供試品溶液制備 分別將不同批次遠(yuǎn)志藥材粉碎，過20 目篩，精密稱取10g，加入10% HCl 溶液100mL，加熱回流2h，過濾，精密吸取濾液20mL，加堿液調(diào)pH 值為12，加入氯仿20mL，萃取3 次，合并氯仿液，回收氯仿，殘渣加甲醇溶解，備用。

（3）溶液測定 取對照品溶液或供試品溶液適量，加甲醇稀釋至1.0mL。加入溴麝香草酚藍(lán)溶液5mL，加入氯仿10mL，萃取3 次，合并氯仿液，加入0.4g 無水Na2SO4除去水分后，于412nm 處測定吸光度。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，在分別加入 0.8、0.6、0.4、0.2、0mL 甲醇至溶液至 1mL 溶液，按照 2.3（3）項下方法測定吸光度。以生物堿的質(zhì)量X（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)，得出回歸方程，y=0.348x+0.0938，r=0.9992，在 100～400μg 范圍內(nèi)于吸光度線性良好。

（5）測定結(jié)果 將（2）項下供試品溶液按（3）項下方法分別測定，計算遠(yuǎn)志中總生物堿含量，結(jié)果見表2。

（2）供試品溶液制備 將不同批次遠(yuǎn)志藥材樣品分別經(jīng)粉碎機粉碎后過20 目篩，得到遠(yuǎn)志粉末，各取1.00g 置于100mL 具塞錐形瓶中，加入75%甲醇溶液25mL，超聲提取50min，濾過，取續(xù)濾液備用。

（3）溶液測定 取對照品溶液或者供試品溶液適量，置于5mL 容量瓶中，加入75%甲醇溶液稀釋至2.0mL，再加入10% A（lNO3）3溶液0.5mL，混勻后置于40℃恒溫水浴鍋中顯色10min，再加入75%甲醇稀釋至刻度線。混勻后，400nm 波長下測定。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取對照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mL，按 2.4（3）項下方法分別測定吸光度。以酮濃度 X（mg·g-1）為橫坐標(biāo)，吸光度 A為縱坐標(biāo)，得出方程 y=20.331x+0.0183，r=0.9993，在25～400μg 范圍內(nèi)于吸光度線性關(guān)系良好。

（5）測定結(jié)果 將（2）項下供試品溶液按照（3）項下方法分別測吸光度，計算遠(yuǎn)志總酮含量，結(jié)果見表2。

3 結(jié)論

（1）遠(yuǎn)志總皂苷顯色后，隨著時間的推移，顏色會有不同程度的變化。穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，0min 時吸光度最大，15min 以后基本穩(wěn)定，數(shù)值波動不大，所以顯色后靜置15min 后，進(jìn)行測定。在制備樣品時，比較60%和75%甲醇的超聲提取效率，75%甲醇提取效率高，確定選用其作為提取溶劑。

（2）目前，關(guān)于遠(yuǎn)志藥材多個活性成分含量測定的研究較多，有助于提升對遠(yuǎn)志藥材指標(biāo)性成分含量控制的質(zhì)量評價水平[9,10]，本實驗對不同產(chǎn)地來源的遠(yuǎn)志藥材多種成分的含量進(jìn)行測定，有助于評價遠(yuǎn)志藥材中多種組分質(zhì)量的情況，對產(chǎn)地、生長環(huán)境、藥材選取部位等可能影響藥材質(zhì)量的因素進(jìn)行便捷分析。

（3）本實驗所測定多種組分含量，為遠(yuǎn)志的質(zhì)量評價研究提供了數(shù)據(jù)參考，利于進(jìn)一步完善遠(yuǎn)志質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)。