正交試驗(yàn)法優(yōu)選復(fù)方舒心康的提取工藝研究*

于 瑩，張虎娟，梁 浩，張曉燕，周忠光

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)a.中醫(yī)藥研究院；b.研究生院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036）

缺血性心臟病是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病之一，近年來(lái)患病率和死亡率不斷上升，尤其是在老年人中呈逐年上升的趨勢(shì)[1]。本研究中的復(fù)方舒心康包括丹參、廣棗、檀香、訶子、木棉花等中藥，被蒙醫(yī)用于治療缺血性心臟病，在多年的使用中效果良好，未見(jiàn)不良反應(yīng)。丹參為方中君藥，丹參酮ⅡA 是中藥丹參中的脂溶性成分，現(xiàn)代研究表明，丹參酮ⅡA 具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[2]。在2020 版《中國(guó)藥典》中以HPLC 法檢測(cè)丹參酮ⅡA 的含量為中藥材丹參的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參考,因此，本實(shí)驗(yàn)以丹參酮ⅡA的含量為復(fù)方舒心康的質(zhì)量控制提供參考。用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，對(duì)舒心康的最佳水提提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和材料

Dinex Ultiate 3000 型高效液相色譜儀（美國(guó)戴安儀器有限公司）；GZX-9070MBE 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SB-5200DT型超聲波清洗機(jī)（寧波新藝超聲波設(shè)備有限公司）；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；XMTD-204 型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；CPA225D 型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

丹參藥材（批號(hào)1601002 河北全泰藥業(yè)有限公司）；丹參酮ⅡA 對(duì)照品（批號(hào)110766-201721 中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇（AR 南京化學(xué)試劑廠）；乙腈（色譜醇DikmaPure）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 丹參酮ⅡA 的含量測(cè)定

1.2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)[3]采用Diamonsil C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；以乙腈（A）-磷酸水（B）為流動(dòng)相，按表1 的液相條件進(jìn)行洗脫；柱溫為20℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm；理論板數(shù)按丹參酮ⅡA 峰計(jì)算應(yīng)不低于60000。

表1 流動(dòng)相設(shè)置條件Tab.1 Setting conditions of mobile phase

1.2.1.2 對(duì)照品溶液的制備[4]精密稱(chēng)取丹參酮ⅡA 標(biāo)準(zhǔn)品5.0012mg，用甲醇于5mL 容量瓶中定容，搖勻。精密量取上述對(duì)照品溶液1mL，置于50mL 容量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得丹參酮ⅡA 對(duì)照品溶液，濃度為20.0048μg·mL-1。

1.2.1.3 供試品溶液的制備 取水提醇沉濃縮液，用水定容于100mL 容量瓶，搖勻，即得。

1.2.1.4 陰性對(duì)照溶液的制備 稱(chēng)取缺少丹參的全方藥材，按水提醇沉工藝制備不含丹參的樣品一份，用水定容于100mL 容量瓶，搖勻，即得。

1.2.1.5 專(zhuān)屬性試驗(yàn)[5]將上文中所述的對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液和供試品溶液用微孔濾膜濾過(guò)（0.45μm），高效液相色譜儀中分別進(jìn)樣10μL。

1.2.1.6 測(cè)定方法 將1.2.1.2 中對(duì)照品溶液及1.2.1.3中供試品溶液在高效液相色譜儀中分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將對(duì)照品溶液用甲醇分別按照2、4、6、8、10 倍稀釋?zhuān)芪?0μL 注入高效液相色譜儀，按“1.2.1.1”項(xiàng) 下色譜條件測(cè)定。分別以丹參酮ⅡA 的含量和色譜峰面積為橫、縱坐標(biāo)，應(yīng)用Excel 軟件處理數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為:Y=69.66X+0.2946，（R2=0.9998）。

從圖1 可以觀察到，在相同的液相條件下，在與丹參酮ⅡA 對(duì)照品色譜圖相同的保留時(shí)間處，供試品的色譜圖上也存在色譜峰，該峰與其它組分能達(dá)到分離;陰性對(duì)照溶液色譜圖在相對(duì)應(yīng)的位置上無(wú)干擾峰，表明在該液相色譜條件下檢測(cè)丹參酮ⅡA具有專(zhuān)屬性。

圖1 丹參酮ⅡA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of tanshinone ⅡA

2.2 精密度試驗(yàn)

取“1.2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 針，每次進(jìn)樣量10μL，記錄對(duì)照品溶液在檢測(cè)波長(zhǎng)270nm的峰面積，結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA 的峰面積RSD 為1.86%，表明該實(shí)驗(yàn)儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“1.2.1.2”項(xiàng)下方法制備舒心康提取液，分別于2、4、6、8、10h 進(jìn)樣10μL，按“1.2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定放置不同時(shí)間后樣品中丹參酮ⅡA 含量變化，計(jì)算得RSD 為1.13%，表明樣品中丹參酮ⅡA放置10h 以?xún)?nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以舒心通提取液中丹參酮ⅡA 的含量和干浸膏得率為工藝考察標(biāo)準(zhǔn)，按4 因素3 水平進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇醇沉濃度（A）、提取次數(shù)（B）、加水量（C）和提取時(shí)間（D）4 個(gè)因素進(jìn)行考察，見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)提取因素水平表Tab.2 Table of factors and levels of orthogonal test

2.4.1 提取方法 按處方稱(chēng)取9 份全方藥材，每份55 g，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)L9（34），選取4 個(gè)因素水平（見(jiàn)表2），按照正交試驗(yàn)方案，水煎煮過(guò)濾，向?yàn)V液中加入75%～85%乙醇溶液，靜置析出沉淀后，過(guò)濾，將濾液濃縮，用水定容至100mL，制得相應(yīng)的9 個(gè)樣品溶液。

2.4.2 收膏率的測(cè)定 將上述制得的9 個(gè)樣品溶液精密量取50mL，分別置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，在80℃下減壓干燥至恒重，精密稱(chēng)定藥膏的質(zhì)量，計(jì)算收膏率。

2.4.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)及結(jié)果分析[6-9]正交試驗(yàn)結(jié)果采用直觀分析和方差分析相結(jié)合，結(jié)果見(jiàn)表3、4。

表4 綜合評(píng)分方差分析結(jié)果Tab.4 Table of factors and levels of orthogonal test

根據(jù)直觀分析和方差分析結(jié)果，綜合評(píng)分的極差大小顯示各因素作用主次為B＞D＞C＞A，即提取次數(shù)對(duì)丹參酮IIA 含量影響最大，其次為提取時(shí)間、加水量、醇沉濃度，最優(yōu)水提醇沉工藝組合為A3B3C3D2。即用12 倍的水，熱回流提取3 次，每次1.5h，用85%乙醇沉淀后，取濾液。

2.4.4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 按處方分別稱(chēng)取全方藥材3 份，每份55g，按本實(shí)驗(yàn)得出的最佳的工藝方案進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)定樣品中丹參酮ⅡA 的含量和干浸膏得率。結(jié)果說(shuō)明，優(yōu)選的工藝中丹參酮ⅡA 的含量和干浸膏得率的綜合評(píng)分最高，RSD 為2.21%。結(jié)果表明，該優(yōu)選工藝穩(wěn)定可行。

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，舒心康提取的最佳工藝為:用12 倍的水，熱回流提取3 次，每次1.5h，用85%乙醇沉淀后，取濾液。

3 結(jié)論

（1）舒心康中君藥為丹參和廣棗，丹參酮ⅡA 在《中國(guó)藥典》中作為檢測(cè)丹參藥材質(zhì)量的指標(biāo)，該成分的提取制備工藝較簡(jiǎn)易，檢測(cè)方法也具體清晰。廣棗中主要成分有沒(méi)食子酸[10]，但該方中另外一味藥材訶子中也含有沒(méi)食子酸[11]。因此，選用丹參酮ⅡA 和干浸膏得率作為優(yōu)選舒心康提取工藝的檢測(cè)指標(biāo)。

（2）本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)，對(duì)藥物的提取次數(shù)、提取時(shí)間、加水量、醇沉濃度4 個(gè)因素進(jìn)行考察，以干膏得率和丹參酮ⅡA 作為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，篩選出舒心康的最佳提取工藝，為該藥在實(shí)際生產(chǎn)中節(jié)約時(shí)間及提高藥物療效奠定了一定的基礎(chǔ)。