黃芪多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定研究進(jìn)展*

張明宇，馬 悅，王知斌

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黑龍江省中藥天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

藥用黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為豆科植物蒙 古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.Mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜莢黃芪A.membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根。于春、秋二季采挖，除去須根和根頭，曬干而得。有排膿止汗、補(bǔ)氣升陽(yáng)，益衛(wèi)固表，托毒生肌，利水退腫之功效。黃芪是一年生或多年生草本、亞灌木或灌木，豆科最大的開(kāi)花植物屬之一，廣泛分布于溫帶和干旱地區(qū)[1]。黃芪是中國(guó)傳統(tǒng)中藥，藥用歷史已經(jīng)有2000 多年。本文主要對(duì)黃芪多糖Astragalus Polysacharin（APS）類(lèi)化合物的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定兩個(gè)方面的內(nèi)容進(jìn)行了綜合歸納，對(duì)APS 化合物的性質(zhì)進(jìn)行更充分的了解，為其臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 黃芪多糖的分離純化

1.1 黃芪多糖的提取

APS 提取的常用溶劑包括水、甲醇、乙醇等。方法主要為溶劑提取法，包括水提取法（水煎煮法、堿水提取法）；醇提取法（醇水提取法、堿醇提取法）。其他方法包括微波提取法、超聲波提取法、超高壓提取法、超細(xì)粉碎提取法、纖維素酶法。各提取方法操作見(jiàn)表1。

表1 APS 的提取方法Tab.1 Extract method of APS

1.2 分離純化

經(jīng)過(guò)初步的提取得到的是含有雜質(zhì)的粗APS提取液，欲得到純凈的APS，需要去除蛋白質(zhì)、色素等多余雜質(zhì)。

1.2.1 除蛋白質(zhì)方法 去除蛋白質(zhì)的方法主要包括Sevage 法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、鞣酸法和蛋白酶水解法等。前3 種方法的原理是加入有機(jī)溶劑使樣品中的蛋白質(zhì)變性成沉淀離心分離；鞣酸可與蛋白質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)使其凝固沉淀；蛋白酶法除蛋白的原理是其使樣品中蛋白質(zhì)降解，再用透析或沉淀的方法除去蛋白質(zhì)[2]。其中Sevage 法較為常用，條件為Sevage 試劑中氯仿∶正丁醇＝4∶1，粗多糖溶液（2g·L-1）與Sevage 試劑的體積比為2∶1，攪拌時(shí)間為25min 時(shí)，Sevage 法去除蛋白質(zhì)反應(yīng)較為溫和[3]，采用3～4 次處理可達(dá)到較為理想的處理結(jié)果。若采用Sevage 法處理多糖蛋白6 次，蛋白質(zhì)含量下降70.8%，多糖損失率為4.4%[4]。即蛋白質(zhì)含量雖下降，但多糖損失率也隨之升高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，將酶解法和Sevage 法聯(lián)用除蛋白效果較好。研究對(duì)比Savage 法、絮凝劑法、三氯乙酸法、蛋白酶－Savage 法4 種方法的蛋白質(zhì)去除率及多糖損失率，結(jié)果表明，蛋白酶－Savage 法兩項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于其它方法[5]。

1.2.2 除色素方法 經(jīng)初步提取的粗多糖常常含有色素，需要進(jìn)行脫色處理，色素分為脂溶性和水溶性。常用的脫色方法有氧化法、吸附法、離子交換法和金屬絡(luò)合物法等[14]。DEAE-纖維素柱吸附法是目前最常用的脫色素方法，利用0.1mol·L-1的NaCl 溶液洗脫，DEAE-纖維素柱純化可以得到APS 的主要級(jí)分[15]；采用D101 大孔吸附樹(shù)脂純化100mL 濃度為1.8mg·mL-1的黃芪粗多糖溶液時(shí)，采用4 BV 的50%乙醇為洗脫劑，以1mL·min-1的流速進(jìn)行洗脫為最佳條件，可獲得純度為65.1%的APS[16]；采用AB-8 大孔吸附樹(shù)脂純化不同濃度乙醇洗脫樣品，得到的APS 最高純度可達(dá)96.1%[17]；通過(guò)比較S-8、AB-8、X-5、NKA-9、D4020 和D3520 6 種樹(shù)脂吸附APS 的吸附量及解吸率，結(jié)果表明，X-5 樹(shù)脂固定床進(jìn)行分離富集后，APS 的回收率較高，并且純度得到了提高[18]。以可見(jiàn)光區(qū)光譜曲線下面積為測(cè)定指標(biāo)對(duì)比粉末活性炭脫色、顆?；钚蕴棵撋EAE-52脫色、過(guò)氧化氫脫色4 種除去APS 色素的方法，發(fā)現(xiàn)DEAE-52 脫色素在不損失較多多糖的同時(shí)，有著相對(duì)較高的色素脫除率[19]。

2 黃芪多糖的結(jié)構(gòu)鑒定

黃芪多糖結(jié)構(gòu)測(cè)定方法可分為化學(xué)分析法和儀器分析法。

傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法 主要包括多糖分子量的測(cè)定、單糖組成分析、糖醛酸還原、完全酸水解、部分酸水解、甲基化分析、高碘酸氧化和Smith 降解法；

儀器分析法 主要包括旋光度測(cè)定法、紫外光譜（UV）、傅里葉紅外光譜（FTIR）、核磁共振（NMR）、氣相色譜（GC）和質(zhì)譜（MS）等。

（1）鑒定中藥各種化學(xué)成分的分子結(jié)構(gòu) 旋光度法只能鑒定有旋光性的化合物，可根據(jù)產(chǎn)生的旋光性的不同區(qū)分化合物是否存在雜質(zhì)。紫外光譜（UV）是由于電子的躍遷落于紫外可見(jiàn)光區(qū)而產(chǎn)生的，因此，可根據(jù)不同類(lèi)型的化合物的紫外吸收強(qiáng)度判斷化合物類(lèi)型，當(dāng)光子不足以使電子躍遷而落于不可見(jiàn)的紅外光區(qū)時(shí)，就可能引發(fā)原子和基團(tuán)共價(jià)鍵合的振動(dòng)能級(jí)躍遷，使共價(jià)鍵發(fā)生不同類(lèi)型的振動(dòng)。因此，通過(guò)傅里葉紅外光譜（FTIR）可觀察化合物的結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵的信息。核磁共振（NMR）對(duì)于中藥化學(xué)成分結(jié)構(gòu)的鑒定往往查看其對(duì)應(yīng)的一維譜圖和二維譜圖，兩者相互結(jié)合分析得出結(jié)構(gòu)信息，熟練掌握后甚至可以從數(shù)據(jù)中直接推斷原子的連通性和空間排列[20]。

（2）中藥組分分離與定量分析或定性鑒定 采用氣相色譜（GC）與質(zhì)譜（MS）聯(lián)用于進(jìn)行分析與鑒定。樣品制備步驟簡(jiǎn)單，樣品用量少，避免了提取和蒸餾過(guò)程中溶劑中雜質(zhì)的潛在干擾，尤其適用于中藥中可揮發(fā)性成分。

（3）越來(lái)越多的研究著重于APS 結(jié)構(gòu)分析的單糖組成和糖苷鍵連接狀況。對(duì)膜莢黃芪內(nèi)的低分子量多糖LMW-ASP 進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，經(jīng)過(guò)高碘酸鹽氧化和Smith 降解處理后通過(guò)GC 系統(tǒng)得出其分子量為5.6×103Da，由Glc、Gal、Ara、Xyl、GalA 組成，其摩爾比為10.0∶1.3∶1.7∶1.0∶0.9[21]；蒙古黃芪內(nèi)的多糖經(jīng)FTIR 和GC 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)解析后發(fā)現(xiàn)，其單糖由Ara、Man、Glu、Gal 組成，摩爾比為0.0992∶1.26∶1.00∶0.0115[22]；通過(guò)UV、FTIR、HPLC 等方法對(duì)膜莢黃芪內(nèi)APS 進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)其分子量為1.77×106、1.59×104Da 的APS 占比分別為38%和57%，單糖由Glc、Gal、Ara 組成，摩爾比為27.92∶5.20∶2.86[23]；從蒙古黃芪中提取的一種黃芪多糖降解物純化后經(jīng)單糖組成分析、高碘酸鹽氧化和Smith 降解、甲基化分析、ESI-MS、FTIR 和NMR 等方法技術(shù)發(fā)現(xiàn)由Rha以（3→）連接，Rha 以（1→3）連接，Araf 以（1→3,4）連接，Gal 以（1→3）連接，末端殘基以-Gal 和-Glc 連接組成[24]。

各種APS 結(jié)構(gòu)鑒定見(jiàn)表2。

表2 APS 的結(jié)構(gòu)鑒定Tab.2 Structure identification of APS

3 結(jié)語(yǔ)

黃芪在中藥使用上有“十藥九芪”之稱，被譽(yù)為“補(bǔ)氣圣藥”，因此，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，黃芪是一味藥用歷史悠久、醫(yī)學(xué)應(yīng)用極廣的傳統(tǒng)中藥材，具有價(jià)格低廉、資源豐富、毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，隨著對(duì)其作用效果的深入研究而被應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)當(dāng)中。例如將黃芪多糖用于家禽生產(chǎn)、疫苗研究、作為免疫興奮劑、滋補(bǔ)劑、抗氧化劑、保肝劑、利尿劑、抗糖尿病、抗癌和祛痰劑等，充分利用其藥理作用制成合適的劑型來(lái)治療各種疾病，例如注射液被用來(lái)治療心臟疾病、血液腫瘤疾病及泌尿系統(tǒng)疾病等，可見(jiàn)其廣闊的發(fā)展前景。

APS 分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定是生物活性方向研究的基礎(chǔ)。在APS 的分離純化中，考慮到實(shí)際分離純化目的和經(jīng)濟(jì)條件，往往需要一種或幾種分離純化的方法相結(jié)合的方式進(jìn)行。藥材種類(lèi)、提取溶劑、粉碎粒徑、提取時(shí)間以及除雜方法均會(huì)影響提取效率，目前仍沒(méi)有能夠獲得量大且純凈的APS 的方法。在APS 結(jié)構(gòu)鑒定方面，不同的分離純化技術(shù)會(huì)直接影響多糖的結(jié)構(gòu)，采用不同的提取、分離方法得到的多糖，單糖組成、糖苷鍵連接狀況、分子量大小可能均有所不同。多糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，能夠明確多糖上述信息的方法已經(jīng)較為成熟，但是明確其構(gòu)效關(guān)系仍然是目前研究的難題。未來(lái)的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定應(yīng)著重于APS 這兩個(gè)方向研究，為黃芪多糖的深入臨床藥用奠定基礎(chǔ)。