RP-HPLC-UV 法測(cè)定清心蓮子飲基準(zhǔn)物質(zhì)中京尼平苷酸的含量*

那效旗，陳忠新，茍?chǎng)斡?，?明

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥藥劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

清心蓮子飲是國(guó)家中醫(yī)藥管理局公布的第一批經(jīng)典名方，源于宋代《太平惠民和劑局方》卷五，全方由去心的蓮子肉，黃芩，蜜炙黃芪，人參，茯苓，蜜炙甘草，麥冬，地骨皮，車前子九味中藥材共同組成[1]。依據(jù)古籍中記載的制備方法，結(jié)合現(xiàn)代科技，開展煎煮、濃縮、干燥等過程的研究，確定其“基準(zhǔn)物質(zhì)”為凍干粉。全方清瀉心火，補(bǔ)氣養(yǎng)陰，收斂固下?，F(xiàn)代，臨床多用于尿路感染等泌尿系統(tǒng)疾病，應(yīng)用廣泛，具有很好的開發(fā)價(jià)值[2，3]。《醫(yī)方考》記載：“此方主要用于患勞淋病的人。只有用車前子的滑，才能使得淋去?！睋?jù)現(xiàn)代研究，車前子中的京尼平苷酸淡滲利濕[4]，在全方中起不可或缺的作用，為更好保證全方的藥理藥效作用，本文采用RP-HPLC-UV 法建立清心蓮子飲基準(zhǔn)物質(zhì)中京尼平苷酸含量的測(cè)定方法，客觀、高效、量化地反映出清心蓮子飲的質(zhì)量，為下一步清心蓮子飲復(fù)方制劑的質(zhì)量控制提供研究和借鑒的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑和藥材

AB204-N 型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；BL6-180A 型超聲波清洗儀（上海比朗儀器有限公司）；Thermo -Sciencetific Ultimate3000 型高效液相色譜儀（包括UV 檢測(cè)器，美國(guó)Thermo 公司）。

甲醇（色譜純 迪馬科技公司）；純凈水（屈臣氏有限公司）；HAc（AR 天津市富宇精細(xì)化工有限公司）。

清心蓮子飲基準(zhǔn)物質(zhì)（自制，批號(hào)：QX20191011，QX20191012,QX20191013）；京尼平苷酸對(duì)照品（批號(hào)：110721-201014），中國(guó)藥品生物制品檢定所，使用面積歸一化法測(cè)定其純度大于98%。方中車前子等藥材均購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，均經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥鑒定教研室王振月教授鑒定基原。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 供試品提取溶劑的考察 稱取清心蓮子飲物質(zhì)基準(zhǔn)（批號(hào)：QX20191011）各0.22g，共3 份。分別將其置于具塞錐形瓶中，加入濃度分別為30%、60%、90%和100%的甲醇20mL，密塞。以250W 功率，40kHz 超聲20min，取出錐形瓶并搖勻，濾過，續(xù)濾液蒸干，殘?jiān)尤爰状既芙?，定容?0mL 容量瓶中，即得。將其分別置于液相色譜儀中，各進(jìn)樣10μL，測(cè)得峰面積。結(jié)果表明，將60%的甲醇作為提取溶媒時(shí)，京尼平苷酸含量最高。結(jié)果見表1。

表1 供試品提取溶劑結(jié)果Tab.1 Result table of extraction solvent of samples

本文分別對(duì)提取方法，提取溶劑進(jìn)行考察，以選出最終優(yōu)化制備方法。首先考察將湯劑水浴蒸干，干燥后用甲醇復(fù)溶，觀察色譜基線，靈敏度等，發(fā)現(xiàn)分離效果和分離度不如采用清心蓮子飲基準(zhǔn)物質(zhì)制備效果好。取清心蓮子飲基準(zhǔn)物質(zhì)分別加入濃度為30%、60%、90%、100%的甲醇[5，6]，結(jié)果表明，用濃度60%甲醇作為提取溶媒時(shí)，京尼平苷酸含量最高。故采用濃度為60%的甲醇作為提取溶媒，提取清心蓮子飲基準(zhǔn)物質(zhì)。

1.2.2 供試品的制備 根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，確定本品供試液制備方法如下：取清心蓮子飲基準(zhǔn)物質(zhì)0.22g，精密稱定，置于50mL 具塞錐形瓶中，加入濃度為60%的甲醇20mL，密塞。以功率為250W、頻率為40kHz 超聲20min，取出，搖勻，濾過，續(xù)濾液蒸干，用濃度為60%的甲醇定容至10mL 容量瓶中，即得。

1.2.3 對(duì)照品的制備 取一定量的京尼平苷酸對(duì)照品，精密稱定。加甲醇定容至10mL 容量瓶中，制成濃度為0.09mg·mL-1的溶液，即得。

1.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按清心蓮子飲物質(zhì)基準(zhǔn)制備工藝，稱取除車前子外的其他8 味藥材飲片（共計(jì)13g），制成缺車前子的陰性凍干粉，按1.2.2項(xiàng)下制成車前子陰性樣品對(duì)照溶液。

1.2.5 色譜條件 采用色譜柱：依利特 C18柱（Sinochrom ODS-BP,4.6mm×200mm,5μm）；柱溫箱調(diào)為25℃；流動(dòng)相流速為1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；樣品進(jìn)樣量為10μL；流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：0.5% HAc 溶液；按照時(shí)間梯度洗脫程序進(jìn)行梯度洗脫，洗脫條件：0～1min，5% A；1～14min，5%～32% A；供試品及對(duì)照品中各色譜峰均呈現(xiàn)較好的分離效果，相應(yīng)色譜峰的理論塔板數(shù)均大于3000，色譜圖見圖1。

圖1 色譜圖Fig.1 Chromatograms

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系考察 精密吸取0.09mg·mL-1的京尼平苷酸對(duì)照品溶液，設(shè)置高效液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣器的進(jìn)樣量分別為2、4、6、8、10μL，按“1.2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。橫坐標(biāo)（X）為進(jìn)樣質(zhì)量（μg），縱坐標(biāo)（Y）為峰面積。進(jìn)行線性回歸后得到線性回歸方程：Y=11.185X+0.065（R2=0.9999），線性范圍：0.18～0.90μg。結(jié)果表明，在線性范圍內(nèi)，峰面積積分?jǐn)?shù)值與其呈現(xiàn)的線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 京尼平苷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of geniposidic acid

2.1.2 儀器精密度試驗(yàn) 精密稱定清心蓮子飲物質(zhì)基準(zhǔn)（批號(hào)：QX20191011）0.22g，按1.2.2 項(xiàng)下確定的方法制備供試品溶液，每次進(jìn)樣10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，以京尼平苷酸為測(cè)定指標(biāo)，RSD 值為0.76%（RSD＜3%），表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批清心蓮子飲物質(zhì)基準(zhǔn)6 份，按照1.2.2 項(xiàng)下的方法分別制成基準(zhǔn)物質(zhì)的供試品溶液，各進(jìn)樣10μL，計(jì)算含量與RSD 值。結(jié)果見表2。

表2 京尼平苷酸重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Result of geniposidic acid repeatability test

由表2 可見，京尼平苷酸的平均含量（n=6）為4.8025mg·劑-1，RSD（n=6）為2.65%（RSD＜5%），結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取清心蓮子飲物質(zhì)基準(zhǔn)（批號(hào)：QX20191011）0.22g，精密稱定，按1.2.2 項(xiàng)下確定的處理方法，制備供試品溶液。將其置于液相色譜儀中，設(shè)置程序每隔1h 進(jìn)樣10μL，連續(xù)進(jìn)樣12h。結(jié)果見表3。

由表3 可見，在12h 內(nèi)供試品溶液中京尼平苷酸含量穩(wěn)定，RSD 值小于3%。說明供試品溶液在配制完成后的12h 內(nèi)測(cè)定均穩(wěn)定。

表3 京尼平苷酸穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Stability test result of geniposidic acid

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn) 取一定量已知含量的清心蓮子飲物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉6 份，分別精密稱定，再在每份樣品中分別加入0.14mg·mL-1的京尼平苷酸對(duì)照品溶液1mL，按1.2.2 項(xiàng)下確定的方法制備供試品溶液，每次進(jìn)樣10μL，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表4。

表4 京尼平苷酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.4 Test result of recovery of geniposidic acid by adding samples（n=6）

由表4 可知，結(jié)果均在95%～105%之間，說明該方法測(cè)定的京尼平苷酸含量符合要求。該方法學(xué)合理，可靠。

2.2 含量測(cè)定

取不同批次的清心蓮子飲基準(zhǔn)物質(zhì)3 批，按照2.2 項(xiàng)下制備供試液，按照1.2.5 色譜條件進(jìn)樣，將得到的色譜峰面積代入到線性回歸方程中，計(jì)算清心蓮子飲基準(zhǔn)物質(zhì)中京尼平苷酸的含量，結(jié)果見表5。

表5 京尼平苷酸含量測(cè)定（mg·劑-1,n=3）Tab.5 Determination of geniposidic acid content（mg·dose-1,n=3）

由于飲片產(chǎn)地不同，批次不同，導(dǎo)致制備的清心蓮子飲物質(zhì)基準(zhǔn)含量有所差異，為確定各批次清心蓮子飲物質(zhì)基準(zhǔn)含量在合理波動(dòng)范圍內(nèi)，取3 批清心蓮子飲物質(zhì)基準(zhǔn)測(cè)定，京尼平苷酸的含量為4.57～4.88mg·劑-1，平均值為4.76mg·劑-1。

3 結(jié)論

本文采用RP-HPLC-UV 法建立了對(duì)清心蓮子飲基準(zhǔn)物質(zhì)中京尼平苷酸含量的測(cè)定方法，該方法具有較好的專屬性，準(zhǔn)確性和靈敏度，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，分離度良好，精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率符合方法學(xué)驗(yàn)證要求，該方法可作為對(duì)清心蓮子飲基準(zhǔn)物質(zhì)中京尼平苷酸含量測(cè)定的方法，亦可為清心蓮子飲的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和方法。