人乳頭瘤病毒DNA基因分型和E6/E7 mRNA檢測(cè)在宮頸癌篩查中的臨床價(jià)值

陸 璐，成 建

1江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院生化教研室，江蘇 南京 211800；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，江蘇 南京 210004

宮頸癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在我國(guó)女性惡性腫瘤中位居第二。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的感染密切相關(guān)［1］。不同的HPV亞型具有不同的致病性。目前已分離出HPV 亞型120 余種，其中常見(jiàn)高危型有18種。臨床上常用的HPV DNA 基因分型檢測(cè)能反映宮頸上皮細(xì)胞的病毒種類和載量，但對(duì)病毒的活動(dòng)程度無(wú)法知曉。研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPV E6/E7 mRNA可反映致癌基因E6/E7的活動(dòng)度，其過(guò)度表達(dá)是宮頸癌及癌前病變發(fā)生的關(guān)鍵［2］。本研究通過(guò)比較HPV DNA基因分型檢測(cè)和HPV E6/E7 mRNA 檢測(cè)結(jié)果，評(píng)估兩種方法在宮頸癌早期篩查中的診斷價(jià)值。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

選取2018年1月1日—12月31日在南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院婦科、宮頸科、婦女保健門診就診，并自愿接受宮頸部位HPV DNA 基因分型檢測(cè)及HPV E6/E7 mRNA 檢測(cè)的女性，年齡18～88 歲。其中，接受HPV DNA 基因分型檢測(cè)的樣本共29 081 例，接受E6/E7 mRNA 檢測(cè)的樣本共22 562例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有被檢者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集

標(biāo)本使用專用HPV 采樣刷，由門診醫(yī)生取宮頸脫落細(xì)胞儲(chǔ)存于有專用細(xì)胞保存液的取樣管中，4 ℃冰箱保存，1 周內(nèi)檢測(cè)。

1.2.2 HPV DNA分型檢測(cè)

使用亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司生產(chǎn)的人乳頭瘤病毒（HPV）基因分型檢測(cè)試劑盒及人乳頭瘤病毒分型基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)23種HPV基因型進(jìn)行檢測(cè)，其中包括18 種高危型（HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV83、HPV82）和5種低危型（HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV81）。檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒及檢測(cè)系統(tǒng)說(shuō)明書進(jìn)行，包括標(biāo)本DNA 提取、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reac?tion，PCR）、導(dǎo)流雜交。根據(jù)芯片上HPV 基因型分布的相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行判讀。

1.2.3 HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)

使用美國(guó)豪洛捷公司（Hologic）研發(fā)的Aptima HPV（14種高危亞型）試劑盒、Aptima HPV 16、HPV 18/45 分型檢測(cè)試劑盒及Panther一體化檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行HPV E6/E7 mRNA 檢測(cè)。檢測(cè)過(guò)程分為兩個(gè)步驟，第一步：使用Aptima HPV（14 種高危亞型）試劑盒對(duì)14 種高危型（HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68）E6/E7 mRNA 進(jìn)行檢測(cè)；第二步：使用Aptima HPV 16、HPV18/45 分型檢測(cè)試劑盒對(duì)第一步檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的樣本進(jìn)行HPV16、HPV18/45分型檢測(cè)。檢測(cè)操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒及檢測(cè)系統(tǒng)說(shuō)明書進(jìn)行（該檢測(cè)過(guò)程為全自動(dòng)、一體化過(guò)程，僅需將檢測(cè)試劑、樣本放入后機(jī)器運(yùn)行檢測(cè)程序即可）。檢測(cè)結(jié)果判讀：系統(tǒng)自動(dòng)讀出“陰性、HPV 16型陽(yáng)性、HPV 18/45型陽(yáng)性、其他陽(yáng)性”4種結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以百分率作為HPV 感染的統(tǒng)計(jì)描述。兩樣本間率的比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果分析

在接受HPV DNA 基因分型檢測(cè)的29 081 例樣本中，共檢出陽(yáng)性例數(shù)8 602 例，HPV 陽(yáng)性率為29.57%（8 602/29 081），其中高危型陽(yáng)性例數(shù)7 425例，高危型陽(yáng)性率為25.53%，占86.32%（7 425/8 602）。檢測(cè)的23 種HPV 亞型均有檢出，高危型HPV 感染前5 名依次為HPV52、HPV16、HPV53、HPV58、HPV51，占陽(yáng)性例數(shù)百分比分別為22.13%（1 904/8 602）、14.32%（1 232/8 602）、13.22%（1 137/8 602）、10.63%（914/8 602）、9.13%（785/8 602）。在接受E6/E7 mRNA 檢測(cè)的22 562 例樣本中，共檢出陽(yáng)性病例2 840 例，高危型陽(yáng)性率為12.59%（2 840/22 562），其中HPV16 陽(yáng)性患者557 例，占19.61%（557/2 840），HPV18/45 陽(yáng)性患者198 例，占6.97%（198/2 840），其他類型陽(yáng)性患者2 091例，占73.63%（2 091/2 840）。具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 不同年齡段高危型陽(yáng)性率比較

采用HPV DNA 基因分型和E6/E7 mRNA 檢測(cè)結(jié)果按不同年齡段分組，各組檢測(cè)例數(shù)和高危型陽(yáng)性例數(shù)詳見(jiàn)表2。HPV DNA 基因分型檢測(cè)，高危型陽(yáng)性率最高峰出現(xiàn)在＜25 歲年齡段；HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)，高危型陽(yáng)性率排名前二的分別是≥65歲年齡段、55～＜65歲年齡段?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種檢測(cè)方法中，在不同年齡段間高危型陽(yáng)性率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但各年齡段間兩兩比較，兩種檢測(cè)方法中，55～＜65歲年齡段與≥65歲年齡段間高危型陽(yáng)性率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果一覽表

2.3 不同年齡段兩種檢測(cè)方法HPV16、HPV18/45陽(yáng)性率比較

不同年齡段，兩種檢測(cè)方法的HPV16、HPV18/45陽(yáng)性例數(shù)見(jiàn)表3?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示，除55～＜65歲年齡段、≥65歲年齡段，其余年齡段兩種檢測(cè)方法檢測(cè)的HPV16、HPV18/45陽(yáng)性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

HPV是一組無(wú)包膜的小DNA病毒，屬乳頭瘤病毒科。持續(xù)高危型HPV 感染是導(dǎo)致宮頸癌的主要原因，其分型檢測(cè)在宮頸癌篩查中具有舉足輕重的作用［3］。

表2 不同年齡段高危型陽(yáng)性率比較

在本研究中，HPV DNA分型檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性構(gòu)成比排名前五的亞型分別為HPV52（22.13%）、HPV16（14.32%）、HPV53（13.22%）、HPV58（10.63%）、HPV51（9.12%）。盡管在世界范圍內(nèi)，高危型HPV基 因 型 排 序 是HPV16、HPV18、HPV31、HPV58、HPV52，但多項(xiàng)研究數(shù)據(jù)顯示，亞洲地區(qū)HPV58、HPV52的陽(yáng)性率超過(guò)HPV18［4-5］。然而，對(duì)宮頸癌患者的研究顯示，HPV16和HPV18依然是最常見(jiàn)的感染亞型［6］。相較于HPV16、HPV18，其他高危型HPV的致癌風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低。女性一生中感染HPV 的概率高達(dá)80%，其中90%的感染是一過(guò)性的，2～3年可被自身免疫清除。這就導(dǎo)致HPV DNA 基因分型檢測(cè)在實(shí)際應(yīng)用中假陽(yáng)性率偏高，由此可能導(dǎo)致不必要的陰道鏡檢查，加重患者的心理壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，尋找敏感度較好且更特異的HPV檢測(cè)方法是目前研究的熱點(diǎn)。

表3 不同年齡段中兩種檢測(cè)方法HPV16、18/45陽(yáng)性率比較 ［n（%）］

Aptima HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)作為一種宮頸癌前病變?cè)缙诤Y查的新技術(shù)，能有效評(píng)估宮頸上皮細(xì)胞因E6/E7 癌基因表達(dá)導(dǎo)致的病變程度［7］。高危型HPV 持續(xù)感染基底層細(xì)胞后，病毒E6/E7 癌基因的表達(dá)水平會(huì)受細(xì)胞分化程度和患者免疫水平的影響。HPV E6/E7 mRNA 的表達(dá)是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的重要因素［8］。E6/E7 mRNA 檢測(cè)相比DNA檢測(cè)，前者能更加精準(zhǔn)地發(fā)現(xiàn)具有臨床重要性的感染［9］。本研究中婦女宮頸高危型HPV E6/E7 mRNA 陽(yáng)性者所占比例為12.59%（2 840/22 562），低于HPV DNA 基因分型檢測(cè)的高危型陽(yáng)性率25.53%（7 425/29 081）。

為了更客觀地比較兩種檢測(cè)方法陽(yáng)性率的差異，本研究對(duì)這兩種檢測(cè)方法都包含的3 種型別（HPV16、HPV18/45）陽(yáng)性率分年齡段比較?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示，除55～＜65 歲年齡段、≥65 歲年齡段，其余年齡段兩種檢測(cè)方法中HPV16、HPV18/45 陽(yáng)性率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這可能是因?yàn)镠PV DNA 分型檢測(cè)是對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)游離狀態(tài)與整合狀態(tài)的HPV DNA 進(jìn)行檢測(cè)，特異性相對(duì)較低。而HPV E6/E7 mRNA 僅檢測(cè)整合狀態(tài)的病毒RNA 片段，大大減少“假陽(yáng)性”出現(xiàn)的概率。但在55～＜65 歲、≥65歲兩個(gè)年齡段，這兩種檢測(cè)方法中HPV16、HPV18/45 陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與機(jī)體清除率下降、持續(xù)性感染率增高有關(guān)。同時(shí)提示，在這兩個(gè)年齡段，兩種方法的篩查效率相近。

本研究按照年齡對(duì)樣本進(jìn)行分段，不同年齡段之間，兩種檢測(cè)方法中高危型陽(yáng)性率的分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明按這種年齡段分組的研究方法有一定的臨床意義。

在接受HPV DNA基因分型檢測(cè)的標(biāo)本中，高危型陽(yáng)性率最高峰出現(xiàn)在＜25 歲年齡段（50.30%），與浙江、上海的報(bào)道相似［10-11］。這可能與本研究中25 歲以下年齡段就診的女性性生活開(kāi)始早、性伴侶多有關(guān)。而HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)中＜25年齡段HPV16、HPV18/45 陽(yáng)性率明顯低于HPV DNA 分型檢測(cè)。這提示該年齡段女性機(jī)體有著良好的病毒清除能力，大部分病例僅為一過(guò)性感染。因此，對(duì)于＜25歲年輕女性，不推薦進(jìn)行HPV篩查。同時(shí)，在經(jīng)濟(jì)條件允許的情況下，可考慮盡早接種HPV疫苗。

在接受高危型HPV E6/E7 mRNA 檢測(cè)的標(biāo)本中，高危型陽(yáng)性率排名前二的分別是≥65歲年齡段、55～＜65 歲年齡段。這雖然與HPV DNA 分型檢測(cè)的年齡分布模式不盡相同有關(guān)，但兩種檢測(cè)方法的結(jié)果提示這兩個(gè)年齡段婦女HPV 感染率高、E6/E7陽(yáng)性率高。這可能與這兩個(gè)年齡段婦女體內(nèi)激素水平低、波動(dòng)大，易引起免疫功能失調(diào)導(dǎo)致病毒的再活動(dòng)有關(guān)［12］。該年齡人群普遍已絕經(jīng)，宮頸上皮萎縮后以中層及外底層細(xì)胞為主，細(xì)胞學(xué)檢查的假陽(yáng)性率比較高。因此單獨(dú)進(jìn)行HPV 篩查在這兩個(gè)年齡段有著重要的臨床意義。

此外，值得一提的是，各年齡段間兩兩比較，兩種檢測(cè)方法中，55～＜65 歲年齡段與≥65 歲年齡段間高危型陽(yáng)性率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這就提示我們，在后續(xù)的研究中可以將這兩個(gè)年齡段合并研究。

HPV E6/E7 蛋白的表達(dá)是HPV 病毒活躍的信號(hào)。與HPV DNA基因分型檢測(cè)相比，E6/E7 mRNA檢測(cè)能有效剔除HPV 一過(guò)性感染造成的假陽(yáng)性結(jié)果，提高篩查效率，減少過(guò)度診斷和治療。但是，目前HPV E6/E7 mRNA 檢測(cè)陽(yáng)性只是一個(gè)定性結(jié)果，國(guó)內(nèi)外對(duì)其定量檢測(cè)的最佳診斷臨界點(diǎn)尚存在一定爭(zhēng)議［13］，其與宮頸病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性也仍需深入探討。本次研究只對(duì)兩種篩查方法進(jìn)行了簡(jiǎn)單對(duì)比，二者的臨床應(yīng)用價(jià)值的比較還有待進(jìn)一步加強(qiáng)。