胎盤(pán)生長(zhǎng)因子熒光免疫層析法檢測(cè)的臨床性能評(píng)估

馬錦琪，李 鷹，黃建榮，薛一峰，許亞豐，王春新*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院產(chǎn)科，2醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，江蘇 無(wú)錫 214023

孕婦血清中的胎盤(pán)生長(zhǎng)因子（placental growth factor，PlGF）是首個(gè)經(jīng)過(guò)大規(guī)模臨床驗(yàn)證的、可用于孕婦子癇前期預(yù)測(cè)及診斷的生物標(biāo)志物［1-2］，PlGF濃度的變化與孕婦罹患子癇前期的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。

目前，PlGF的檢測(cè)技術(shù)有時(shí)間分辨熒光免疫分析、微流控、電化學(xué)發(fā)光法等［3-4］，這些技術(shù)都存在操作復(fù)雜或成本高昂等缺點(diǎn)?；跓晒饷庖邔游龅臋z測(cè)方法操作便捷，成本低廉，可實(shí)現(xiàn)在臨床門(mén)診隨到隨診，方便快速預(yù)測(cè)子癇前期的風(fēng)險(xiǎn)，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本研究建立了熒光免疫層析的PlGF檢測(cè)方法，并對(duì)其分析性能與臨床性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 材料

鼠抗人PlGF 單抗（克隆號(hào)：P616）和羊抗人PlGF 多抗（貨號(hào)：CSB?DA217）（無(wú)錫金泰格生物科技有限公司）；重組人PlGF 蛋白（貨號(hào)：TP723367，OriGene 公司，美國(guó)）；熒光微球（貨號(hào)：FCEU002，規(guī)格：0.19 μm）（Bangs公司，美國(guó)）。對(duì)照試劑：胎盤(pán)生長(zhǎng)因子檢測(cè)試劑盒（電化學(xué)發(fā)光法，批號(hào)：21906701，Roche公司，德國(guó)）。熒光分析儀（廣州藍(lán)勃生物科技有限公司，型號(hào)：AFS?1000）；化學(xué)發(fā)光分析儀（Roche公司，德國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 反應(yīng)體系的建立

1.2.1.1 抗體標(biāo)記條件

抗體標(biāo)記按熒光微球說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每毫克微球標(biāo)記80～100 μg抗體。將微球與抗體（鼠抗人PlGF單抗）混合于pH為5.0～7.5的5種MES緩沖液（0.1 mol/L）中，放置室溫，200 r/min搖床上反應(yīng)2 h后于13 000 r/min 4 ℃離心30 min，取上清液測(cè)定殘余抗體的量。

1.2.1.2 標(biāo)記抗體與包被抗體用量

線性范圍預(yù)設(shè)：20.0～9 000.0 pg/mL，按照表1的棋盤(pán)法，設(shè)置不同的標(biāo)記抗體以及包被抗體（羊抗人PlGF 多抗）用量；組裝PlGF 檢測(cè)卡，采用0～10 000.0 pg/mL 的質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，確立PlGF 標(biāo)記抗體與包被抗體的最佳用量。

表1 棋盤(pán)法選擇最佳的標(biāo)記抗體與包被抗體用量Table 1 The optimal amounts of conjugated and coated antibody selected by checkerboard method

1.2.1.3 反應(yīng)時(shí)間

在確定上述參數(shù)的基礎(chǔ)上，采用定值質(zhì)控品（500.0 pg/mL）摸索反應(yīng)完成時(shí)間。

1.2.2 分析性能評(píng)價(jià)

參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）EP06、EP15、EP07 文件［7-9］和《WS/T 420?2013 臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)商品化定量試劑盒分析性能的驗(yàn)證》［10-11］要求，對(duì)本項(xiàng)目建立的PlGF熒光免疫層析檢測(cè)方法的分析性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，具體方法如下。

1.2.2.1 空白限

用空白質(zhì)控品重復(fù)測(cè)定10次，計(jì)算信號(hào)值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，得出平均值+2×標(biāo)準(zhǔn)差所對(duì)應(yīng)的信號(hào)值，代入定標(biāo)曲線方程計(jì)算對(duì)應(yīng)的濃度值，即為空白限。

1.2.2.2 靈敏度（檢出限）

參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［11］的方法，具體如下：預(yù)設(shè)靈敏度（檢出限）為10.0 pg/mL，配制5份低值樣本（10.0～20.0 pg/mL），每份樣本檢測(cè)5次，對(duì)檢測(cè)結(jié)果按照大小進(jìn)行排序并與空白限進(jìn)行比較，至少2 份樣本的濃度高于空白限，則預(yù)設(shè)10.0 pg/mL 即為PlGF 檢測(cè)方法的靈敏度（檢出限）。

1.2.2.3 準(zhǔn)確度（回收率）

將高濃度的PlGF樣品A（11 045.0 pg/mL，10 μL）加入到空白質(zhì)控品B（100 μL）中；重復(fù)測(cè)試3 次求平均值，根據(jù)以下公式計(jì)算回收率：（R）=［C×（V0+V）-C0×V0］/（V×Cs）×100%，式中R 為回收率；V 為樣品A 液的體積；V0為樣品B 液的體積；C為樣品B 液加入A液后的檢測(cè)濃度；C0為樣品B液的濃度；Cs為樣品A 液的濃度。參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［11］的要求，回收率應(yīng)在85%～115%。

1.2.2.4 線性范圍

參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［11］的方法，確立本項(xiàng)目PlGF熒光免疫層析檢測(cè)方法的線性范圍，具體方法如下：預(yù)設(shè)線性范圍為20.0～9 000.0 pg/mL；將高濃度質(zhì)控品（9 354.0 pg/mL）稀釋至5個(gè)濃度，最低濃度應(yīng)接近線性范圍下限（20.0 pg/mL），每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算平均值；計(jì)算檢測(cè)濃度的均值與理論值的線性相關(guān)性，線性相關(guān)系數(shù)r應(yīng)不低于0.990。

1.2.2.5 重復(fù)性

濃度分別為500.0、5 000.0 pg/mL 的PlGF 質(zhì)控品各重復(fù)檢測(cè)10 次，計(jì)算10 次測(cè)量結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，根據(jù)以下公式計(jì)算變異系數(shù)：CV（%）=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值×100%。

1.2.2.6 干擾試驗(yàn)

交叉反應(yīng)（特異性）：取重組血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和重組表皮生長(zhǎng)因子（EGF），加入至空白質(zhì)控品及PlGF 高值血清，終濃度分別為200.0 ng/L 和3.0μg/L，重復(fù)測(cè)定3次計(jì)算均值。

干擾物質(zhì)：取PlGF 高值血清，分別加入不同濃度的血紅蛋白、總膽紅素等可能的干擾物質(zhì)，每個(gè)樣本分別重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算平均值及干擾率，干擾率（%）=（干擾樣本實(shí)測(cè)濃度-樣本理論濃度）/樣本理論濃度×100%。

1.2.3 臨床性能評(píng)價(jià)

收集2018 年2—9 月來(lái)南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院就診的136 例孕婦（年齡18～45 歲、孕周20～34+6周）的血清樣本（不少于0.5 mL）；采集的血清在-20 ℃條件下冷凍保存，1個(gè)月內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。每份血清樣本均采用熒光免疫層析法與電化學(xué)發(fā)光試劑法平行檢測(cè)，考察兩種檢測(cè)方法的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS17.0 和GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析；兩種檢測(cè)方法結(jié)果的差異分析采用Bland?Altman檢驗(yàn)，采用線性回歸進(jìn)行相關(guān)性分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)體系的建立

2.1.1 抗體標(biāo)記的最佳條件

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)pH為6.5～7.0時(shí)，殘余抗體最少（表2）；因此將抗體的標(biāo)記pH確定為6.5～7.0。

表2 不同pH條件下抗體的標(biāo)記效率Table 2 Conjugated efficiency of antibody with different pH condition

2.1.2 標(biāo)記抗體與包被抗體用量

如圖1 所示，配方2、配方4、配方5 符合線性范圍的要求（即在20.0～9 000.0 pg/mL內(nèi)，熒光信號(hào)值-濃度值的曲線接近于直線）；因此確定標(biāo)記抗體的噴點(diǎn)量為3.5 μL/cm，包被抗體的用量為1.5 μg/μL。

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間

取質(zhì)控品（500.0 pg/mL）80 μL 加入PlGF 檢測(cè)卡，分別于5、10、15 min檢測(cè)，重復(fù)3次求平均值，結(jié)果顯示，檢測(cè)卡在10 min時(shí)已完成反應(yīng)（表3）；為確保反應(yīng)充分，確立反應(yīng)時(shí)間為15 min。

2.2 分析性能評(píng)價(jià)

2.2.1 空白限

圖1 不同配方與信號(hào)值的對(duì)應(yīng)關(guān)系Figure 1 Relation between different formulas and the sig?nal value

表3 不同反應(yīng)時(shí)間后的檢測(cè)結(jié)果Table 3 Test results after different reaction times（pg/mL）

空白質(zhì)控品重復(fù)測(cè)定10 次，信號(hào)的平均值為0.052 3，標(biāo)準(zhǔn)差為0.002 5，根據(jù)均值+2×標(biāo)準(zhǔn)差，代入定標(biāo)曲線方程計(jì)算得到PlGF 檢測(cè)卡的空白限為6.08 pg/mL。

2.2.2 靈敏度（檢測(cè)限）

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，5 個(gè)低值樣本的檢測(cè)結(jié)果均高于空白限（6.08 pg/mL），確定PlGF 檢測(cè)卡的靈敏度（檢出限）為10.0 pg/mL（表4）。

2.2.3 準(zhǔn)確度（回收率）

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定PlGF 檢測(cè)卡的準(zhǔn)確度（回收率）為97.98%（表5）。

2.2.4 線性范圍

以理論濃度為x軸，以實(shí)際檢測(cè)濃度為y軸，考察相關(guān)性。結(jié)果顯示，PlGF檢測(cè)卡在16.7～9 000.0 pg/mL的線性相關(guān)系數(shù)r=0.999＞0.990，因此，確定PlGF檢測(cè)卡的線性范圍為20.0～9 000.0 pg/mL（表6、圖2）。

2.2.5 重復(fù)性

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表7），PlGF濃度在500.00 pg/mL和5 000.0 pg/mL 時(shí)，檢測(cè)卡的重復(fù)性（CV）分別為3.14%和2.98%。

2.2.6 干擾試驗(yàn)

交叉反應(yīng)（特異性）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VEGF、EGF與PlGF 檢測(cè)卡的交叉反應(yīng)在-2.48%～3.95%，對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著影響（表8）。

血紅蛋白等干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾率在-7.11%～-0.79%，其中，膽紅素、類(lèi)風(fēng)濕因子和維生素C的干擾率均超過(guò)-5%，需引起重視，可作為本研究PlGF檢測(cè)方法后繼改進(jìn)的內(nèi)容之一（表9）。

表4 PlGF檢測(cè)卡的靈敏度（檢出限）Table 4 Sensitivity（limit of detection）of PlGF card （pg/mL）

表5 PlGF檢測(cè)卡的準(zhǔn)確度Table 5 Accuracy of PlGF card

表6 PlGF檢測(cè)卡線性范圍Table 6 Linear range of PlGF card

圖2 PlGF檢測(cè)卡的線性相關(guān)性Figure 2 Linear correlation of PLGF card

2.3 臨床性能評(píng)價(jià)

2.3.1 兩種檢測(cè)方法的相關(guān)性分析

每個(gè)臨床血清樣本經(jīng)熒光免疫層析法與對(duì)照方法平行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果如圖3所示，兩種PlGF檢測(cè)方法具有良好的線性相關(guān)性：y=1.032x-5.002（r=0.991＞0.950）。

表7 PlGF檢測(cè)卡重復(fù)性研究結(jié)果Table 7 Repeatability of PlGF card

表8 交叉反應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響Table 8 Influence of cross reaction on detection

2.3.2 兩種檢測(cè)方法的差異性分析

采用Bland?Altman 檢驗(yàn)分析兩種方法檢測(cè)結(jié)果的差異，結(jié)果如圖4 所示，熒光免疫層析法（考核系統(tǒng)）檢測(cè)結(jié)果的平均值略高于電化學(xué)發(fā)光法（參比系統(tǒng)），但是兩種檢測(cè)方法的平均值差值僅為-8.98 pg/mL，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

先兆子癇是一種嚴(yán)重的妊娠并發(fā)癥，通常發(fā)生在懷孕20 周以后。PlGF 濃度異常引起血管內(nèi)皮功能障礙，是先兆子癇發(fā)生的重要原因［12-13］；檢測(cè)血清中PlGF 水平的變化可顯著提高先兆子癇診斷的準(zhǔn)確性。

表9 干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響Table 9 Influence of interfering substances on detection

圖3 熒光免疫層析法與電化學(xué)發(fā)光法的相關(guān)性Figure 3 Correlation between fluorescence immunochro?matography and electrochemiluminescence

圖4 熒光免疫層析法與電化學(xué)發(fā)光法的差異分析Figure 4 Difference analysis of fluorescence immunochro?matography and electrochemiluminescence

PlGF現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)主要包括化學(xué)發(fā)光法、時(shí)間分辨免疫熒光法等；這些檢測(cè)技術(shù)需要反復(fù)定標(biāo)，依賴大型分析儀器，因此，往往是收集樣本后集中檢測(cè)，給臨床診療帶來(lái)了極大不便。2012年美國(guó)Alere公司推出了一款基于微流控技術(shù)的PlGF檢測(cè)產(chǎn)品（Triage?PLGF），操作簡(jiǎn)便（滴加血清后15 min即可判讀結(jié)果），性能優(yōu)異，是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的PlGF 檢測(cè)技術(shù)［14］。但微流控檢測(cè)技術(shù)開(kāi)發(fā)難度極大，全球?qū)崿F(xiàn)量產(chǎn)的產(chǎn)品為數(shù)極少。近年來(lái)興起的熒光免疫層析技術(shù)是一種快速免疫學(xué)檢測(cè)方法［15-16］，具備與微流控相似的分析性能，靈敏度高，操作便捷，無(wú)需反復(fù)定標(biāo)，綜合成本更低，尤其適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，提高工作效率。

本研究基于熒光免疫層析技術(shù)建立PlGF 檢測(cè)方法，包括抗體標(biāo)記、包被、反應(yīng)時(shí)間等關(guān)鍵參數(shù)的優(yōu)化；同時(shí)依據(jù)CLSI 的EP6?A、EP15?A、EP7?A 等規(guī)范性文件，對(duì)熒光免疫層析檢測(cè)方法的分析性能，包括空白限、靈敏度、準(zhǔn)確度、線性范圍、重復(fù)性和干擾試驗(yàn)進(jìn)行了評(píng)價(jià)；最后，通過(guò)136例臨床樣本的檢測(cè)，證實(shí)本項(xiàng)目建立的PlGF熒光免疫層析檢測(cè)方法與電化學(xué)發(fā)光法具有良好的一致性。

綜上所述，本研究應(yīng)用熒光免疫層析技術(shù)，建立了血清中PlGF的檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)便、快速，分析性能與臨床性能優(yōu)異。今后，我們將進(jìn)一步改進(jìn)這一檢測(cè)技術(shù)，如降低類(lèi)風(fēng)濕因子等物質(zhì)的干擾，通過(guò)與自動(dòng)分析儀的適配研究實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，使之更適合應(yīng)用于臨床子癇前期風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估。