苦參堿調(diào)控Wnt/β?catenin途徑抑制宮頸癌細(xì)胞系Caski細(xì)胞侵襲遷移

鄭榮芳，劉 偉，張蕓中，樊學(xué)芬，郭鈺珍*

1蘭州大學(xué)第二醫(yī)院婦科，2麻醉科，甘肅 蘭州 730000

宮頸癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，起源于宮頸腺柱狀上皮、鱗狀上皮以及儲(chǔ)備細(xì)胞，其惡性程度較高，呈浸潤(rùn)生長(zhǎng)且易發(fā)生轉(zhuǎn)移［1］。已有大量研究表明腫瘤發(fā)生侵襲遷移與Wnt/β?catenin通路具有重要關(guān)系，該通路異常直接影響腫瘤的轉(zhuǎn)移［2］。Wnt/β?catenin信號(hào)通路變化能夠促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展［3］，β?catenin 作為轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的核心元件參與調(diào)節(jié)該通路［4］，從而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展［5］。Wnt2B可以通過(guò)經(jīng)典Wnt 途徑調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，Wnt/β?catenin 通路激活后，胞漿中的β?catenin 表達(dá)上調(diào)［6］，GSK?3β作為β?catenin 上游重要的負(fù)性調(diào)控因子，其失活與β?catenin 的表達(dá)呈正相關(guān)［7］。

苦參堿（matrine）是一個(gè)四環(huán)的喹嗪啶類生物堿，廣泛存在于豆科植物苦參、山豆根和苦豆子中［8］?？鄥A具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗肝纖維化、鎮(zhèn)痛和抗心律失常等，苦參堿制劑不良反應(yīng)較少，應(yīng)用廣泛［9］。已有研究表明其具有良好的抗腫瘤特性，參與調(diào)節(jié)腫瘤增殖、凋亡、血管生成、侵襲遷移等相關(guān)的多條信號(hào)通路［10-14］。且有研究表明，苦參堿在人白血病細(xì)胞、乳腺癌以及人鼻咽癌細(xì)胞中，均可通過(guò)抑制Wnt/β?catenin 信號(hào)通路的激活降低癌細(xì)胞生長(zhǎng)活性和誘導(dǎo)其分化［15］。故本研究將基于Wnt/β?catenin 信號(hào)通路研究苦參堿抑制宮頸癌細(xì)胞系Caski細(xì)胞侵襲遷移的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

人宮頸癌細(xì)胞系Caski 細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)?？鄥A（上海源葉公司）；MTT、二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、DMEM 高糖培養(yǎng)基（北京索萊寶生物科技有限公司）；Transwell 小室（Millipore 公司，美國(guó)）；基質(zhì)膠（Matrigel，BD 公司，美國(guó)）；胎牛血清（fetal calf se?rum，F(xiàn)BS，浙江天杭生物科技股份有限公司）；MMP?9 ELISA 試劑盒、VEGF ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；RIPA 裂解液、SDS?PAGE 凝膠試劑盒、山羊抗兔二抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；兔抗β?catenin 單克隆抗體、兔抗p?β?catenin 單克隆抗體（Abcam 公司，英國(guó)）。引物序列：GSK?3β上游5′?CACCTCTGGC?TACCATCCTTAT?3′，下游5′?ATTATTGGTCTGTC?CACGGTCT?3′；Wnt2B 上游5′?GTGTCCTGGCTG?GTTCCTTA?3′，下游5′?AGCTGGTGCAAAGGAA?AGAA?3′；GAPDH 上游5′?AAGGCTGTGGGCAAGG?3′，下游5′?TGGAGGAGTGGGTGTCG?3′。

1.2 方法

1.2.1 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后配制成1.5×105個(gè)/mL，以每孔100 μL 加入96 孔板中，37 ℃、飽和濕度、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，分別以0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 g/L 終濃度加入苦參堿，每組設(shè)6 個(gè)平行孔，加入相同體積的溶媒作為空白對(duì)照，分別處理24、48、72 h后，每孔加入20 mL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清，每孔加入150 μL DMSO 溶解MTT，于490 nm 處檢測(cè)光密度（optical density，OD）值，計(jì)算抑制率，抑制率=［（OD空白組-OD實(shí)驗(yàn)組）/OD空白組］×100%。

1.2.2 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

將Transwell 小室放入24 孔板，4 ℃預(yù)冷后，上室加入1∶4 稀釋的Matrigel，待凝固后，上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基配制的細(xì)胞懸液400 μL，下室加入20%FBS 的培養(yǎng)基，待細(xì)胞沉降后上室分別加入0.4、0.8 g/L 終濃度苦參堿，每組設(shè)6 個(gè)平行孔，加入相同體積的溶媒作為空白對(duì)照，處理24 h后，取出小室，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗后-20 ℃預(yù)冷甲醇固定5 min，用棉簽輕輕拭去上室未遷移的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色5 min，PBS 漂洗，拍照，計(jì)數(shù)。

1.2.3 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將Transwell小室放入24孔板孔，上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基配制的細(xì)胞懸液400 μL，下室加入20%FBS的培養(yǎng)基，待細(xì)胞沉降后上室分別加入0.4、0.8 g/L終濃度苦參堿，每組設(shè)6個(gè)平行孔，加入相同體積的溶媒作為空白對(duì)照，處理24 h 后，取出小室，PBS 漂洗后-20 ℃預(yù)冷甲醇固定5 min，用棉簽輕輕拭去上室未遷移的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色5 min，PBS漂洗，于倒置顯微鏡觀察拍照，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞遷移率。

1.2.4 ELISA實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入0.4、0.8 g/L 終濃度苦參堿，加入相同體積的溶媒作為空白對(duì)照，處理24 h后，收集無(wú)血清培養(yǎng)基，參照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)培養(yǎng)基中MMP?9、VEGF含量。

1.2.5 qRT?PCR實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入0.4、0.8 g/L 終濃度苦參堿，加入相同體積的溶媒作為空白對(duì)照，處理24 h后，加入1.5 mL TRIzol 于冰上吹打細(xì)胞，室溫靜置5 min，13 000 r/min離心5 min，吸取上清，加入氯仿，靜置離心，吸取上清加入異丙醇，靜置離心，棄去上清，75%乙醇清洗沉淀，離心棄上清，保留沉淀干燥，用DEPC 水溶解。然后按照TaKaRa 反應(yīng)試劑盒依次經(jīng)過(guò)去除基因組DNA 反應(yīng)、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和qPCR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃10 min 預(yù)變性；95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃30 s 40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt計(jì)算基因的表達(dá)量，其中ΔΔCt=（待測(cè)樣品目的基因的Ct 平均值-待測(cè)樣本看家基因的Ct 平均值）-（對(duì)照樣品目的基因的Ct 平均值-對(duì)照樣本看家基因的Ct 平均值）。

1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入0.4、0.8 g/L 終濃度苦參堿，加入相同體積的溶媒作為空白對(duì)照，處理24 h后，加入RIPA裂解液，置于冰上研碎至勻漿后，4 ℃放置30 min，13 000 r/min 離心10 min，取一部分上清，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，另取部分上清加入4×上樣緩沖液，煮沸變性后，加到4%濃縮膠濃縮，10%分離膠分離，再經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜、封閉，4 ℃孵育一抗（其中β?catenin抗體以1∶2 500稀釋，p?β?catenin抗體以1∶1 000稀釋），室溫孵育二抗，ECL發(fā)光液顯色，X醫(yī)用膠片顯影、定影等步驟，最后進(jìn)行拍照分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD?t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿對(duì)Caski細(xì)胞增殖的影響

隨著苦參堿濃度的不斷升高，Caski細(xì)胞增殖抑制率呈逐漸增大的趨勢(shì)。在苦參堿濃度＞0.1 g/L時(shí)，相同濃度下，對(duì)Caski 細(xì)胞的抑制率隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步增大（圖1），顯示苦參堿對(duì)Caski增殖抑制作用具有時(shí)間、濃度的依賴性。

圖1 苦參堿對(duì)Caski細(xì)胞的增殖抑制作用（n=6）Figure 1 Inhibitory effect of matrine on proliferation of Caski cells（n=6）

2.2 苦參堿對(duì)Caski細(xì)胞侵襲的影響

隨著苦參堿處理濃度的逐步升高，Caski細(xì)胞侵襲的數(shù)量逐漸減少，且與空白組相比，0.4、0.8 g/L處理組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖2）。

2.3 苦參堿對(duì)Caski細(xì)胞遷移的影響

隨著苦參堿處理濃度的升高，Caski細(xì)胞遷移的數(shù)量逐步減少，且與空白組相比，0.4、0.8 g/L處理組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，圖3）。

2.4 苦參堿對(duì)Caski細(xì)胞MMP?9、VEGF含量的影響

隨著苦參堿處理濃度的升高，Caski細(xì)胞上清培養(yǎng)液中MMP?9、VEGF含量均逐步降低，與空白組相比，0.4、0.8 g/L 處理組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，表1）。

2.5 苦參堿對(duì)Caski 細(xì)胞GSK?3β、Wnt2B mRNA 表達(dá)的影響

隨著苦參堿處理濃度的逐步升高，Caski細(xì)胞內(nèi)GSK?3β mRNA表達(dá)量逐漸增加，Wnt2B mRNA表達(dá)量逐漸減少，與空白組相比，0.4、0.8 g/L處理組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，圖4）。

圖2 不同濃度的苦參堿對(duì)各組細(xì)胞Caski侵襲能力變化的影響（結(jié)晶紫染色，×200）Figure 2 Effects of different concentrations of matrine on Caski invasiveability in each group（crystal violet staining，×200）

圖3 苦參堿對(duì)各組細(xì)胞遷移能力變化的影響（結(jié)晶紫染色，×200）Figure 3 Effects of matrine on the changes of cell migration in each group（crystal violet staining，×200）

表1 各組細(xì)胞上清培養(yǎng)液中MMP?9、VEGF含量變化Table 1 Changes of MMP?9 and VEGF in supernatant medium of each group （）

表1 各組細(xì)胞上清培養(yǎng)液中MMP?9、VEGF含量變化Table 1 Changes of MMP?9 and VEGF in supernatant medium of each group （）

與空白組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3。

2.6 苦參堿對(duì)Caski細(xì)胞β?catenin蛋白及其磷酸化的影響

隨著苦參堿處理濃度的逐步升高，Caski細(xì)胞內(nèi)β?catenin 蛋白含量逐漸減少，p?β?catenin（phospho S37）蛋白含量逐漸增多，且與空白組相比，0.4、0.8 g/L處理組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖5）。

3 討論

圖4 各組細(xì)胞GSK?3β、Wnt2B mRNA表達(dá)量變化Figure 4 Changes of mRNA expression levels of GSK?3β and Wnt2B in each group

圖5 各組細(xì)胞β?catenin、p?β?catenin蛋白變化Figure 5 Changes of β?catenin and p?β?catenin in each group

大量研究表明苦參堿具有顯著的抗癌作用，其可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻止血管生成、侵襲、遷移，且其不良反應(yīng)?。?6］，目前，苦參堿在肝癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤中的作用已有大量研究，表現(xiàn)出良好的抗癌作用［17-19］。但苦參堿對(duì)宮頸癌抗癌作用的研究報(bào)道較少，本研究選取人宮頸癌細(xì)胞系Caski 細(xì)胞為對(duì)象進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的升高，苦參堿對(duì)Caski 細(xì)胞的增殖抑制作用顯著升高，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在相同濃度下隨著時(shí)間的增加，苦參堿對(duì)Caski細(xì)胞的增殖抑制作用顯著升高，提示苦參堿對(duì)Caski細(xì)胞的增殖抑制作用也具有劑量、時(shí)間依賴性。

腫瘤發(fā)生侵襲遷移是惡化的標(biāo)志，抑制腫瘤的侵襲遷移可以有效降低病死率［20］。本研究發(fā)現(xiàn)苦參堿可有效抑制Caski 細(xì)胞的侵襲遷移，并表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β?catenin 通路與多種腫瘤的侵襲遷移相關(guān)，該通路可影響腫瘤胞外基質(zhì)的降解、血管生成以及細(xì)胞遷移黏附，本研究發(fā)現(xiàn)苦參堿可以抑制Caski 細(xì)胞分泌MMP?9、VEGF，MMP?9 具有降解胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞侵襲的作用。VEGF 通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞的遷移提供通道［21-22］，大量研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶家族（matrix metalloproteinase，MMP）作為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的促進(jìn)因子與Wnt/β?catenin 信號(hào)通路密切相關(guān)［23-24］。MMP 作為Wnt 信號(hào)通路下游的直接靶點(diǎn)，β?catenin與膜型基質(zhì)金屬酶?1（membrane type 1 matrix metal?loproteinases，MT1?MMP）的共同作用可促進(jìn)細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移［25］，Zhang 等［26］發(fā)現(xiàn)VEGF 啟動(dòng)子上游具有Wnt 信號(hào)通路調(diào)節(jié)序列，Wnt 信號(hào)通路可明顯上調(diào)VEGF 的表達(dá)，故本研究推測(cè)苦參堿抑制Caski 細(xì)胞侵襲遷移通過(guò)抑制經(jīng)典的Wnt/β?catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。Wnt2B 是Wnt 信號(hào)通路的胞外信號(hào)，與Wnt受體結(jié)合后可激活該通路，本研究發(fā)現(xiàn)苦參堿可抑制Caski 細(xì)胞Wnt2B mRNA 的表達(dá)，因此，苦參堿可能首先通過(guò)抑制Wnt2B 分泌使Caski 細(xì)胞Wnt信號(hào)通路整體處于低活性狀態(tài)。研究顯示W(wǎng)nt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)關(guān)鍵在于β?catenin 的穩(wěn)定，當(dāng)β?catenin 水平低下時(shí)，Wnt 通路關(guān)閉，反之，Wnt 通路開啟［27］；而維持β?catenin 穩(wěn)定的關(guān)鍵蛋白是GSK?3β，在沒有Wnt 信號(hào)刺激的情況下，胞質(zhì)內(nèi)的GSK?3β能與其他蛋白例如結(jié)腸腺瘤性息肉?。╝denoma?tous polyposis coli，APC）蛋白、軸蛋白（axin）等以復(fù)合物的形式磷酸化β?catenin氨基末端Ser/Thr位點(diǎn)，使β?catenin 泛素化降解，維持細(xì)胞內(nèi)β?catenin 的低水平狀態(tài)。β?catenin 處于低水平狀態(tài)，Wnt 通路關(guān)閉。在有Wnt 信號(hào)刺激的情況下，由細(xì)胞分泌的Wnt2B 蛋白與細(xì)胞表面受體卷曲同源物（frizzled，F(xiàn)ZD）和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（low density lipoprotein receptor related protein，LRP5/6）結(jié)合后，即觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：細(xì)胞內(nèi)蛋白散亂蛋白（dishevelled，Dsh）被活化，繼而活化的Dsh 與Axin及Frat1 相結(jié)合，后兩者與GSK?3β和APC 形成復(fù)合物，T 細(xì)胞淋巴瘤的原癌 基 因1（frequently rear?ranged in advanced T cell lymphomas?1，F(xiàn)RAT1）介導(dǎo)GSK?3β從Axin上脫離，不能磷酸化β?catenin。本研究發(fā)現(xiàn)苦參堿可誘導(dǎo)Caski 細(xì)胞內(nèi)GSK?3β mRNA的表達(dá)，與空白對(duì)照組相比，隨著苦參堿濃度的升高，藥物處理組GSK?3β mRNA 表達(dá)越來(lái)越多。隨著Caski 細(xì)胞內(nèi)GSK?3β表達(dá)量的增多，其與更多的β?catenin結(jié)合，打破胞內(nèi)β?catenin磷酸化平衡反應(yīng)，使更多β?catenin 磷酸化降解，正如本研究所顯示隨著苦參堿處理濃度的增高，Caski細(xì)胞內(nèi)β?catenin含量減少，p?β?catenin 含量增多。大量β?catenin 被苦參堿誘導(dǎo)降解，導(dǎo)致β?catenin 在細(xì)胞內(nèi)積累受阻，抑制β?catenin 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子TCF 相結(jié)合，在其他因子的輔助下協(xié)同激活靶基因如VEGF、MMP等侵襲遷移相關(guān)因子的表達(dá)。

綜上，苦參堿可通過(guò)抑制Caski 細(xì)胞Wnt/β?catenin 通路中Wnt2B mRNA 表達(dá)以及β?catenin 蛋白含量，降低Caski細(xì)胞MMP?9、VEGF的分泌，進(jìn)而抑制Caski細(xì)胞的侵襲遷移。