Urantide對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠脂肪肝組織中STAT3磷酸化的影響

崔海鵬，林映雪，王怡寧，王 途，李 英，趙 娟*

1承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000；2承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河北 承德 067000

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種血脂異常及血管壁成分改變的慢性炎癥病變［1］，其脂質(zhì)代謝紊亂累及肝臟造成脂肪變性，近年來廣受關(guān)注［2］。尾加壓素Ⅱ（urotensin Ⅱ，UⅡ）是由11 個(gè)氨基酸殘基組成的生長抑素樣神經(jīng)環(huán)肽，參與調(diào)節(jié)心血管、免疫、消化、泌尿等系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展［3］。UⅡ主要通過與其特異性G蛋白偶聯(lián)受體UT結(jié)合構(gòu)成UⅡ/UT系統(tǒng)在多器官中發(fā)揮生物學(xué)作用［4］。有研究已證實(shí)，UⅡ/UT系統(tǒng)與肝內(nèi)炎癥損傷存在密切聯(lián)系［5-6］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，UⅡ/UT系統(tǒng)可通過C反應(yīng)蛋白（C?reactive protein，CRP）、單核趨化蛋白?1（mono?cyte chemotactic protein?1，MCP?1）以及白細(xì)胞介素6（interleukin?6，IL?6）參與AS大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生［7-8］，同時(shí)誘導(dǎo)AS大鼠肝損傷，發(fā)生脂肪變性［9］，其具體調(diào)控機(jī)制尚有待闡明。近年研究發(fā)現(xiàn)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）可介導(dǎo)機(jī)體的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖誘導(dǎo)AS 的發(fā)生［10］。此外，STAT3 信號(hào)通路在非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［11-12］。為進(jìn)一步探究AS大鼠脂肪肝中UⅡ/UT系統(tǒng)與STAT3之間的關(guān)系，本研究采用UⅡ受體拮抗劑Urantide阻斷UⅡ/UT信號(hào)通路，觀察了AS大鼠肝臟中STAT3的表達(dá)水平，初步探討了UⅡ/UT系統(tǒng)對(duì)STAT3的作用機(jī)制，借以深入闡明UⅡ/UT系統(tǒng)對(duì)AS大鼠造成肝脂肪變性的反應(yīng)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

3 周齡雄性SPF 級(jí)Wistar 大鼠30 只，體重180～200 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（京）?2016?0011。Urantide（蘇州強(qiáng)耀生物公司）；維生素D3（VD3，哈爾濱市華晟科技動(dòng)物藥品廠）；膽固醇、膽酸鈉（Sigma公司，美國）；丙硫氧嘧啶片（上海朝暉藥業(yè)有限公司）；兔抗大鼠p?STAT3抗體（CST公司，美國）；兔抗大鼠β?actin 抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（Bioworld公司，美國）；TRIzol裂解液、RIPA蛋白裂解液、Brad?ford 組織蛋白濃度測(cè)定試劑盒、超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；TIAN?Script cDNA 第一鏈合成試劑盒、SuperReal PreMix SYBR Green 試劑盒、DAPI 染液、FITC 標(biāo)記二抗（北京天根生化科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

30 只雄性Wistar 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周［恒定溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（50±10）%，正常攝食及飲水］，按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分成3組（每組10只）：正常組、AS 組、Urantide 組。根據(jù)參考文獻(xiàn)方法制備AS 大鼠模型［13］：AS 組、Urantide 組飼以特制高脂飼料（基礎(chǔ)飼料80.8%，膽固醇3.5%，膽酸鈉0.5%，丙硫氧嘧啶0.2%，豬油10%，白糖5%），并連續(xù)3 d 給予每只大鼠腹腔注射VD3150 μg/（kg·d）。于第4周，隨機(jī)選取1只模型大鼠，進(jìn)行血脂指標(biāo)檢測(cè)及病理學(xué)檢測(cè)，以判斷造模是否成功。模型復(fù)制成功后，Uran?tide 組尾靜脈注射Urantide 30 μg/（kg·d），正常組和AS 組尾靜脈注射等體積生理鹽水，連續(xù)給藥2 周。大鼠禁食12 h后取材。分別稱取體重及肝重，計(jì)算肝系數(shù)（肝系數(shù)=肝重/體重×100%）。胸主動(dòng)脈取血，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）的含量。本研究所有大鼠實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)“3R”原則，按照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》（GB/T 27416?2014）執(zhí)行。

1.2.2 HE染色法

將大鼠胸主動(dòng)脈、肝組織于4%多聚甲醛固定后經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋后制備石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察各組大鼠的病理學(xué)變化。

1.2.3 RT?qPCR檢測(cè)

TRIzol 法提取肝組織總RNA，紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量，TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA，SuperReal PreMix SYBR Green 試劑盒分別檢測(cè)STAT3、β?actin mRNA的CT值，基因檢測(cè)引物序列見表1，擴(kuò)增條件：94 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃34 s，40 個(gè)循環(huán)；做熔解曲線。以STAT3 CT值與β?actinmRNA CT值的 差 值為ΔCT，采用2-ΔCT法計(jì)算各組mRNA的相對(duì)表達(dá)量。以上操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

表1 RT?qPCR的引物序列Table 1 The sequences of the primers for RT?qPCR

1.2.4 免疫印跡檢測(cè)

采用RIPA 裂解液及勻漿儀提取肝組織的總蛋白，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白含量。45 μg蛋白上樣于SDS?PAGE分離、轉(zhuǎn)膜和5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，一抗p?STAT3（1∶800）、STAT3（1∶1 000）、β?actin（1∶10 000）于4 ℃搖床孵育過夜；洗膜后，加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，洗膜后用超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。Image J 軟件測(cè)定蛋白條帶灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 組織免疫熒光法檢測(cè)

取制備好的肝組織石蠟切片樣本，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，抗原修復(fù)，10%山羊血清封閉，一抗p?STAT3（1∶1 000）4 ℃孵育過夜；洗片后，暗室中滴加FITC 標(biāo)記二抗（1∶1 000），37 ℃孵育1 h，棄去二抗，加入DAPI 染液，孵育45 min，洗片，防熒光淬滅劑封片后于熒光顯微鏡下觀察。每組選3張飛片，每張飛片選取3 個(gè)不同視野進(jìn)行拍照。Image?Pro Plus 6.0軟件計(jì)算免疫熒光陽性細(xì)胞的平均光密度值，取平均值作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，均符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠胸主動(dòng)脈及肝組織病理特征

如圖1 所示，正常組胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，中膜彈力纖維層結(jié)構(gòu)完整清晰，血管平滑肌細(xì)胞整齊排列，內(nèi)膜、中膜、外膜分界清晰完整；AS 組血管內(nèi)皮細(xì)胞顯著損傷，出現(xiàn)鈣化，中膜彈力纖維斷裂，呈現(xiàn)典型的AS 病理特征；Urantide 組血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷恢復(fù)明顯，鈣化顯著消失，中膜平滑肌細(xì)胞及彈力纖維恢復(fù)尚可。相應(yīng)地，正常組肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)，正常肝索排列均勻規(guī)則；AS組肝細(xì)胞明顯腫脹變形，肝索排列紊亂，肝小葉界限不清晰，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量空泡樣脂滴，部分細(xì)胞核偏向細(xì)胞一側(cè)，為典型的肝細(xì)胞脂肪變性；Urantide組肝細(xì)胞形態(tài)明顯恢復(fù)正常，肝索排列尚可，肝小葉結(jié)構(gòu)形態(tài)基本趨于正常組。這提示VD3聯(lián)合特制高脂飼料可以成功誘導(dǎo)大鼠AS 和脂肪肝發(fā)生，而且Urantide可有效減輕AS病變及肝脂肪變性。

2.2 大鼠肝系數(shù)和ALT、AST水平

如圖2 所示，與正常組相比，AS 組大鼠肝系數(shù)顯著升高（P＜0.05）；Urantide組大鼠肝系數(shù)較AS組顯著降低（P＜0.05），較正常組顯著升高（P＜0.05）。相應(yīng)的，與正常組相比，AS 組大鼠血清中ALT、AST水平顯著升高（P＜0.05），Urantide 組血清中ALT、AST較AS組顯著降低（P＜0.05），較正常組無顯著差異（P＞0.05）。這提示AS組大鼠肝臟發(fā)生了嚴(yán)重的肝實(shí)質(zhì)性損傷和炎癥反應(yīng)，而Urantide 可有效保護(hù)肝臟。

圖1 各組大鼠胸主動(dòng)脈及肝組織病理變化（HE染色，×400，標(biāo)尺=20 μm）Figure 1 Morphological characters of thoracic aorta and liver tissues in rats of each group（HE staining，×400，scale bar=20 μm）

2.3 大鼠肝組織中STAT3 mRNA的表達(dá)水平

如圖3所示，RT?qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，各組間大鼠肝組織中STAT3 mRNA 的表達(dá)水平無顯著變化（P＞0.05，n=3）。提示VD3聯(lián)合特制高脂飼料處理以及Urantide對(duì)大鼠肝組織中STAT3的轉(zhuǎn)錄水平均沒有影響。

2.4 大鼠肝組織中STAT3、p?STAT3蛋白表達(dá)水平

圖2 各組大鼠肝系數(shù)和ALT、AST水平Figure 2 Liver index and the levels of ALT，AST in rats of each group

圖3 各組大鼠肝組織中STAT3 mRNA表達(dá)水平Figure 3 The levels of STAT3 mRNA expression in rat liver tissue of each group

如圖4所示，免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組相比，AS組大鼠肝組織中p?STAT3蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），STAT3 蛋白表達(dá)無顯著差異（P＞0.05）；與AS 組相比，Urantide 組大鼠肝組織p?STAT3蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），STAT3蛋白表達(dá)無顯著變化（P＞0.05）。這提示VD3聯(lián)合特制高脂飼料處理可顯著活化大鼠肝組織中p?STAT3的表達(dá)，Urantide 可抑制p?STAT3 的表達(dá)水平，而對(duì)大鼠肝組織中STAT3的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有影響。

2.5 免疫熒光檢測(cè)大鼠肝細(xì)胞中p?STAT3 的表達(dá)水平

如圖5所示，免疫熒光結(jié)果顯示，與正常組大鼠肝細(xì)胞中p?STAT3陽性染色熒光強(qiáng)度（5.06±1.01）相比，AS組熒光強(qiáng)度（1 504.78±241.19）顯著增加（P＜0.05）。與AS 組相比，Urantide 組熒光強(qiáng)度（159.90±22.69）顯著降低（P＜0.05）。

3 討論

圖4 各組大鼠肝組織中p?STAT3、STAT3水平Figure 4 The levels of p?STAT3 and STAT3 in rat liver tissue of each group

圖5 各組大鼠肝細(xì)胞中p?STAT3水平（×400，標(biāo)尺=20 μm）Figure 5 The levels of p?STAT3 in rat hepatocytes of each group（×400，scale bar=20 μm）

肝臟被視為脂質(zhì)代謝的重要場(chǎng)所，不但其病變導(dǎo)致的脂質(zhì)代謝紊亂是脂肪肝的發(fā)病基礎(chǔ)，而且其誘導(dǎo)的高脂蛋白血癥是AS 發(fā)生的最基本的危險(xiǎn)因素［14］。隨著生活水平的不斷提高，高脂飲食逐漸成為危害人類健康的關(guān)鍵因素，近年來非酒精性脂肪肝的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)［15］。本課題組在前期體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)，用高脂飲食聯(lián)合注射VD3的方法復(fù)制的AS 大鼠不但發(fā)生典型的AS 病變，而且均伴有明顯的脂肪肝［9］；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AS 大鼠血清中ALT、AST 水平顯著升高，提示AS 大鼠肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重的肝功能障礙及急性炎癥損傷反應(yīng)；與此同時(shí)肝內(nèi)UⅡ/UT系統(tǒng)被激活，采用UⅡ受體拮抗劑Ura?ntide 對(duì)AS 大鼠進(jìn)行治療后，肝內(nèi)UⅡ/UT 表達(dá)水平被顯著抑制，同時(shí)肝臟肝功能明顯恢復(fù)［16-17］。有研究表明，UⅡ/UT系統(tǒng)可誘導(dǎo)小鼠肝臟“內(nèi)皮炎癥”，在急性肝衰竭中發(fā)揮關(guān)鍵作用［18］。這提示，UⅡ/UT系統(tǒng)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能介導(dǎo)了AS 大鼠脂肪肝的發(fā)生，其在肝臟中激活可能是肝臟損傷的主導(dǎo)因素。

本研究發(fā)現(xiàn)，AS大鼠脂肪肝組織中STAT3的基因和蛋白的表達(dá)水平較正常大鼠均無顯著變化，而p?STAT3蛋白表達(dá)顯著升高。STAT3是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族成員，可被受體相關(guān)激酶磷酸化，然后形成同源二聚體或異源二聚體易位入核，作為轉(zhuǎn)錄激活因子介導(dǎo)多種基因的表達(dá)。STAT3參與調(diào)節(jié)多器官的病理生理過程，在細(xì)胞增殖、血管生成、癌癥、脂質(zhì)合成、細(xì)胞免疫等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［19］。大量研究發(fā)現(xiàn)，STAT3 信號(hào)通路可引起組織細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)AS［10，20-21］、非酒精性脂肪肝［11-12］等疾病的發(fā)生，其蛋白及磷酸化水平表達(dá)升高。由此，筆者推測(cè)AS 大鼠肝組織中p?STAT3蛋白表達(dá)水平升高可能與肝組織炎癥反應(yīng)相關(guān)，UⅡ/UT系統(tǒng)可能通過激活STAT3信號(hào)蛋白促進(jìn)炎癥因子表達(dá)誘導(dǎo)脂肪肝的發(fā)生發(fā)展。

為驗(yàn)證以上推論，本研究采用Urantide 阻斷UⅡ/UT系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Urantide顯著抑制了p?STAT3 的表達(dá)水平，而對(duì)STAT3 的基因表達(dá)和蛋白穩(wěn)定性沒有顯著影響。這提示AS 大鼠肝內(nèi)STAT3信號(hào)通路經(jīng)UⅡ/UT系統(tǒng)活化，誘導(dǎo)肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng)損傷肝細(xì)胞，促進(jìn)脂肪肝的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)Uran?tide 可通過抑制STAT3 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，使大鼠肝臟的脂質(zhì)代謝功能得以恢復(fù)，進(jìn)而延緩脂肪肝的進(jìn)一步發(fā)展。進(jìn)一步的免疫熒光實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一推論，Urantide可顯著降低大鼠肝細(xì)胞中p?STAT3水平，抑制STAT3的活化水平。

綜上所述，UⅡ受體拮抗劑Urantide可通過抑制STAT3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減輕肝細(xì)胞的損傷，進(jìn)而緩解AS大鼠的肝脂肪變性。而炎癥反應(yīng)中UⅡ/UT系統(tǒng)激活STAT3 信號(hào)通路的具體分子作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究?？傊?，本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，Uran?tide在治療AS的同時(shí)，還可通過阻斷STAT3這一信號(hào)途徑來治療脂肪肝。