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    microRNA?449a通過調控MDM4抑制神經母細胞瘤生長

    2021-02-26 09:29:56張向寧張愛輝侯崇智

    程 濤,張 生,姚 遠,張向寧,張愛輝,侯崇智

    西安市兒童醫(yī)院普外一科,陜西 西安 710002

    神經母細胞瘤是兒童最常見的實體腫瘤。由于現有針對神經母細胞瘤的治療方法對于高風險神經母細胞瘤患者的治愈率只有30%。因此,高風險的神經母細胞瘤是兒童主要的腫瘤相關致死原因[1-3]。神經母細胞瘤起源于神經嵴,通常易發(fā)于腎上腺髓質或椎旁神經結,以頸部、胸部、腹部和骨盆腫塊為特征。然而,神經母細胞瘤的臨床表現高度不一致,可僅表現為腫塊而無癥狀,也可由于局部浸潤或廣泛轉移而造成不良預后[4]。因此,對神經母細胞瘤病理發(fā)生和分子機制的進一步研究可以幫助我們發(fā)現新的治療策略從而有效控制神經母細胞瘤。

    microRNA(miRNA)是內源表達的小型非編碼RNA,大量研究表明miRNA 在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用[5-6]。miR?449a 在許多腫瘤中發(fā)揮腫瘤抑制因子的功能,包括視網膜母細胞瘤、肺癌、前列腺癌等[7-9]。近期,有文獻報道m(xù)iR?449a 可以通過誘導細胞分化和細胞周期阻滯進而抑制神經母細胞瘤[10]。但是miR?449a 在神經母細胞瘤中是否存在其他作用機制仍不清楚。

    MDM2 和MDM4 含有相似的蛋白結構,都包含1 個鋅指結構域、1個與p53 N 端相連的N端結構域以及C 端的RING(really interesting new gene)結構域。MDM2 和MDM4 均被報道對p53 發(fā)揮抑制作用。MDM2 的作用機制已被廣泛研究,主要是通過與p53直接結合抑制其轉錄因子活性及促進p53的泛素化降解。MDM4主要是通過調節(jié)p53的活性發(fā)揮作用,協同MDM2發(fā)揮其泛素蛋白酶活性[11]。文獻報道MDM4在早期胚胎發(fā)育過程中可以負向調控由p53 誘導的細胞周期阻滯和神經細胞凋亡[12],然而MDM4在神經母細胞瘤的作用機制仍有待探索。本研究分析了miR?449a 對神經母細胞瘤細胞凋亡的影響,并評價了miR?449a 對腫瘤細胞生長、細胞凋亡和相關基因表達的調控。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    人神經母細胞瘤細胞株BE(2)?C購于中國科學院上海生命科學研究所。DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco 公司,美國);青霉素和胰酶、BeyoRTTM2 cD?NA 第一鏈合成試劑盒、PMSF、BCA 蛋白定量試劑盒、CCK?8 試劑盒、Annexin V?FITC 細胞凋亡試劑盒、考馬斯亮藍染色液(上海碧云天公司);miR?449a模擬物、抑制物和p53干擾質粒(上海吉瑪生物有限公司)。TRIzol 試劑(Invitrogen 公司,美國);SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa 公司,日本);熒光素酶活性檢測試劑盒(Promega 公司,美國);所有抗體均購自美國Abcam公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng)

    人神經母細胞瘤細胞株BE(2)?C 培養(yǎng)基為DMEM加10%胎牛血清,1%青霉素和胰酶。細胞置于含5%CO2培養(yǎng)箱,37 ℃培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)液每2 d更換1次。所有實驗都采用對數生長期細胞進行。

    1.2.2 實時熒光定量PCR(qPCR)

    用TRIzol 試劑提取總RNA 并使用廣譜分析儀確定RNA 質量,隨后使用cDNA 第一鏈合成試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA,采用SYBR Green PCR Mas?ter Mix 和應用生物系統7500 實時PCR 系統進行定量聚合酶鏈反應,PCR 引物通過Premier3.0 軟件進行設計并通過上海生工合成。引物序列為:MDM4,上游5′?AGGTCCAGCCTAGATGTTTC?3′,下游5′?AGGTCCAGCCTAGATGTTTC?3′;β?actin,上游5′?CCTGGCACCCAGCACAAT?3′,下游5′?GGGCCG?GACTCGTCATAC?3′。反應條件為:95 ℃10 min;95 ℃,15 s;60 ℃,45 s,40個循環(huán);95 ℃,15 s;60 ℃,1 min;95 ℃,15 s;60 ℃,15 s?;蛳鄬Ρ磉_水平根據公式2-ΔCT進行計算。

    1.2.3 CCK?8試驗

    于實驗前日接種細胞3 000 個/孔(對照組和轉染miR?449a模擬物組)于96孔培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜(37 ℃、5%CO2)。培養(yǎng)次日,去除培養(yǎng)液并向培養(yǎng)板中加入100 μL CCK?8檢測溶液(包含90 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK?8),培養(yǎng)1 h。隨后測定450 nm處吸光度值。

    1.2.4 克隆形成試驗

    接種3 000 個處理后的細胞(對照組和轉染miR?449a 模擬物組)于6 孔培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板放入37 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3周,每3 d更換1次培養(yǎng)液。3周后將培養(yǎng)液吸出加入4%多聚甲醛固定15 min。然后去除固定液,加適量考馬斯亮藍染液染色20 min,然后用流水緩慢洗去染色液,空氣干燥后拍照、計數。

    1.2.5 熒光素酶活性分析

    根據預測結果,分別將野生型和突變型MDM4基因的3′UTR區(qū)域克隆到pGL3載體中,并將載體和miR449a的模擬物一同轉染至BE(2)?C細胞中。熒光素酶活性檢測利用熒光素酶活性檢測試劑盒來完成。轉染48 h 后,吸取培養(yǎng)液,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2 次。6 孔板每孔加入260 μL 裂解液并用刮子將細胞收集到1.5 mL 離心管中,12 000 r/min,4 ℃離心15 min后收集上清。將100 μL細胞裂解液加到96孔板中,然后每孔加入100 μL底物,迅速混勻后在發(fā)光儀上讀取數值。

    1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

    將處理后的細胞(對照組、轉染MDM4 過表達質粒組、轉染miR?449a 模擬物組、同時轉染MDM4過表達質粒和miR?449a模擬物組)用不含EDTA 的胰酶消化收集后,室溫條件下,2 000 r/min 離心5~10 min,收集細胞。用預冷1×PBS(4 ℃)重懸細胞1 次,2 000 r/min 離心5~10 min,洗滌細胞;加入300 μL 的1×Binding Buffer 懸浮細胞;加入5 μL Annexin V?FITC混勻后,避光,室溫孵育15 min;上機前5 min 再加入5 μL PI 染色;上機前,補加200 μL 1×Binding Buffer。流式細胞儀檢測。

    1.2.7 免疫印跡實驗

    總細胞蛋白通過標準流程提取和定量。BE(2)?C細胞加入添加了蛋白酶抑制劑和PMSF 的RIPA 試劑,置于冰上30 min,13 000g4 ℃離心15 min 后收集上清。采用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。取等量蛋白加入SDS?PAGE 膠并將樣品轉移至PVDF 膜上。將膜置于5%脫脂奶粉溶液于室溫孵育2 h。隨后4 ℃孵育一抗MDM4(1∶1 000)、MDM2(1∶1 000)、p53(1∶1 000)、cleaved PARP(1∶2 000)、GAPDH(1∶1 000)過夜。

    1.3 統計學方法

    采用SPSS10.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差()表示,兩組比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

    2 結果

    2.1 miR?449a 過表達抑制BE(2)?C 細胞增殖和克隆形成

    將miR?449a模擬物轉染到BE(2)?C細胞中,轉染48 h后收取細胞qPCR檢測miR?449a表達量。由圖1A可見,轉染miR?449a模擬物后,miR?449a表達量顯著升高,說明miR?449a模擬物達到了過表達miR?449a的目的。隨后發(fā)現過表達miR?449a會顯著抑制BE(2)?C細胞增殖(圖1B),降低細胞克隆形成能力,對照組克隆數目為(684±25)個,而轉染miR?449a模擬物組克隆數目為(114±23)個(圖1C、D)。

    2.2 MDM4是miR?449a的靶基因

    圖1 miR?449a過表達抑制BE(2)?C細胞增殖和克隆形成Figure 1 miR?449a overexpression inhibits cell proliferation and colony formation in BE(2)?C cell line

    為了研究miR?449a的作用機制,運用在線數據庫miRDB 預測miR?449a 的靶基因。結果發(fā)現在評分為100 的預測靶基因中,存在1 個p53 調節(jié)基因MDM4。于是運用熒光素酶表達系統驗證MDM4是否為miR?449a 的靶基因。如圖2A 和2B 所示,將包含2個預測位點的MDM4野生型(MDM4?WT)3′UTR區(qū)域克隆到熒光素酶報告質粒pGL3 中,并同時構建針對2 個位點的突變型(MDM4?mut1、MDM4?mut2、MDM4?mut1?2)質粒。熒光素酶結果顯示,與空載組相比,miR?449a 過表達顯著降低轉染了MDM4野生型和突變型質粒組的熒光素酶活性。另外,與轉染MDM4野生型質粒組相比,轉染MDM4突變質粒后熒光素酶活性顯著升高(圖2C)。接下來將miR?449a 的模擬物轉染到細胞中,檢測MDM4 mRNA 和蛋白水平的變化。結果顯示,轉染miR?449a 后MDM4 的表達水平均降低(圖2D、E)。因此可以得出結論,MDM4是miR?449a的1個靶基因。

    2.3 干擾MDM4 表達可以顯著降低BE(2)?C 細胞增殖和克隆形成能力

    為了研究miR?449a 的靶基因MDM4 對于神經母細胞瘤的作用,從而進一步闡明miR?449a的作用機制,本研究合成MDM4 的siRNA 并將siMDM4 和miR?449a模擬物分別或同時轉染BE(2)?C細胞。

    通過CCK?8法檢測了細胞24、48及72 h的增殖情況。如圖3A所示,siMDM4和miR?449a模擬物均可顯著抑制BE(2)?C細胞增殖,并且siMDM4和miR?449a模擬物對于BE(2)?C細胞增殖抑制效果近似,同時轉染miR?449a 和siMDM4 沒有表現出疊加效應。該結果進一步表明,miR?449a 通過調控MDM4從而抑制BE(2)?C細胞增殖。

    圖2 MDM4是miR?449a的靶基因Figure 2 MDM4 is a target gene of miR?449a

    克隆形成試驗結果顯示,siMDM4 和miR?449a模擬物均可顯著抑制BE(2)?C 細胞克隆形成,并且siMDM4 和miR?449a 模擬物抑制效果近似;同時轉染miR?449a和siMDM4組克隆形成能力與分別轉染siMDM4 或miR?449a 模擬物沒有顯著差別(圖3B、C)。上述結果表明,miR?449a通過調控MDM4從而抑制BE(2)?C細胞增殖和克隆形成。

    2.4 過表達MDM4 可以抵消由轉染miR?449a 模擬物所引起的細胞凋亡和p53蛋白量的增加

    圖3 干擾MDM4表達抑制腫瘤細胞增殖和克隆形成Figure 3 Silencing of MDM4 inhibits cell proliferation and colony formation in BE(2)?C cell line

    為了進一步驗證上述結論,單獨或共同轉染miR?449a模擬物和MDM4過表達質粒后,觀察細胞增殖能力的變化。結果顯示,與對照組相比,單獨轉染MDM4過表達質粒會增加細胞增殖能力,單獨轉染miR?449a可以降低細胞增殖能力,但是同時轉染miR?449a 和MDM4 會對由轉染miR?449a 導致的細胞增殖能力的降低起到一定的恢復作用(圖4A)。此外,在轉染miR?449a 模擬物的細胞中高表達MDM4 可以抵消由轉染miR?449a 導致的細胞凋亡增加(細胞凋亡率為:對照組2.63%±1.02%,MDM4 組1.70%±0.50%,miR?449a 組36.10%±1.68%,MDM4+miR?449a 組6.13%±0.90%)以及p53蛋白水平的上升(圖4B~D)。

    接下來檢測了p53 的mRNA 水平的變化,并且觀察到單獨轉染miR?449a并不影響p53 mRNA水平(圖4E)。該結果提示miR?449a 應該是通過調控MDM4進而對p53的蛋白水平進行調控。如圖4F所示,過表達MDM4可以降低p53蛋白水平,但是蛋白酶體抑制劑MG132 處理可以部分阻止p53 的降解。因此我們認為MDM4 通過調控p53蛋白的穩(wěn)定性而非mRNA水平發(fā)揮作用。

    2.5 miR?449a 通過調控MDM4 穩(wěn)定p53 蛋白水平從而促進細胞凋亡

    圖4 過表達MDM4可以抵消由轉染miR?449a所引起的細胞凋亡和p53蛋白量的增加Figure 4 Overexpression MDM4 blocks the increase of cell apoptosis and the protein level of p53 induced by miR?449a transfection

    為了進一步闡明miR?449a 抑制神經母細胞瘤增殖的分子機制,我們將miR?449a 模擬物轉染BE(2)?C 細胞并通過流式細胞術檢測細胞凋亡情況,通過免疫印跡法檢測凋亡相關指標的變化。如圖5A、B 所示,miR?449a 顯著增加BE(2)?C 細胞凋亡,凋亡率由(3.00±1.32)%增加至(38.20±2.78)%。miR?449a 顯著下調MDM4 蛋白水平并上調p53 蛋白水平。p53上調導致細胞凋亡分子cleaved PARP 上調(圖5C)。為了進一步證明p53在此中的作用,我們構建p53 低表達的穩(wěn)定細胞株[shp53 BE(2)?C]并用此細胞株進行上述實驗,結果證明在shp53 BE(2)?C 細胞中miR?449a 不能促進細胞凋亡,凋亡率由(3.33±1.20)%增加至(4.26±0.55)%,差異無統計學意義。此外發(fā)現miR?449a 并不能影響MDM2 的蛋白水平。因此,miR?449a可能通過調控MDM4穩(wěn)定p53蛋白水平從而促進細胞凋亡。

    3 討論

    已有研究表明,miR?449a作為腫瘤抑制子在多種腫瘤中阻止腫瘤細胞的細胞周期,包括肺癌、前列腺癌、胃癌及視網膜母細胞瘤[7-8,13-14]。除了對腫瘤細胞細胞周期的調控,miR?449a也可通過其他機制對腫瘤細胞進行調控,如抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡。本研究結果表明,在神經母細胞瘤中miR?449a 也可通過引起細胞凋亡和降低細胞增殖發(fā)揮腫瘤抑制作用。

    圖5 miR?449a抑制MDM4并促進p53蛋白穩(wěn)定Figure 5 miR?449a inhibits the level of MDM4 and promotes stability of p53

    本文主要研究了miR?449a 靶基因其中之一的MDM4。首先通過經典的miRNA 靶基因預測方法預測miR?449a 潛在靶基因。該方法基于種子區(qū)域(通常位于miRNA 5′端的6~8個核苷酸)與mRNA 3′UTR 靶向區(qū)的相互作用[15]。進而我們通過熒光素酶實驗證明MDM4 確實為miR?449a 的1 個靶基因。據報道,MDM4 是p53 的負調控因子,但是由于MDM4 沒有泛素酶活性,需要與MDM2 結合形成2聚體,進而促進MDM2 對p53 泛素化[16]。另外在多種腫瘤中均發(fā)現了MDM4的過表達。MDM4可以通過抑制p53的轉錄活性進而導致細胞周期阻滯以及細胞凋亡的產生[17]。本研究發(fā)現miR?449a 可以促進細胞凋亡和p53 的表達,但是在高表達MDM4 的細胞中這種效應得到了中和。另外,我們還發(fā)現miR?449a對MDM2的表達沒有影響,進而證明miR?449a 通過調控MDM4 穩(wěn)定p53 蛋白。然而,其他miR?449a 可能的靶基因可能同樣對于細胞增殖和細胞凋亡發(fā)揮重要作用,后續(xù)我們依然需要研究這些靶基因的作用從而完整地闡明miR?449a 在神經母細胞瘤中抑制腫瘤的機制。

    囿于資源局限性,無法在本研究中檢測miR?449a在神經母細胞瘤患者樣本中的內源表達水平,從而闡釋miR?449a 表達水平與腫瘤患者生存時間的關系。對于miR?449a 內源表達水平調控機制的研究將進一步促進神經母細胞瘤治療策略的發(fā)展。

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