RNA干擾Geminin基因表達對腦膠質瘤惡性生物學行為的影響

王 燕，田 薇，章建國，劉益飛，靳 欽

南通大學附屬醫(yī)院病理科，江蘇 南通 226001

膠質瘤是目前最常見的惡性原發(fā)性腦腫瘤［1］，盡管近年來針對膠質瘤的傳統(tǒng)治療方法取得了一定程度的進展，但患者的預后仍然不理想［2］。Gemi?nin作為一種小分子蛋白，在細胞周期調控中發(fā)揮關鍵作用，可高表達于多種惡性腫瘤，發(fā)揮調節(jié)腫瘤細胞增殖分化的作用［3］，但其在腦膠質瘤發(fā)生、發(fā)展中所扮演的角色以及具體的作用機制目前還不清楚。本研究旨在通過基因沉默技術利用siRNA敲除Geminin 在人膠質瘤細胞U251 中的表達，探究其對膠質瘤細胞凋亡、增殖、遷移和侵襲的影響，初步探索可能的發(fā)生機制，為明確其是否可以作為膠質瘤治療的新作用靶點提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2018—2019 年南通大學附屬醫(yī)院20 例患者（男12 例，女8 例；年齡27～74 歲，平均年齡51.5歲，中位年齡48 歲）術后新鮮腦膠質瘤組織和瘤旁正常腦組織的標本，所有參與實驗的患者術前均未接受任何放化療等抗腫瘤治療，其臨床病理資料和隨訪記錄均完整。本實驗經(jīng)南通大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準，知情同意書齊全，均由患者或其家屬簽署。人膠質瘤U251 細胞株購自中國科學院上海細胞研究所。胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司；LipofectamineTM2000 脂質體轉染試劑購自美國Invitrogen 公司；qRT?PCR 試劑盒購自美國Promega公司；Cell Counting Kit?8（CCK?8）試劑盒購自上海BestBio 公司；抗HBO1、Cdt1、GAPDH 抗體及二抗均購自美國Abcam 公司；siRNA 片段購自上海晶賽公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫及qRT?PCR分析Geminin在腦膠質瘤中的表達

為了獲得Geminin 在神經(jīng)膠質瘤中的表達模式，我們利用來自基因表達譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析（gene expression profilling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer?pku.cn/）的數(shù)據(jù)進行分析。另外使用qRT?PCR 方法檢測20 例人新鮮膠質瘤組織中Geminin 的表達情況，具體方法如下：TRIzol 提取膠質瘤組織中的總RNA，然后按逆轉錄試劑盒及qRT?PCR 試劑盒說明操作，Geminin 特異性引物序列：（上游）5′?AGAAAATGAGCTGTCCGCAGG?3′；（下游）5′?TACAGCGCCTTTCTCCGTTT?3′，產(chǎn)物大小213 bp；以GAPDH作為內(nèi)對照，其特異性引物序列：（上游）5′?GAAGGTCGGAGTCAACGGAT?3′；（下游）5′?TCCCGTTCTCAGCCATGTAGTT?3′，產(chǎn)物大小131 bp。PCR 擴增通過以下條件進行，95 ℃5 min，然后95 ℃30 s，60 ℃20 s，72 ℃30 s，40個循環(huán)。最終結果用2-ΔΔCt法進行計算。所有實驗獨立重復3次。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉染

人腦膠質瘤U251 細胞在37 ℃、5%CO2、95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中用含有10% FBS、鏈霉素（100 μg/mL）和青霉素（100 U/mL）的RPMI1640 細胞培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。后續(xù)的實驗研究取處于對數(shù)生長期的細胞。Geminin 特異性siRNA 序列為：（上游）5′?GGUCCUGAAGCCAAUGAAA?3′，（下游）5′?UUUCAUUGGUTTUAGGAUU?3′；陰性siRNA 序列為：（上游）5′?CGGCT?TCGCGGGCGACGGA?3′，（下游）5′?GAGGAGCTGGAAGCAGCCG?3′；后續(xù)實驗共設置有3 組：空白對照組（Control）、陰性對照組（si?NC）和干擾組（si?Geminin）。當U251細胞生長至融合度達約50%時，利用脂質體轉染法（參照說明書），將Geminin 特異性siRNA 序列及陰性序列分別轉染至U251細胞，然后用qPCR法檢測細胞轉染的效率。

1.2.3 CCK?8法檢測細胞增殖情況

siRNA 轉染24 h 后，將細胞消化，然后在96 孔板中以1×104個/孔的密度在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24 h通過CCK?8試劑盒測量細胞活性，每次檢測之前，將CCK?8 試劑加入板中后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h。最后測定450 nm波長下分析光密度，并繪制細胞增殖曲線。所有實驗獨立重復3次。

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞侵襲和遷移情況

利用Transwell 小室測定U251 細胞的侵襲與遷移能力。將熔融過夜的100 μL Matrigel 添加到24孔板的Transwell 小室上室中，均勻搖晃，并置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中4～6 h，以形成凝膠。然后將500 μL 無血清培養(yǎng)液加入到下室中，并且將底物膜水合30 min。將轉染后48 h的U251 細胞以1×105個/孔的密度轉接至涂有基質的Transwell 上室中，將500 μL 全培養(yǎng)液加入下腔室中，過夜后，移開小腔室，并用棉簽擦拭上腔室中剩余的細胞。PBS 清洗后，4%多聚甲醛固定30 min；0.1%的結晶紫染色20 min，PBS 清洗，在顯微鏡下隨機選擇5 個視野進行觀察和計數(shù)。遷移實驗類似，采用Transwell 腔室代替基質涂層腔室，進行細胞遷移能力測定。所有實驗獨立重復3次。

1.2.5 蛋白質印跡法檢測干擾后Geminin、HBO1、Cdt1的蛋白表達水平

轉染48 h后，分別收集3組細胞，按試劑盒說明操作，裂解細胞，提取蛋白質，測定蛋白濃度；然后將總蛋白20 μg 樣品加到12%分離凝膠上并轉膜；TBST洗滌5 min，室溫下5%脫脂奶粉溶液中封閉2 h；TBST洗滌后，4 ℃下孵抗Geminin（1∶200）、抗HBO1（1∶200）和抗Cdt1（1∶200）一抗過夜；TBST 洗滌后，室溫下將膜孵HRP 標記的二抗（1∶5 000）2 h。最后ECL顯色，LabWorks 灰度圖像分析軟件分析。所有實驗獨立重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 22.0和Graphpad 5.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。其中計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，實驗數(shù)據(jù)的兩組間比較行t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Geminin在膠質瘤組織的表達情況

從GEPIA 數(shù)據(jù)庫獲得的結果表明，無論是低級別膠質瘤還是膠質母細胞瘤組織中Geminin 的表達均明顯高于瘤旁正常腦組織（圖1A、B，P＜0.05）。同時本課題組利用qRT?PCR 實驗方法得出的結果顯示，20 例新鮮膠質瘤組織中Geminin mRNA 的表達（1.30±0.22）明顯高于瘤旁正常腦組織（0.88±0.19），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖1C）。

圖1 膠質瘤組織中Geminin的表達水平增高Figure 1 High expression of Geminin in glioma tissues

2.2 Geminin基因沉默

qRT?PCR 檢測基因沉默對U251 細胞內(nèi)Gemi?nin 基因表達的影響，結果顯示，與Control 組（1.01±0.18）及si?NC 組（0.96±0.08）相比，si?Geminin 組（0.18±0.05）中Geminin mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05，圖2）。

2.3 Geminin基因沉默對U251細胞增殖的影響

CCK?8 法檢測Geminin 基因沉默對U251 細胞的增殖的影響，結果顯示，與Control 組及si?NC 組相比，si?Geminin 組細胞存活率顯著降低（P＜0.05，圖3）。

2.4 Geminin 基因沉默對U251 細胞遷移和侵襲的影響

Transwell 實驗結果顯示，si?Geminin 組U251 細胞遷移數(shù)量［（70.33±5.51）個/視野］和侵襲數(shù)量［（29.00±3.61）個/視野］與Control 組［遷移（146.33±13.20）個/視野；侵襲（81.67±5.13）個/視野］及si?NC組［遷移（144.00±5.57）個/視野；侵襲（86.67±7.68）個/視野］相比均顯著降低（均P＜0.05，圖4）。

圖2 Geminin 基因沉默對U251 細胞Geminin mRNA 表達水平的影響Figure 2 Effect of Geminin gene silencing on Geminin mRNA expression in U251 cells

2.5 Geminin 基因沉默對U251 細胞內(nèi)HBO1、Cdt1蛋白表達的影響

圖3 Geminin基因沉默對U251 細胞增殖的影響Figure 3 Effect of Geminin gene silencing on U251 cell proliferation

Western blot 實驗檢測Geminin 基因沉默對U251 細胞內(nèi)Geminin、HBO1、Cdt1 蛋白表達的影響。結果顯示，與Control組及si?NC組相比，si?Gem?inin 組U251 細 胞 內(nèi)Geminin（0.36±0.03）、HBO1（0.39±0.02）、Cdt1蛋白（0.31±0.04）表達水平均顯著降低（P＜0.05，圖5）。

3 討論

圖4 Geminin基因沉默對U251細胞遷移和侵襲的影響（×400）Figure 4 Effect of Geminin gene silencing on U251 cell migration and invasion（×400）

圖5 Geminin基因沉默對U251 細胞內(nèi)HBO1、Cdt1蛋白表達的影響Figure 5 Effect of Geminin gene silencing on protein expressions of HBO1，Cdt1 in U251 cells

膠質瘤是起源于神經(jīng)外胚層最常見的原發(fā)性腦腫瘤，占成人惡性腦腫瘤的70%以上［1］，具有高度惡性及高病死率的特點，患者預后不良［4］。目前對該腫瘤患者的治療臨床上仍然采用外科手術治療與術后放療化療相結合的方法，此方法對于膠質瘤的治療存在一定的缺陷［5］：首先，因膠質瘤腫瘤本身的特點及生長部位的特殊性外科手術不能完全切除；其次，因為血腦屏障的存在，該腫瘤細胞對放療和化療不敏感。因此不能完全根治，而且容易復發(fā)。有研究表明，腦膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展可能與基因突變引起神經(jīng)干細胞分化失調存在一定的相關性［6］，鑒于此，用于膠質瘤早期發(fā)現(xiàn)與治療的一系列生物標志物正在深入研究中［7］。目前雖然用于膠質瘤治療的靶點［8?9］（如血管生成擬態(tài)、腎母細胞瘤Ⅰ基因產(chǎn)物、miR?128）及新興的靶向性藥物［10］、抗PD?1/PD?L1［11］及CAR?T 治療［12］等已初見成效，但并未獲得突破性進展。因此尋找新的、行之有效的分子靶點勢在必行。

Geminin 由McGarry 和Kirschner［13］首次發(fā)現(xiàn)，是一種小分子多功能的核蛋白，主要在細胞增殖中發(fā)揮作用［14］。Geminin 在許多不同類型的腫瘤中高表達，如消化系統(tǒng)腫瘤（胃癌、腸癌等）、口腔惡性黑色素瘤、乳腺癌及肺癌等［15］，其高表達常預示腫瘤細胞侵襲性高，提示腫瘤患者不良預后［16-17］。除了在保持基因組保真度方面發(fā)揮作用外，Geminin 對于胚胎發(fā)育的多個方面也是必需的，并且可以通過與染色質調節(jié)復合物的相互作用來控制胚胎基因的表達［18-19］，可促進胚胎干細胞向神經(jīng)組織的生成［20］。研究發(fā)現(xiàn)，Geminin作為DNA復制的拮抗劑和調節(jié)劑，可以調整神經(jīng)干細胞和室管膜細胞的比例進而可能對膠質瘤的發(fā)生及發(fā)展產(chǎn)生影響［21］。因此，本課題組通過基因沉默技術研究其在膠質瘤組織的表達模式以及對人膠質瘤細胞生物學行為產(chǎn)生的影響和可能發(fā)生的分子機制。結果顯示，Geminin 在膠質瘤中表達增高，轉染siRNA后膠質瘤U251細胞中Geminin mRNA 及蛋白表達水平顯著下降，細胞的增殖能力降低，細胞的遷移和侵襲的數(shù)量減少，由此可以推斷，Geminin 的高表達與膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡性程度密切相關。

Cdt1是重要的細胞周期調控因子，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系［22］。在細胞周期中，Cdt1對于將DNA 解旋酶加載到DNA 復制起點上至關重要，并受Geminin的調節(jié)，有研究發(fā)現(xiàn)，Geminin通過控制細胞周期內(nèi)DNA 復制的重新啟動來維持基因組保真度［14］，Geminin 可雙重調控Cdt1，在細胞周期中特異性結合Cdt1 構成了控制Cdt1 活性的第3 個系統(tǒng)，既可以防止Cdt1 重新啟動DNA 復制（S/G2 階段，負向調控），又可以保護Cdt1免受蛋白水解降解（G2/M 階段，正向調控）［23-24］。而HBO1 可直接與Cdt1相互作用，作為Cdt1的募集輔助因子直接參與了RC前的形成，增強Cdt1依賴的DNA復制，促進細胞的增殖。HBO1 最初被鑒定為起源識別復合物（ORC）的伴侶，其中包含1 個保守的MYST 域，該域可乙?；M蛋白并調節(jié)染色體結構，在細胞周期中，HBO1通過兩種方式調節(jié)DNA復制，其一是乙?；疕4K5/8/12，促進復制前復合物（Pre?RC）的形成；其二是乙酰化H3K14，促進CDC45的加載，激活S期DNA 的復制［25］。有研究顯示，HBO1、MOZ 和ORF HAT 復合物的靶向亞基ING5 的異位表達可增加Oct4、Olig2 和Nestin 等神經(jīng)干細胞標志物的表達，促進腫瘤的自我更新，防止譜系分化［26］。近期研究結果顯示，HBO1在膀胱癌中的高表達可通過增強β?catenin在膀胱癌細胞中的核易位以及上調β?catenin下游靶基因如c?myc、c?Jun、CCND1、CTLA4、LEF1、TCF1 和Axin2 等的表達，影響膀胱癌細胞的增殖、侵襲和轉移［27］。而Geminin在細胞周期中對HBO1、Cdt1 不平衡的調節(jié)作用可能導致DNA 復制缺陷和基因組的不穩(wěn)定，從而影響細胞的正常增殖、侵襲和轉移能力，最終導致腫瘤的發(fā)生［28］。但在膠質瘤細胞中，Geminin對HBO1、Cdt1的作用尚未有研究。

本實驗通過基因沉默技術敲除Geminin后檢測U251 細胞中HBO1、Cdt1 的表達情況，結果顯示，Geminin 沉默后Geminin、HBO1 及Cdt1 蛋白的表達水平均降低，由此我們推測在膠質瘤細胞中，Gemi?nin的高表達可能影響HBO1、Cdt1的表達及相互作用，促進DNA復制，進而增強膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。有研究報道，Geminin 蛋白可通過影響Wnt信號通路和上皮型鈣黏蛋白的表達對上皮細胞間質化進行影響［29］。在腦膠質瘤中，Geminin對HBO1、Cdt1二者的影響是否與此通路相關，其中是否還有其他的作用機制尚不清楚，有待于今后進一步的研究和探索。