GPRASP2基因編輯豬胎兒成纖維細(xì)胞系的建立

張 敏 ，姚 俊，魯雅潔，王紅順，王 盈，楊海元，魏欽俊，曹 新*，戴一凡

1南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系，江蘇 南京 211166；2南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省異種移植重點實驗室，江蘇 南京 211166

G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein?coupled receptor，GPCR）是人類基因組中最龐大的膜蛋白家族，它們是一類具有7 次跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的超家族［1］，主要通過與配體結(jié)合并發(fā)生內(nèi)吞后發(fā)揮作用，可調(diào)控生物體內(nèi)許多重要的生理過程。G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)分選蛋白（GPCR associated sorting protein，GASP）主要在GPCR內(nèi)吞后的分選過程發(fā)揮重要作用，通過與受體的羧基端相互結(jié)合，從而介導(dǎo)GPCR進(jìn)入降解或再循環(huán)途徑，從而調(diào)控相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［2］。GPRASP2 為GASP 家族成員（即GASP2），參與GPCR 活性調(diào)節(jié)，并與腫瘤發(fā)生、細(xì)胞生長及衰老、生理調(diào)節(jié)和溶酶體降解等生理過程相關(guān)［2］。本課題組在1 個X 連鎖隱性遺傳耳聾家系中首次定位和發(fā)現(xiàn)GPRASP2 基因突變（c.1717_1718GC＞AA，p.A573N）與綜合征性耳聾（syndromic hearing loss，SHL）的發(fā)生相關(guān)［3］。為進(jìn)一步推進(jìn)對GPRASP2基因突變/功能缺陷致聾的分子病因?qū)W的理解，還需要在模型動物水平進(jìn)行耳聾基因型/表型相關(guān)性的研究和GPRASP2功能的探討。

隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建基因缺陷的動物模型為從病理與病因?qū)W上研究遺傳性耳聾提供了有效途徑。小鼠等嚙齒類模型動物的內(nèi)耳發(fā)育、遺傳和解剖結(jié)構(gòu)與人類差別較大［4］，無法精確模擬人內(nèi)耳的生理功能和病理過程。豬在分子進(jìn)化上與人親緣關(guān)系相近，在遺傳、生理生化、器官發(fā)育和病程發(fā)展等方面，特別在內(nèi)耳發(fā)育、聽器結(jié)構(gòu)和功能上與人相似［5-6］：豬出生時耳蝸形態(tài)已基本發(fā)育成熟并已具備正常聽力，這與人胚胎時期的內(nèi)耳發(fā)育過程一致［7-8］；豬的內(nèi)耳耳蝸形態(tài)以及螺旋器結(jié)構(gòu)和功能與人相似；豬的聽閾和敏感聽力范圍與人接近［9］，具有相似的聽性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response，ABR）［10］；巴馬小型豬體型大小合適，遺傳背景明晰，應(yīng)用于遺傳性耳聾的研究更具優(yōu)勢［10］。本研究采用CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)成功獲得豬GPRASP2 基因敲除的豬胎兒成纖維細(xì)胞（porcine fetal fibroblasts，PFF），為構(gòu)建GPRASP2 基因缺陷的巴馬小型豬模型和在體水平探索GPRASP2 的致聾機制奠定了實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

PFF由南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省異種移植重點實驗室提供；pX330 質(zhì)粒（Addgene 423230）、帶G418 抗性標(biāo)記的pCMV td?tomato 質(zhì)粒（Clontech 公司，日本）；BbsⅠ限制性內(nèi)切酶和T7EN1 酶（New England Biolabs公司，美國）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Qiagen公司，德國）；質(zhì)粒小提中量試劑盒和DH5α感受態(tài)細(xì)胞（北京天根生化科技公司）；Basic NucleofectorTMKits 和細(xì)胞轉(zhuǎn)染儀（Lonza 公司，德國）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、青/鏈霉素雙抗和PBS 緩沖液（Gibco公司，美國）；pMD18?T載體（TaKaRa公司，日本）；引物和磷酸化的寡核苷酸序列由南京金斯瑞公司合成。

1.2 方法

1.2.1 人/豬GPRASP2的生物信息學(xué)分析

采用MEGA7.0 軟件，選取包括豬和人等20 種物種進(jìn)行GPRASP2 基因親緣性分析，并繪制GPRASP2的系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用GeneDoc 軟件，比對人/豬GPRASP2 氨基酸序列，并進(jìn)行同源性和保守性分析。

采用DNAstar軟件中Protean模塊對人/豬GPRASP2 蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析，以Chou?Fasman算法預(yù)測蛋白α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角的比例。采用Swiss?Model在線工具對人/豬GPRASP2蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬（https：//www.swissmodel.expasy.org/），因Protein Data Bank（PDB）數(shù)據(jù)庫中未檢索到GPRASP2 同源蛋白的結(jié)構(gòu)，故采用從頭計算法對人/豬GPRASP2蛋白主要功能結(jié)構(gòu)域Arm2（含250個氨基酸殘基）進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模擬。

1.2.2 CRISPR/Cas9的靶點設(shè)計和打靶載體構(gòu)建

利用CRISPR 靶點在線設(shè)計工具（http：//crispr.mit.edu/），分別在豬GPRASP2 基因編碼區(qū)（coding sequence，CDS）的上游和下游各設(shè)計1對20 bp左右的sgRNA 寡核苷酸序列（sgRNA oligo，表1），由南京金斯瑞合成5′端磷酸化修飾的sgRNA oligo。

表1 GPRASP2靶點位置及sgRNA寡核苷酸序列Table 1 GPRASP2 targeting loci and sgRNA oligonucleo?tide sequence

載體構(gòu)建步驟主要包括oligo退火、載體酶切和連接［11-13］。將合成的sgRNA oligo 以去離子水稀釋至100 μmol/L，反應(yīng)體系（10 μL）：正鏈oligo 1 μL，反鏈oligo 1 μL，去離子水8 μL；PCR 儀設(shè)置退火程序：37 ℃孵育30 min，95 ℃孵育5 min，再以5 ℃/min速度逐漸降溫至25 ℃；退火后將oligo 稀釋250 倍。用BbsⅠ限制性內(nèi)切酶對pX330質(zhì)粒進(jìn)行線性化，并連接退火產(chǎn)物，再轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，挑單克隆菌落至搖管，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，分裝1 mL 的菌液送測序。測序驗證后凍存菌液，并小提質(zhì)粒。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和單克隆細(xì)胞的篩選

PFF培養(yǎng)于含16%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基含中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%后，以0.05%胰蛋白酶消化并離心收集細(xì)胞；取1 μg pCMV td?tomato 分別與空載pX330質(zhì)粒、靶向豬GPRASP2基因CDS上游和下游的重組pX330?CDS?UP/pX330?CDS?DOWN質(zhì)粒各5 μg 共轉(zhuǎn)染PFF；參照Lonza 核轉(zhuǎn)試劑盒說明書配制核轉(zhuǎn)液，使用程序U?023進(jìn)行核轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)染后24 h加1 mg/mL 的G418 進(jìn)行藥篩培養(yǎng)，隔天換液，并根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)調(diào)整G418用藥濃度。9～10 d后，顯微鏡觀察單克隆位置，并在皿底標(biāo)記；棄皿中培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，將克隆環(huán)放置于皿底單克隆位置，加0.05%胰蛋白酶消化細(xì)胞，轉(zhuǎn)接于24孔板中，待細(xì)胞長滿后再轉(zhuǎn)接至12孔板中培養(yǎng)，孔板蓋上標(biāo)記克隆編號和日期；12 孔板中細(xì)胞長滿后，取部分細(xì)胞用NP40裂解液裂解，提取基因組DNA，PCR 擴增靶點區(qū)域，CDS1 上游引物5′?TTCTGCACTCTGTTG?GCTGAG ? 3′，下 游 引 物5′ ? AGCAGCAGAAC?CAGACTCATT?3′，擴增產(chǎn)物長度722 bp。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃1 min，35 個循環(huán)；PCR 產(chǎn)物經(jīng)切膠回收，連接pMD18?T 載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α中，每板挑取12個菌落送公司測序；測序結(jié)果與豬GPRASP2基因序列（XM?003135261.4）進(jìn)行比對，鑒定得每個克隆細(xì)胞的基因型。

1.2.4 重組載體打靶效率驗證

提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組DNA，同前PCR擴增；切膠回收PCR 產(chǎn)物（5 μL），加入2 μL 10×NEBuffer 2.0，用Nuclease?free 水補足至19 μL，在PCR 儀中進(jìn)行退火反應(yīng)：95 ℃10 min，再逐漸冷卻至室溫；退火結(jié)束后，取9.5 μL 退火產(chǎn)物加入0.5 μL T7EN1酶，剩余9.5 μL 退火產(chǎn)物加0.5 μL 去離子水（即不加酶的對照組），混勻后37 ℃下反應(yīng)15 min；加入0.5 μL 蛋白酶K使T7EN1酶失活，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析和檢測打靶效率。根據(jù)條帶灰度值，計算細(xì)胞轉(zhuǎn)染敲除效率，敲除效率=100×［1-（1-裂解產(chǎn)物占比）1/2］。

1.2.5 Western blot驗證

分別取野生型和GPRASP2基因敲除的PFF，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液后超聲破碎和低溫離心，提取總蛋白，經(jīng)SDS?PAGE 膠分離，轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加GPRASP2 抗體（1∶1 000，Abcam 公司，英國）和β?tu?bulin 抗體（1∶1 000，北京翼飛雪），4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜后室溫孵育二抗（羊抗兔或羊抗鼠）2 h，TBST洗膜后，化學(xué)發(fā)光儀（Bio?Rad公司，美國）檢測蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 人/豬GPRASP2基因的分子進(jìn)化關(guān)系與同源性分析

包含豬和人在內(nèi)20個物種的GPRASP2系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖1A 所示，分值越高的節(jié)點其置信度也越高。進(jìn)化樹顯示人/豬GPRASP2在分子進(jìn)化上親緣關(guān)系更近，且人/豬GPRASP2蛋白同源性較高，氨基酸序列一致性達(dá)86%（圖1B），且主要功能結(jié)構(gòu)域Arm2的氨基酸序列一致性高達(dá)94%。

2.2 人/豬GPRASP2蛋白結(jié)構(gòu)分析

采用DNAstar 軟件中Protean 模塊的Chou?Fas?man 算法對人/豬GPRASP2 蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析。人/豬GPRASP2 蛋白及其主要功能結(jié)構(gòu)域Arm2 的二級結(jié)構(gòu)具有相近的α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角的數(shù)量（表2），提示人/豬GPRASP2蛋白的二級結(jié)構(gòu)相似。蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬顯示人/豬GPRASP2的主要功能結(jié)構(gòu)域Arm2的三維結(jié)構(gòu)相似?？紤]到人/豬GPRASP2在分子進(jìn)化上親緣關(guān)系相近且高度同源，推測人/豬GPRASP2 蛋白具有相似的生物學(xué)功能，這還需從在體水平進(jìn)一步驗證。

2.3 重組打靶質(zhì)粒和GPRASP2 基因敲除PFF 的基因型鑒定

測序結(jié)果如圖2 所示，pX330 中分別插入了GPRASP2基因CDS上游和下游靶點的sgRNA序列。

經(jīng)測序鑒定，共獲得42個陽性單克隆，其中5個為雙等位突變的陽性單克?。ū?），包含5種等位基因突變型（圖3），4 種導(dǎo)致GPRASP2 編碼氨基酸的移碼和蛋白截短。

2.4 GPRASP2基因敲除效率的驗證

如圖4所示，轉(zhuǎn)染pX330?CDS?UP和pX330?CDS?DOWN 重組打靶質(zhì)粒的PFF 對應(yīng)的PCR 產(chǎn)物均可觀察到明顯剪切條帶，敲除效率分別為20%和15%，選取敲除效率較高的pX330?CDS?UP重組質(zhì)粒用于后續(xù)轉(zhuǎn)染和單克隆PFF篩選。

2.5 GPRASP2基因敲除PFF的Western blot驗證

表2 GPRASP2蛋白及其Arm2結(jié)構(gòu)域的二級結(jié)構(gòu)分析Table 2 Analysis of the secondary structures of GPRASP2 protein and Arm2 domain（%）

采用Western blot 隨機驗證其中1 株GPRASP2基因敲除PFF細(xì)胞系（GPRASP2c.113_114delCT/c.113_114delCT）中GPRASP2 蛋白的表達(dá)情況。如圖5 所示，在GPRASP2 基因敲除PFF 細(xì)胞中未檢測到GPRASP2蛋白表達(dá)，表明GPRASP2 基因敲除PFF 構(gòu)建成功，可用于后續(xù)的體細(xì)胞核移植。

圖2 重組打靶質(zhì)粒測序驗證圖Figure 2 Sequencing of recombinant vectors

3 討論

圖3 GPRASP2基因敲除PFF的等位基因型分析Figure 3 The allelic genotypes of GPRASP2?knockout PFF

表3 GPRASP2基因敲除PFF單克隆細(xì)胞基因型Table 3 Genotypes of GPRASP2?knockout monoclonal PFF

本課題組在中國1個X?連鎖遺傳性SHL大家系中成功定位和克隆了1 個新的致聾基因GPRASP2，該家系患者均為男性且攜帶GPRASP2突變，表現(xiàn)為重度以上聽力損失伴外耳廓畸形、內(nèi)耳道狹窄/閉鎖以及眼瞼下垂等表型，并在家系成員中呈現(xiàn)典型的遺傳共分離［3］。GPRASP2 基因定位于人染色體Xq22.1，編碼區(qū)位于第5 外顯子，共編碼838 個氨基酸，其羧基端含有高度保守的Arm2功能結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域主要通過與多個GPCR的羧基末端結(jié)構(gòu)域相互作用，從而特異性靶向GPCR 進(jìn)入溶酶體降解或再循環(huán)途徑［14］。本研究提示人/豬GPRASP2在分子進(jìn)化上親緣關(guān)系相近并高度同源，且人/豬GPRASP2蛋白及其主要功能結(jié)構(gòu)域Arm2在二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)上高度相似，推測GPRASP2 基因在人/豬相應(yīng)組織器官（包括內(nèi)耳）中可能具有相似的生物學(xué)功能。

圖4 豬GPRASP2基因敲除靶點的T7EN1酶切驗證Figure 4 T7EN1 cleavage assay of target sites in porcine GPRASP2

圖5 GPRASP2基因敲除PFF的Western blot驗證Figure 5 Western blot assay of GPRASP2?deficient PFF

GPRASP2作為GASP家族成員（GASP2）在GPCR 內(nèi)吞后的分選過程中發(fā)揮著重要作用。GP?CR經(jīng)配體刺激后，質(zhì)膜表面的蛋白受體經(jīng)G蛋白偶聯(lián)受體激酶磷酸化以及β?arrestins 作用下與G 蛋白解偶聯(lián)，通過網(wǎng)格蛋白有被小泡的協(xié)助完成內(nèi)吞，內(nèi)吞后的分選途徑一般包括再循環(huán)和降解［15］。目前已經(jīng)鑒定出多個受體再循環(huán)途徑以及GPCR內(nèi)吞后進(jìn)入溶酶體降解途徑的GASP［15?16］，涉及多方面的生理功能。有研究表明GASP家族蛋白可作為腫瘤的分子標(biāo)志物指示腫瘤的發(fā)生發(fā)展，GASP1在多種類型的腫瘤患者血清中都具有較高的表達(dá)量，包括乳腺癌、腦瘤、肝癌以及肺癌等［17］；GASP2和GASP3在術(shù)前和術(shù)后頭頸鱗狀細(xì)胞癌患者中的表達(dá)具有顯著差異［18］；Horn 等［19］研究發(fā)現(xiàn)GPRASP2 羧基端部分與亨廷頓蛋白（htt）的氨基端（polyQ）相互作用，形成htt?GPRASP2 復(fù)合物，參與受體胞吞作用和突觸后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響受體的轉(zhuǎn)運，而這一過程與亨廷頓舞蹈癥發(fā)生有較大相關(guān)性；Edfawy 等［20］研究發(fā)現(xiàn)GPRASP2 能夠通過代謝型谷氨酸受體（mGluR）信號通路調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，且敲除GPRASP2基因?qū)е滦∈蟪霈F(xiàn)自閉癥譜系障礙樣行為［20］?，F(xiàn)有研究提示GPRASP2與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)；本課題組則在人類家系中首次關(guān)聯(lián)了GPRASP2基因突變/功能缺陷與SHL的發(fā)生相關(guān)［3］。

為精確模擬GPRASP2突變導(dǎo)致的SHL表型，從在體水平研究GPRASP2 的功能及其突變致聾的機制，本研究擬選擇巴馬小型豬構(gòu)建耳聾動物模型。豬是除了靈長類動物以外在進(jìn)化關(guān)系上與人最接近的實驗動物，并在諸多器官（包括聽覺器官）的解剖結(jié)構(gòu)和發(fā)育遺傳方面高度相似［13］。采用基因編輯技術(shù)構(gòu)建基因缺陷的耳聾模型豬可精確模擬人遺傳性耳聾的疾病表型和病理過程，如楊仕明課題組利用乙基亞硝基脲（ENU）誘變構(gòu)建了MITF基因敲除小型豬模型，成功復(fù)制了人Mondini 畸形病伴聽力損失的臨床表型［21］；本課題組基于CRIS?PR/Cas9 介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)成功構(gòu)建了OSBPL2基因敲除的巴馬小型豬模型，首次精確模擬了人OSBPL2 基因突變導(dǎo)致的漸進(jìn)性聽力損失的臨床表型（DFNA67）和內(nèi)耳聽毛細(xì)胞的病理過程［13］。

本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)成功構(gòu)建了GPRASP2基因敲除的PFF細(xì)胞系，為后續(xù)體細(xì)胞核移植和重組胚胎構(gòu)建提供合適的供體細(xì)胞，為構(gòu)建GPRASP2 基因敲除的巴馬小型豬模型奠定了前期基礎(chǔ)，以期為進(jìn)一步探索GPRASP2基因突變致聾機制與基因治療提供合適的大動物模型。