氮沉降及菌根真菌對(duì)長(zhǎng)白落葉松苗木根系構(gòu)型及根際酶活性的影響

劉婷巖 郝龍飛* 王續(xù)富 閆海霞 白淑蘭

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，呼和浩特 010019；2. 呼和浩特市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，呼和浩特 010030）

土壤氮有效性是氣候變化反饋機(jī)制的重要因子，同時(shí)也是影響植物生長(zhǎng)和物種多樣性的關(guān)鍵因素［1］。由于人類(lèi)活動(dòng)產(chǎn)生的活性氮不斷增加，并以干、濕沉降的方式進(jìn)入地球表面，導(dǎo)致了一系列的生態(tài)問(wèn)題，當(dāng)前中國(guó)已成為全球氮沉降最高的國(guó)家之一［2］。已有研究認(rèn)為，氮沉降已成為影響中國(guó)陸地生態(tài)系統(tǒng)平衡的主要驅(qū)動(dòng)因子，進(jìn)而影響森林生態(tài)系統(tǒng)土壤微生物多樣性及生態(tài)功能［3～4］。以往研究發(fā)現(xiàn)，菌根共生關(guān)系受到氮沉降的影響，土壤氮限制地區(qū)的外源氮輸入會(huì)促進(jìn)菌根的生長(zhǎng)，但隨著氮輸入量的增加，對(duì)菌根共生體的影響存在差異，差異程度取決于生態(tài)系統(tǒng)中氮沉降量及時(shí)間、土壤初始氮水平和菌根類(lèi)型等因素［5］。

土壤酶作為生態(tài)系統(tǒng)的生物催化劑，且對(duì)外界環(huán)境變化非常敏感，其中β-1，4 葡萄糖苷酶（BG）、β-1，4-N-乙酰-氨基葡糖氨糖苷酶（NAG）、亮氨酸氨基肽酶（LAP）、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（ALP）分別在土壤的碳、氮、磷養(yǎng)分循環(huán)利用中起著重要作用［6］。氮沉降作為外源氮進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)，顯著影響土壤酶在生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)過(guò)程中的作用［7］。以往關(guān)于氮輸入對(duì)土壤酶的影響有促進(jìn)［8］、抑制［9］和無(wú)影響［10］等不同結(jié)論，原因?yàn)橥寥烂冈诓煌h(huán)境中對(duì)氮沉降的響應(yīng)存在差異。土壤酶主要來(lái)源于土壤微生物和植物根系，以往關(guān)于氮沉降對(duì)菌根真菌和土壤酶兩者的單一研究已有大量的報(bào)道［11］；且研究也發(fā)現(xiàn)，菌根共生體顯著影響土壤酶的活性［12］。然而，菌根共生體形成后，其根際土壤酶活性對(duì)氮沉降的響應(yīng)研究較為缺乏。

本研究以北方地區(qū)菌根依賴(lài)型樹(shù)種長(zhǎng)白落葉松（Larix olgensis）苗木為材料，通過(guò)對(duì)比分析氮沉降對(duì)菌根苗和非菌根苗根系形態(tài)變化，結(jié)合氮沉降處理下土壤酶活性的變化規(guī)律，探討氮沉降對(duì)生態(tài)系統(tǒng)植物根系和菌根真菌共生關(guān)系中根系構(gòu)型和酶活性特征的影響，為全球變化背景下森林生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性研究提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究所用外生菌根真菌為：褐環(huán)粘蓋牛肝菌（Suillus luteus）、厚環(huán)粘蓋牛肝菌（Suillus grevillei）、黃褐口蘑（Tricholoma fulvum）、淺灰小牛肝菌（Bo?letinus grisellus）、乳牛肝菌（Suillus bovinus）、球根白絲膜菌（Leucocortinarius bulbiger）、淺黃根須腹菌（Rhizopogon luteolus）和彩色豆馬勃（Pisolithus tinctorius）。

長(zhǎng)白落葉松種子用2%的KMnO4溶液消毒30 min，然后用無(wú)菌水沖洗4～5 次；在25℃恒溫光照培養(yǎng)箱中催芽，待種子萌發(fā)后播入裝有經(jīng)高溫、高壓滅菌基質(zhì)（蛭石與土體積比為1∶2）的花盆中（d=15 cm），并放入人工氣候室培育（溫度25℃，最大濕度60%，最大光照強(qiáng)度10 000 Lux）培養(yǎng)2 月后待用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1菌劑制備

菌劑采用MMN 培養(yǎng)液與蛭石配置成固體培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌1 h，待冷卻后分別接種上述8種外生菌根真菌的平板菌種，再置于25℃培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，45 d后即可長(zhǎng)滿(mǎn)瓶，以備用。

1.2.2接種處理

研究采用盆栽試驗(yàn)，設(shè)置2 個(gè)接種處理，分別為接種處理（以下簡(jiǎn)稱(chēng)+M，將8種菌劑等量混合后對(duì)幼苗進(jìn)行接種）和未接種處理（以下簡(jiǎn)稱(chēng)-M）。接種方法為：在育苗盆底部放入適量滅菌基質(zhì)，然后選取長(zhǎng)勢(shì)良好的菌劑等量混勻平鋪于滅菌基質(zhì)上，再選培養(yǎng)2 個(gè)月生長(zhǎng)良好的幼苗栽入其中，盡量使幼苗根系與菌劑充分接觸，每盆接種量20.0 g，每盆栽植5 株幼苗，覆滅菌基質(zhì)，每盆質(zhì)量控制1.0 kg；對(duì)照處理加入經(jīng)滅菌的20.0 g 等量混合的固體菌劑，同樣方法進(jìn)行幼苗栽植，澆透水后，將不同處理育苗盆隨機(jī)排布，置于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)苗圃溫室大棚內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.3模擬氮沉降處理試驗(yàn)

幼苗接種培養(yǎng)2 個(gè)月后，測(cè)定+M 處理苗木菌根侵染率達(dá)38.57%（-M 處理苗木菌根侵染率為0%），開(kāi)始模擬氮沉降處理試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)區(qū)氮沉降背景值34.3 kg·N·hm-1·yr-1［8］，設(shè)置4 個(gè)氮濃度處理：不施氮（0N，0 kg·N·hm-1·yr-1）、低氮（LN，15 kg·N·hm-1·yr-1）、中氮（MN，30 kg·N·hm-1·a-1）和高氮（HN，60 kg·N·hm-1·a-1）處理。用自來(lái)水溶解的NH4Cl 和NaNO3（NO3-：NH4+為1∶1）作為氮添加溶液，隔5 d 定量澆水150 mL/盆、隔10 d 定量施入氮添加溶液100 mL/盆，共施氮10次。接種和氮沉降處理各設(shè)置15個(gè)重復(fù)。采用噴灑方法將氮施入育苗盆中，既可以模擬降雨過(guò)程脈沖式將氮帶入土壤中，同時(shí)更為均勻。

1.3 根系形態(tài)測(cè)定

最后一次模擬氮沉降試驗(yàn)結(jié)束15 d 后，從各處理中隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)較一致的長(zhǎng)白落葉松幼苗5株，用去離子水清洗根系附著雜物后進(jìn)行根系形態(tài)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。用Epson 數(shù)字化掃描儀Expres?sion10000XL 進(jìn)行根系形態(tài)掃描，并使用Win RHI?ZO 根系圖像分析軟件對(duì)各處理根系形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析，測(cè)定直徑0～0.5 mm根系的總根長(zhǎng)、總表面積、總體積、根尖數(shù)等形態(tài)指標(biāo)。

1.4 土壤酶活性測(cè)定

土壤酶活性的測(cè)定包括β-1，4-葡萄糖苷酶（BG）、β-1，4-N-乙酰-氨基葡糖氨糖苷酶（NAG）、亮氨酸氨基肽酶（LAP）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（ALP），具體測(cè)定參考Sinsabaugh 等的方法［13］。BG、NAG、ACP 的測(cè)定，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確稱(chēng)取0.25 g 新鮮土壤，加入不同的4 mL 醋酸緩沖液配制的不同反應(yīng)底物溶液，20℃培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，提取上清液2.5 mL 于試管中，加入NaOH 終止反應(yīng)和顯色，在410 nm 處測(cè)定吸光度。ALP 酶和LAP 測(cè)定方法與上述酶測(cè)定相似，分別準(zhǔn)確稱(chēng)取0.25和0.35 g新鮮土樣，并分別采用碳酸鹽緩沖液和Tris-羥甲基-氨基甲烷緩沖液配制相應(yīng)底物溶液，LAP 反應(yīng)4 h 后不加NaOH，直接測(cè)定吸光度，以對(duì)硝基苯酚的濃度表征酶活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 23.0（SPSS for Windows，Chicago，USA）采用雙因素方差分析和LSD 多重比較法對(duì)接種菌根真菌和氮沉降處理下苗木根系形態(tài)和土壤酶差異顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)。采用Sigmaplot10.0（Systat Software Inc.，San Jose，CA，USA）進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮沉降和接種處理對(duì)苗木根系形態(tài)的影響

對(duì)1 年生長(zhǎng)白落葉松苗木根系形態(tài)進(jìn)行雙因素方差分析，接種菌根真菌、氮沉降及二者交互作用對(duì)苗木直徑0～0.5 mm根系的總根長(zhǎng)、總表面積、總體積、根尖數(shù)的影響均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）（見(jiàn)表1）。在+M 和-M 處理中，長(zhǎng)白落葉松苗木直徑0～0.5 mm根系形態(tài)指標(biāo)均隨氮沉降量遞增呈下降的趨勢(shì)。0N 處理苗木直徑0～0.5 mm 根系形態(tài)指標(biāo)均顯著高于MN 和HN。在0N、MN處理下，-M處理的總根長(zhǎng)、總表面積、總體積、根尖數(shù)均顯著高于+M 處理。-M 處理下，LN 處理的直徑0～0.5 mm 根系總根長(zhǎng)和根尖數(shù)較0N 處理分別降低了18.9%（P<0.05）和53.3%（P<0.05）。而HN 處理下，+M 處理根系的根尖數(shù)較-M 處理降低了32.1%（P<0.05）（見(jiàn)表1）。

2.2 氮沉降和接種處理對(duì)幼苗根際土壤酶活性的影響

對(duì)1 年生長(zhǎng)白落葉松苗木根際土壤酶活性進(jìn)行雙因素方差分析，接種菌根真菌顯著影響苗木根際BG、LAP、ALP 和NAG 活性（P<0.01），但對(duì)ACP 活性無(wú)顯著影響。氮沉降對(duì)苗木根際土壤酶活性的影響均達(dá)到了極顯著水平（P<0.01）。接種菌根真菌和氮沉降處理對(duì)ACP 無(wú)交互作用，而對(duì)BG、LAP、ALP和NAG活性的影響達(dá)到極顯著和顯著水平（見(jiàn)表2）。隨氮沉降量遞增，長(zhǎng)白落葉松苗木根際土壤中BG、LAP、ACP和ALP活性均呈先增加后下降的趨勢(shì)，而NAG 活性呈下降的趨勢(shì)。+M處理苗木根際土BG 活性顯著高于-M 處理。0N 條件下，+M 與-M 相比根際土壤NAG 活性提高了74.7%（P<0.05）；LN 條件下，+M 處理苗 木根際土壤LAP 活性較-M 處理提高了83.2% （P<0.05）；MN 條件下，+M 處理根際土壤ACP 活性較-M 處理提高了17.6%（P<0.05）；但+M 處理根際土壤ALP 活 性 較-M 處 理 降 低 了32.2%（P<0.05）（見(jiàn)表2）。

表1 氮沉降和接種菌根真菌對(duì)長(zhǎng)白落葉松苗木直徑0～0.5 mm根系形態(tài)的影響Table 1 Root morphology with diameter of 0-0.5 mm of L. olgensis seedlings under nitrogen deposition and inoculated with ectomycorrhizal fungi treatments

表2 氮沉降和接種菌根真菌對(duì)長(zhǎng)白落葉松幼苗根際土壤酶活性的影響Table 2 Rhizosphere soil enzyme activities of L. olgensis seedlings under nitrogen deposition and inoculated with ecto‐mycorrhizal fungi treatments（nmol·g-1·h-1）

2.3 根系形態(tài)和土壤酶活性間相關(guān)性分析

兩種接菌處理下，長(zhǎng)白落葉松苗木直徑0～0.5 mm 根系的形態(tài)指標(biāo)與根際土壤BG 活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.05）；除根尖數(shù)與根際土壤NAG 活性間無(wú)顯著相關(guān)性外，其他根系形態(tài)指標(biāo)與NAG 活性均呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.05）；-M 處理下根際土壤LAP 活性與總根長(zhǎng)、總表面積和根系總體積呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。接種菌根真菌和氮沉降交互作用的影響下，根系形態(tài)指標(biāo)與根際土壤BG 活性呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）；除根尖數(shù)與根際土壤ACP 活性顯著負(fù)相關(guān)性外（P<0.05），其他根系形態(tài)指標(biāo)與ACP 活性無(wú)相關(guān)性；除根尖數(shù)與根際土壤ALP 活性無(wú)顯著相關(guān)外，其他根系形態(tài)指標(biāo)與ALP活性均呈正相關(guān)（P<0.05）（表3）。

表3 接種菌根真菌處理下長(zhǎng)白落葉松苗木直徑0～0.5 mm根系形態(tài)與根際土壤酶活性相關(guān)性分析Table 3 Pearson’s correlation test between root morphology with diameter of 0-0.5 mm and rhizosphere soil enzyme activities of L.olgensis seedlings under inoculated with ectomycorrhizal fungi treatments

3 討論

3.1 氮沉降和接種處理對(duì)苗木根系構(gòu)型的影響

外生菌根真菌侵染植物根系，形成菌根共生體，增大根系吸收面積，促進(jìn)了植物對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收，尤其對(duì)外生菌根依賴(lài)型樹(shù)種，共生關(guān)系形成后，提高植物對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)性［14］。根系形態(tài)構(gòu)型中根系長(zhǎng)度、表面積、體積、根尖數(shù)是衡量植物根系分布范圍和養(yǎng)分吸收能力的重要指標(biāo)。本研究中，接種菌根真菌、氮沉降及二者交互作用對(duì)苗木直徑0～0.5 mm根系形態(tài)的影響均達(dá)到極顯著水平（P<0.01），且不同接種處理下長(zhǎng)白落葉松苗木根系指標(biāo)均隨氮沉降量遞增呈下降的趨勢(shì)，且-M 處理高于+M 處理（見(jiàn)表1）。與以往關(guān)于施用氮肥對(duì)落葉松人工林1 級(jí)根外生菌根侵染及形態(tài)的影響研究結(jié)果一致［15］，原因可能為植物對(duì)環(huán)境變化具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和可塑性，一定的氮沉降處理消除了土壤氮限制，植物通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)根的生長(zhǎng)形成最優(yōu)的資源獲取策略［16］。在相同氮沉降處理下，-M處理的總根長(zhǎng)、總表面積、總體積、根尖數(shù)均高于+M 處理（見(jiàn)表1）。與以往研究關(guān)于外生菌根真菌提高油松根系構(gòu)型的形態(tài)指標(biāo)的研究結(jié)果存在差異［14］，其原因可能為菌根共生體中棒狀和二叉狀結(jié)構(gòu)提高了吸收根直徑［17］，導(dǎo)致接種處理下直徑0～0.5 mm 根系中吸收根的根尖數(shù)減少；也可能植物菌根形成后，一部分碳水化合物分配給菌根真菌，自身根系形態(tài)構(gòu)型指標(biāo)降低，該觀(guān)點(diǎn)也符合植物生長(zhǎng)策略［16］。

3.2 氮沉降和接種處理對(duì)根際土壤酶活性的影響

土壤酶活性與土壤養(yǎng)分循環(huán)密切相關(guān)，且高氮輸入對(duì)森林生態(tài)系統(tǒng)平衡產(chǎn)生顯著影響［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，氮沉降對(duì)苗木根際土壤酶活性的影響均達(dá)到了極顯著水平；而接種菌根真菌及其交互作用顯著影響苗木根際土壤BG、LAP、ALP和NAG活性，而對(duì)ACP 活性無(wú)顯著影響。同時(shí)，隨氮沉降量遞增，長(zhǎng)白落葉松菌根和非菌根苗根際土壤酶（BG、LAP、ACP 和ALP）活性均呈先增加后下降的趨勢(shì)，而NAG 活性呈下降的趨勢(shì)（見(jiàn)表2）。與以往關(guān)于氮沉降對(duì)廣東鼎湖山林地土壤酶活性的影響結(jié)果一致［19］，原因可能為低氮水平緩解了土壤氮限制，促進(jìn)根系和微生物活性，進(jìn)而增加了土壤酶活性；而高氮處理可能導(dǎo)致嚴(yán)重的土壤酸化［20～21］，影響土壤微生物活性，進(jìn)而導(dǎo)致高氮處理下土壤酶活性受到限制。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨氮沉降量增加，+M 處理根際土壤酶活性變化量高于-M處理（見(jiàn)表2），表明氮沉降對(duì)菌根苗根際土壤酶活性的影響高于非菌根苗。原因可能為HN處理下，根系較容易獲得養(yǎng)分，對(duì)菌根真菌的依賴(lài)性降低，削弱根系和菌根真菌的共生關(guān)系［22］。氮沉降處理下，+M 和-M 處理長(zhǎng)白落葉松苗木直徑0～0.5 mm根系形態(tài)與根際土壤BG 活性呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），表明氮沉降下根系形態(tài)指標(biāo)降低而土壤BG活性增加。原因?yàn)橥寥繠G 主要來(lái)源于土壤微生物［23］，氮添加會(huì)增加土壤中氮含量、纖維素和半纖維素的濃度，降低木質(zhì)素和糖類(lèi)濃度，所以氮添加會(huì)促進(jìn)纖維素降解酶（BG）活性［24］。根據(jù)資源配置理論，氮沉降增加土壤無(wú)機(jī)氮的濃度，土壤微生物可能會(huì)減少氮獲取酶的產(chǎn)生，以往的研究大多使用資源分配理論來(lái)解釋氮獲取酶對(duì)氮添加的響應(yīng)，與本研究結(jié)果根際土壤NAG 活性變化規(guī)律結(jié)果一致。研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)限制發(fā)生變化時(shí)（如從N 限制到P 限制），根系和微生物可能會(huì)調(diào)整相關(guān)酶的產(chǎn)生，以保證植物和微生物平衡養(yǎng)分需求與周?chē)h(huán)境供應(yīng)之間的動(dòng)態(tài)平衡［25］。

4 結(jié)論

（1）除土壤酸性磷酸酶外，接種菌根真菌、氮沉降及二者交互作用顯著影響苗木直徑0～0.5 mm根系的形態(tài)及根際土壤酶活性。

（2）苗木形成菌根后可以減弱氮沉降對(duì)苗木根系構(gòu)型的影響，尤其在低氮濃度下，菌根苗對(duì)根際土壤酶的活化程度顯著高于非菌根苗。

（3）高氮濃度顯著抑制菌根苗和非菌根苗吸收根根系形態(tài)構(gòu)型。

（4）隨著氮濃度的增加，長(zhǎng)白落葉松菌根苗顯著提高根際土壤相關(guān)酶（BG和NAG）的活性。