橡膠草E2泛素結(jié)合酶基因TkUBC2基因的克隆及其表達(dá)分析

王肖肖 覃 碧 楊玉雙 聶秋海 張繼川 劉實(shí)忠*

（1. 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海口 570228；2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，?？?571101；3. 北京玲瓏蒲公英科技發(fā)展有限公司，北京 110000；4. 北京化工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100029）

在逆境條件下，植物會(huì)激活多種信號(hào)通路來調(diào)節(jié)自身的生長(zhǎng)發(fā)育，其中泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑在調(diào)控植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫過程中具有重要作用［1］。該途徑通過泛素活化酶E1（ubiquitin acti?vating enzyme，E1）、泛素結(jié)合酶E2（ubiquitin-con?jugating enzyme，UBC/E2）和泛素連接酶E3（ubiqui?tin ligase，E3）多步反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。其中E2 酶起到“承上啟下”的作用，接收從E1 活化的泛素蛋白，催化泛素蛋白直接與底物結(jié)合或與E3 結(jié)合。因此，E2在泛素蛋白酶途徑（UPP）中發(fā)揮重要作用。

泛素結(jié)合酶E2 由一個(gè)高度保守的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（UBCc）和末端組成，根據(jù)不同的末端可將UBC 基因家族分成4 個(gè)亞族［2～3］，Ⅰ類只有UBCc結(jié)構(gòu)域，可降解短命蛋白或泛素化異常蛋白；Ⅱ類具有UBCc 結(jié)構(gòu)域和C-末端，后者可識(shí)別E3 和靶蛋白；Ⅲ類具有UBCc 結(jié)構(gòu)域和N-末端；Ⅳ類除UBCc結(jié)構(gòu)域外同時(shí)具有C-末端和N-末端，N-末端結(jié)構(gòu)功能尚不清楚。末端序列的差異使得真核生物中E2 基因家族的功能具有多樣性。E2 主要參與植物的脅迫響應(yīng)、生長(zhǎng)發(fā)育和DNA 損傷修復(fù)等生理過程［4］。植物的脅迫響應(yīng)研究主要是干旱、高低溫、鹽脅迫以及激素脅迫研究。擬南芥AtUBC22 突變體表達(dá)了與植物防御相關(guān)的基因，表明UBC22在植物發(fā)育和脅迫反應(yīng)中具有多種功能［5］。馬鈴薯StUBC12 在干旱和鹽脅迫下上調(diào)表達(dá)，提高了植株的抗逆性［6］。大豆GmUBC13 基因在干旱、高鹽、低溫和ABA 等脅迫下表達(dá)量升高，在煙草中過表達(dá)GmUBC13 可以提高植株的抗旱性［7］。在擬南芥中過表達(dá)綠豆VrUBC1 基因可以提高植株對(duì)干旱脅迫的耐受性［8］。龍葵SorUBC 基因參與干旱、高溫、低溫、鹽等非生物脅迫的早期響應(yīng)［9］。在蒜介茄中，葉片和根中的SsUBC基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng)不同，高溫、干旱、鎘、ABA 誘導(dǎo)葉片中SsUBC 基因上調(diào)表達(dá)，而在根中該基因在干旱脅迫下呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)［10］。菜心BclUBE2基因參與低溫脅迫的響應(yīng)過程［11］。除此之外，E2還參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程，如花期、光周期、木質(zhì)部形成等。荔枝LcUBC12 基因在烯效唑處理下對(duì)花穗發(fā)育具有負(fù)調(diào)控作用［12］。Xu 等發(fā)現(xiàn)在擬南芥中泛素結(jié)合酶UBC34以光依賴的方式調(diào)控蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（Sucrose Transporter 2，SUC2）的轉(zhuǎn)化率，并調(diào)控SUC 提高植物的生產(chǎn)力［13］。Zheng 等［14］發(fā)現(xiàn)毛白楊泛素結(jié)合酶PtoUBC34 與木質(zhì)素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄抑制因子PtoMYB221 和Pto?MYB156 相互作用，參與轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，并發(fā)現(xiàn)PtoUBC34 受鹽和熱激誘導(dǎo)。在E2 基因家族中，RAD6/UBC2 蛋白的研究較為深入，大量研究表明，酵母UBC2 蛋白即RAD6 具有多種功能，在DNA 損傷修復(fù)、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、染色質(zhì)加工等過程發(fā)揮關(guān)鍵作用［15］。在人基因組中也鑒定到兩個(gè)RAD6 同源基因HHR6A 和HHR6B，它們同樣具有DNA 損傷修復(fù)的功能［16］。擬南芥中Rad6 同源基因有3 個(gè)，AtUBC1、AtUBC2、AtUBC3，前兩者參與組蛋白H2B 的單泛素化并通過上調(diào)FLC 相關(guān)基因的表達(dá)抑制開花，在酵母實(shí)驗(yàn)中AtUBC2能夠部分恢復(fù)酵母突變體對(duì)UV 照射的敏感性和降低其在高溫條件下的生長(zhǎng)速度［17～19］。Carsten 等發(fā)現(xiàn)一種SUMO-E2 酶UBC9 參與DNA 合成和修復(fù)［20］。水稻RE2 可以參與苯丙類化合物的合成代謝對(duì)UV 輻射 進(jìn)行 防 護(hù)［21］。另 外，Song 等［22］和Nong等［23］的研究表明E2 基因可作為內(nèi)參基因進(jìn)行基因表達(dá)研究。

橡膠草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）是原產(chǎn)于哈薩克斯坦和中國(guó)新疆的多年生草本植物，其根部富含優(yōu)質(zhì)的天然橡膠，是極具研究和開發(fā)潛力的產(chǎn)膠作物。目前，相關(guān)研究主要集中在天然橡膠合成相關(guān)基因的分子機(jī)制研究［24］、遺傳轉(zhuǎn)化［25］和組織培養(yǎng)等技術(shù)開發(fā)［26］。有關(guān)抗性基因的研究較少，而抗性基因的篩選和克隆將為橡膠草的遺傳改良和抗性基因工程育種奠定基礎(chǔ)。本研究克隆到橡膠草泛素結(jié)合酶TkUBC2基因，并對(duì)其基因與蛋白序列的結(jié)構(gòu)特征和表達(dá)模式進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究橡膠草E2 基因的功能、選育抗逆品系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為橡膠草品系1151 組培苗，定植在實(shí)驗(yàn)室人工氣候箱。在盛花期同時(shí)取植株的根、葉、花和花梗，用液氮速凍，保存于-80℃超低溫冰箱，用于TkUBC2 的克隆和不同組織的表達(dá)分析。組培苗移栽在人工氣候箱經(jīng)水培培養(yǎng)2個(gè)月，取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株將其根部分別浸泡在15%PEG6000、250 mmol·L-1甘 露 醇（Mannitol）、300 mmol·L-1NaCl、200 μmol·L-1茉莉酸甲酯（MeJA）、10 μmol·L-1脫落酸（ABA）、1%（v/v）乙烯利（ET）溶液中進(jìn)行處理，在處理后0、6、12、24、48、72 h 分別取其葉片，樣品用液氮速凍，用于非生物脅迫和激素誘導(dǎo)下基因的表達(dá)模式分析。組培苗放在紫外燈下進(jìn)行UV（40 μW·cm-2）處理，分別于處理后0、0.5、2、6、12、24 h取其葉片，用于UV輻射下基因的表達(dá)模式分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1總RNA的提取和cDNA的合成

橡膠草不同組織（根、葉、花、花梗）和處理樣品（葉片）的總RNA 采用多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)濃度與純度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，購(gòu)于賽默飛世爾公司）合成得到cDNA，具體步驟參照說明書進(jìn)行。

1.2.2基因編碼區(qū)的克隆

用擬南芥AtUBC2（Arabidopsis thaliana，NP_565289）的氨基酸序列對(duì)橡膠草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行tBlastn 搜索，獲得橡膠草UBC2 的DNA 序列，參照轉(zhuǎn)錄組搜索獲得的序列設(shè)計(jì)引物（見表1），以橡膠草品系1151 葉片的cDNA 為模板，用Premix TaqTM（Ex TaqTMVersion 2.0）（Takara）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系：cDNA 模板1 μL（30 ng），2×Premix Taq Mix 10 μL，正向和反向引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，ddH2O 8 μL，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，目的片段采用凝膠回收試劑盒（OMEGA，E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit）進(jìn)行回收，并連接到pMD-18T（Takara）載體上轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進(jìn)行克隆，菌落PCR檢測(cè)后挑取陽(yáng)性單克隆送廣州艾基生物技術(shù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2 .3 生物信息學(xué)分析

通過NCBI 網(wǎng)站的ORF Fider（https：//www.nc?bi.nlm.nih.gov/orffinder/）在線分析確定TkUBC2 基因的ORF及其編碼氨基酸序列，在NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中采用BLASTp（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索TkUBC2 蛋白序列的同源性序列。采用DNAMAN 軟件對(duì)多序列同源性和相似性進(jìn)行分析。采用MEGA7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用ProtParam 工具（https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)TkUBC2 的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化特性分析。采用SignalP-5.0 Server、TMHMM Serverv.2.0、NetPhos 3.1 Server 和PSIPRED V4.0 等 在 線 分 析 工具分別分析預(yù)測(cè)TkUBC2 的信號(hào)肽、跨膜蛋白結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域。

表1 TkUBC2全長(zhǎng)擴(kuò)增和qRT-PCR分析引物序列Table 1 Primer sequences used in cloning the full-length of TkUBC2 and qRT-PCR analysis

1.2.4熒光定量qRT-PCR分析

根據(jù)TkUBC2 基因序列設(shè)計(jì)qRT-PCR 引物（見表1），以橡膠草TkActin 基因?yàn)閮?nèi)參，采用SYBR Green 法進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為2×SYBR Premix Ex TaqTMMix（Takara）10 μL，正向與反向引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，cDNA 1 μL（30 ng），ddH2O 8.2 μL，在熒光定量PCR 儀（CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System，Bio-Rad）上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)CT值用2-△△CT計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析，用SAS 軟件（The SAS System for Windows V8）進(jìn) 行 單因 素ANOVA 完全隨機(jī)（均衡）分析差異顯著性，采用Origin Pro 2019（Origin Lab Corporation，Massachu?setts，USA）軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 TkUBC2的克隆與序列分析

以橡膠草1151 葉片為材料，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以引物TkUBC2-F 和TkUBC2-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增得到目的片段，經(jīng)克隆后測(cè)序驗(yàn)證，獲得橡膠草TKUBC2 基因序列，長(zhǎng)度為706 bp，包含一個(gè)459 bp的開放閱讀框（ORF），編碼152個(gè)氨基酸（見圖1）。采用ProtParam 工具對(duì)其編碼蛋白分析發(fā)現(xiàn)，TkUBC2 蛋白相對(duì)分子量為37.97 kDa，等電點(diǎn)5.23，親水性0.805，不穩(wěn)定指數(shù)為33.03，表明該蛋白是穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。通過SignalP-5.0 Server、TMHMM Serverv.2.0、NetPhos 3.1 Server和PSIPRED V4.0在線分析，表明TkUBC2 無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，含有7 個(gè)絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)，5 個(gè)蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)，4 個(gè)酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)，可能定位于細(xì)胞核中。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)有38.82%α-螺旋，3.29%β-轉(zhuǎn)角，17.76%延長(zhǎng)鏈，40.13%無(wú)規(guī)則卷曲（見圖2A），表明TkUBC2 的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲；由二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步卷曲、折疊形成三級(jí)結(jié)構(gòu)（見圖2B）。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)如圖2C所示，該蛋白有一個(gè)高度保守的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（UBCc），屬于泛素結(jié)合酶E2家族成員。

2.2 同源性及進(jìn)化樹分析

將TkUBC2的氨基酸序列輸入NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTp 搜索，找到其他物種的同源蛋白，通過DNAMAN 進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果表明，UBC2 在不同物種間具有很高的同源性，橡膠草TkUBC2 與 萵 苣LsUBC2（Lactuca sativa，XP_023744018）、絨毛煙草NtUBC2（Nicotiana tomento?siformis，XP_009589859）的同源性都達(dá)到99.34%；其次是與洋薊CsUBC2（Cynara cardunculus var.Scolymus，XP_024978185）、向日葵HaUBC2（Heli?anthus annuus，XP_022012684）的 同 源 性 達(dá) 到98.68%；與 本 生 煙NbUBC2（Nicotiana benthami?ana，AOF39395）、大豆GmUBC2（Glycine max，NP_001235621）、擬南芥AtUBC2（Arabidopsis thaliana，NP_565289）的同源性分別為98.04%、98.03%、96.05%（見圖3A）。進(jìn)一步采用MEGA7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，8個(gè)UBC蛋白可以劃分為兩個(gè)分支，其中NtUBC2、CsUBC2、NbUBC2、GmUBC2 和AtUBC2 聚在同一個(gè)分支上，而橡膠草TkUBC2 與萵苣LsUBC2、向日葵HaUBC2聚在另一分支上（見圖3B），它們?cè)诜诸惿贤瑢儆诰湛浦参铮砻鱑BC2在同科植物中的保守性更高。

2.3 橡膠草TkUBC2基因的表達(dá)模式分析

為了揭示TkUBC2 基因的功能，我們采用qRT-PCR 技術(shù)對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行系統(tǒng)分析。如圖4A 所示，TkUBC2 在橡膠草盛花期的葉、根、花和花梗中均有表達(dá)，且不同組織中的表達(dá)水平差異顯著，其中花梗中的表達(dá)量最低，葉中的表達(dá)量最高，是花梗的3倍。如圖4B所示，TkUBC2在UV輻射處理下呈現(xiàn)明顯地上調(diào)表達(dá)，12 h 的表達(dá)量達(dá)到未處理對(duì)照的2 倍。結(jié)果表明TkUBC2 與橡膠草適應(yīng)UV 輻射脅迫有關(guān)。進(jìn)一步地，以不同非生物脅迫和激素處理后橡膠草葉片為材料，系統(tǒng)地分析TkUBC2 在脅迫響應(yīng)和激素信號(hào)傳導(dǎo)中的作用。在PEG6000 模擬干旱脅迫、甘露醇介導(dǎo)的滲透壓脅迫以及植物激素MeJA 處理后TkUBC2基因顯著下調(diào)表達(dá)，且均在處理后12 h 降到最低水平，其中PEG6000 處理下降了70%、甘露醇處理下降了60%、MeJA 處理下降了50%，然后逐步恢復(fù)到未處理時(shí)的表達(dá)水平。在NaCl 高鹽脅迫下TkUBC2 基因表達(dá)量在12 h 上調(diào)1.5 倍，在48 h 恢復(fù)到未處理時(shí)的表達(dá)水平，但在72 h 又上調(diào)1.5倍。在ABA 和ET 誘導(dǎo)下，TkUBC2 基因表達(dá)量先下降后上升，分別在處理后12 h 和24 h 下降至最低值，同時(shí)都是在72 h 顯著升高且達(dá)到最高值（見圖5）以上結(jié)果表明，TkUBC2基因廣泛地參與橡膠草對(duì)干旱、滲透壓、高鹽脅迫的響應(yīng)以及乙烯、茉莉酸和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

3 討論

泛素結(jié)合酶UBC/E2 是泛素—蛋白酶體途徑（UPP）的關(guān)鍵酶。本研究從橡膠草中克隆的TkUBC2 基因，其編碼的氨基酸序列與同為菊科的萵苣和向日葵高度相似，氨基酸序列間的相似性達(dá)99.34%和98.68%，表明E2 酶蛋白在物種間具有很高的保守性。蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，TkUBC2只有一個(gè)UBCc結(jié)構(gòu)域，屬于UBC基因家族中的Ⅰ亞族，可直接降解短命蛋白或已被泛素化的異常蛋白。通過qRT-PCR 技術(shù)分析TkUBC2 基因的表達(dá)模式，結(jié)果顯示，該基因在各組織中均有表達(dá)且差異顯著，其中花梗中的表達(dá)量最低，葉中的表達(dá)量最高。尹麗娟等［27］發(fā)現(xiàn)小麥TaE2 基因在小麥根、莖、葉和種子中均有表達(dá)，且表達(dá)量一致；蔡佳文等［9］發(fā)現(xiàn)龍葵SorUBC 基因在龍葵根、莖、葉、花和果實(shí)中均有表達(dá)，在葉和果實(shí)中表達(dá)量最高；曾小玲等［11］發(fā)現(xiàn)菜心BclUBE2 基因在根、莖、葉和葉柄中也均有表達(dá)，在葉中的表達(dá)量最高；安紅強(qiáng)等［28］發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛DoUBC24基因在葉中得表達(dá)量最低。這些結(jié)果表明，泛素結(jié)合酶E2基因在不同器官中均有表達(dá)，不同物種間存在組織表達(dá)特異性。

大量的研究表明，泛素結(jié)合酶E2 基因與植物的抗逆性相關(guān)。比如，小麥TaE2 基因在干旱、高鹽和ABA 脅迫下均上調(diào)表達(dá)，參與逆境脅迫響應(yīng)［27］；龍葵SorUBC 基因在高低溫和干旱等非生物脅迫下呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)［9］；大豆GmUBC2基因受干旱和鹽脅迫后上調(diào)表達(dá)，在擬南芥中過表達(dá)GmUBC2 可提高非生物脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)從而提高植株對(duì)干旱和鹽脅迫的抗性［29］；花生AhUBC2基因轉(zhuǎn)入擬南芥后受PEG6000、高鹽、ABA 和低溫脅迫誘導(dǎo)，且該基因能通過不依賴ABA 信號(hào)通路提高植株的耐旱性［30］；甜瓜CmUBC 基因在干旱和鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄水平升高［31］。本研究中，橡膠草在PEG6000 模擬干旱、甘露醇介導(dǎo)的滲透壓脅迫處理后，TkUBC2 基因顯著下調(diào)表達(dá)；而NaCl 高鹽脅迫處理下，TkUBC2上調(diào)表達(dá)，表明TkUBC2對(duì)不同脅迫的響應(yīng)機(jī)制不同，脅迫條件下TkUBC2蛋白可能通過對(duì)不同響應(yīng)蛋白的泛素化修飾間接參與植物對(duì)脅迫條件的反應(yīng)過程。TkUBC2 經(jīng)ABA 誘導(dǎo)的早期（0～12 h）表達(dá)模式與其在干旱、滲透壓脅迫下的表達(dá)模式類似，而在ABA 誘導(dǎo)的后期（48～72 h）表達(dá)模式與其在高鹽脅迫下的表達(dá)模式類似，表明TkUBC2 受ABA 誘導(dǎo)且能不依賴于ABA信號(hào)通路參與逆境脅迫響應(yīng)過程，其參與調(diào)控的信號(hào)通路通過修飾的靶蛋白決定。除此之外，Me?JA 可誘導(dǎo)TkUBC2 下調(diào)表達(dá)，而ET 誘導(dǎo)下，TkUBC2 表達(dá)量先下降后上升。UV 輻射會(huì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生一些與脅迫相關(guān)的生理反應(yīng)，如DNA 損傷［32］。UV-B和UV-C都會(huì)直接與DNA堿基反應(yīng)產(chǎn)生光離子，阻礙DNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄［33～35］。在UV 輻射處理下，TkUBC2 呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，在12 h 開始上調(diào)表達(dá)，說明該基因?qū)ο鹉z草DNA 損傷修復(fù)具有正調(diào)控作用。賴燕等［36］在辣椒中的研究表明E2 基因與辣椒適應(yīng)UV-B 照射脅迫有關(guān)。橡膠樹HbRad6 在DNA 損傷劑H2O2處理下呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)并且能夠部分恢復(fù)酵母rad6 突變體對(duì)UV 的敏感性，表明其參與DNA 損傷修復(fù)過程［37］。本研究結(jié)果表明TkUBC2 廣泛參與橡膠草對(duì)多種脅迫響應(yīng)和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，對(duì)DNA 損傷修復(fù)具有積極的作用，為進(jìn)一步闡明TkUBC2在橡膠草抗逆反應(yīng)和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的功能打下基礎(chǔ)。