多糖部分降解產(chǎn)物在板藍(lán)根顆粒多糖成分分析中的應(yīng)用

張建，盧凱，石晶，郭懷忠

(河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北省藥物質(zhì)量分析控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002)

板藍(lán)根顆粒作為傳統(tǒng)中藥制劑，生產(chǎn)廠家眾多，其處方為板藍(lán)根單味藥材，主要經(jīng)水提醇沉工藝，并加入適量蔗糖粉和糊精制粒而得，但其藥效物質(zhì)尚無定論.板藍(lán)根顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于2015年版《中華人民共和國藥典》一部[1]，僅見氨基酸類成分的薄層鑒別，缺乏專屬性指標(biāo)成分的定性、定量方法，無法有效對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制，而文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)靛藍(lán)、靛玉紅[2]、氨基酸[3]、腺苷[4]和表告依春[5]等成分進(jìn)行測定來控制板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量.靛藍(lán)、靛玉紅屬脂溶性成分，水提工藝不易提取，且其藥理作用與板藍(lán)根顆粒主要功效不符[6]，而氨基酸和腺苷的專屬性低，表告依春有時(shí)又含量較低甚至不能檢出[7].從生產(chǎn)工藝考慮，該制劑中應(yīng)含有一定量的多糖成分.有研究表明，板藍(lán)根多糖具有抗菌、抗病毒[8]和免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理作用[9]，符合板藍(lán)根顆粒的功效，但僅見陳吉業(yè)等[6]對(duì)板藍(lán)根顆粒中多糖的單糖組成和含量進(jìn)行了測定.近年來，多糖成為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的重要對(duì)象[10]，然而多糖因相對(duì)分子質(zhì)量大、結(jié)構(gòu)特征復(fù)雜導(dǎo)致其分析困難，而其部分降解產(chǎn)物不僅具有生物活性，并且可反映原多糖的結(jié)構(gòu)特征.李曉霞等[11]采用內(nèi)切-1，4-β-半乳聚糖酶將黃芪多糖進(jìn)行部分降解，通過熒光輔助糖電泳(FACE)獲得了多糖部分降解產(chǎn)物指紋圖譜，利用糖片段的組成差異實(shí)現(xiàn)了不同種質(zhì)黃芪的鑒定；Jing等[12]采用PMP柱前衍生高效液相色譜法建立了金針菇子實(shí)體多糖部分降解產(chǎn)物指紋圖譜，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法評(píng)價(jià)了不同來源金針菇子實(shí)體多糖的質(zhì)量；本課題組利用多糖部分降解產(chǎn)物特征，也探討了易混中藥材的鑒定[13-14]，但采用多糖部分降解產(chǎn)物對(duì)板藍(lán)根顆粒等中藥制劑的分析尚未見報(bào)道.

糖化酶[15]即葡萄糖淀粉酶(glucoamylase EC3.2.1.3)，主要作用是在糖鏈的非還原端裂解α-1，4糖苷鍵，水解淀粉、糊精等，同時(shí)可保證中藥多糖的完整性，如黃芪多糖[16]、枸杞多糖[17]及蟲草多糖[18]等.本實(shí)驗(yàn)首先利用糖化酶去除板藍(lán)根顆粒中的輔料糊精，所得板藍(lán)根多糖部分降解后采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(CZE)測定，對(duì)照板藍(lán)根藥材相應(yīng)譜圖，通過對(duì)顆粒劑譜圖的分析實(shí)現(xiàn)了板藍(lán)根顆粒的有效鑒別，并結(jié)合聚類分析(CA)從多糖及其部分降解產(chǎn)物角度對(duì)14個(gè)廠家的24批次產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，論證了多糖部分降解產(chǎn)物在中藥制劑多糖類成分定性分析中應(yīng)用的可行性.

1 儀器與試劑

1.1 儀器

CL1020型高效毛細(xì)管電泳儀(北京彩陸科學(xué)儀器有限公司)；未涂層彈性石英毛細(xì)管柱(河北永年銳灃色譜器件有限公司)；ZD-85型氣浴恒溫振蕩器(常州市國旺儀器制造有限公司)；BT25S型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；pHS-3C型酸度計(jì)(上海理達(dá)儀器廠).

1.2 試劑

D-半乳糖(Gal，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%)、D-甘露糖(Man，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%)和D-阿拉伯糖(Ara，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%)對(duì)照品均購自北京索萊寶科技有限公司；L-鼠李糖(Rha，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%)對(duì)照品購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；D-木糖(Xyl，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%)對(duì)照品購自保定市化工二廠；D-葡萄糖(Glu，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%)對(duì)照品購自天津市福晨化學(xué)試劑廠；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%)購自日照力德士化工有限公司；糖化酶(BR級(jí)，100 U/mg，最適溫度58～65 ℃，最適pH值4.2～4.6)購自上海藍(lán)季生物科技有限公司；其余試劑均為分析純.

板藍(lán)根顆粒均為市售，編號(hào)S1～S24(表1，其中S1規(guī)格5 g/袋，其余規(guī)格10 g/袋)；板藍(lán)根藥材經(jīng)河北大學(xué)藥學(xué)院徐紅欣老師鑒定為十字花科植物菘藍(lán)IsatisindigoticaFort.的干燥根.

表1 板藍(lán)根顆粒樣品的生產(chǎn)廠家和批號(hào)

2 方法與結(jié)果

2.1 電泳條件

色譜柱：未涂層彈性石英毛細(xì)管柱(70 cm×50 μm i.d，有效長度61 cm)；運(yùn)行緩沖液：40 mmol/L硼砂緩沖液(pH 10.1)；檢測波長：245 nm;運(yùn)行電壓：17 kV；進(jìn)樣量：重力進(jìn)樣10 cm×15 s；柱溫：室溫.

2.2 樣品溶液制備

取板藍(lán)根顆粒適量，研勻，精密稱取1.0 g，加入20 mL醋酸鈉緩沖液(pH 4.5)，按料-酶液比(g∶mL)5∶8加入糖化酶溶液(10 000 U/mL)1.6 mL，密閉，60 ℃恒溫振蕩1 h，沸水浴5 min對(duì)酶進(jìn)行滅活.以4 000 r/min離心5 min，取上清液加入一定量的乙醇(乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%)，靜置過夜.4 000 r/min離心5 min，取沉淀(必要時(shí)平行提取多份合并)用適量的體積分?jǐn)?shù)80%乙醇洗滌3次，熱水復(fù)溶并定容至10 mL，搖勻.

量取上述溶液2.0 mL，加入1 mol/L鹽酸溶液2.0 mL，使鹽酸濃度達(dá)到0.5 mol/L，溫度80 ℃，降解4 h，放冷，10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至中性，移至5 mL量瓶中，加入0.2 mL硫脲溶液(內(nèi)標(biāo)，5 mg/mL)，水定容，搖勻，得多糖部分降解液.

精密量取0.2 mL降解液，依次加入0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液0.1 mL和0.5 mol/L的PMP甲醇溶液(衍生試劑)0.1 mL，70 ℃恒溫反應(yīng)0.5 h進(jìn)行衍生，放冷，加入0.3 mol/L鹽酸溶液0.1 mL中和，再加入三氯甲烷1 mL，渦旋混勻，4 000 r/min離心3 min，取上清液，12 000 r/min離心3 min，即得.

2.3 對(duì)照品溶液制備

稱取Xyl、Ara、Glu、Rha、Man和Gal對(duì)照品各0.05 g，置50 mL量瓶中，水溶解并定容，搖勻，制得1 mg/mL的6種單糖混合對(duì)照品溶液.量取2.0 mL置于5 mL量瓶中，加入0.2 mL硫脲溶液，水定容，搖勻.精密量取上述已加入內(nèi)標(biāo)的單糖混合對(duì)照品溶液0.2 mL，按照“2.2”方法進(jìn)行衍生，即得.

2.4 板藍(lán)根顆粒多糖部分降解產(chǎn)物CZE圖譜的測定及定性分析

將上述樣品溶液和單糖對(duì)照品溶液按照“2.1”項(xiàng)的電泳條件進(jìn)行CZE測定.14個(gè)廠家板藍(lán)根顆粒樣品測定譜圖見圖1，板藍(lán)根藥材相應(yīng)譜圖和單糖對(duì)照品譜圖見圖2.通過分別添加單一單糖對(duì)照品，依據(jù)相應(yīng)峰面積的變化和遷移時(shí)間，確定出樣品譜圖中各單糖峰的歸屬.由此可以看出峰序號(hào)1～16為低聚糖成分，17～22為單糖成分，分別為Xyl、Ara、Glu、Rha、Man、Gal.不同廠家產(chǎn)品低聚糖峰差別明顯，反映出產(chǎn)品質(zhì)量差異較大，而單糖組成相對(duì)穩(wěn)定，但只利用單糖鑒別中藥專屬性差.因此本文利用板藍(lán)根顆粒中多糖部分降解產(chǎn)物圖譜所具有的特征性，以板蘭根藥材相應(yīng)譜圖為對(duì)照，從低聚糖和單糖上進(jìn)行比對(duì)，可實(shí)現(xiàn)板藍(lán)根顆粒的鑒別，既保證了鑒別的專屬性，又體現(xiàn)出單糖組成的穩(wěn)定性，可較全面反映多糖類成分的定性信息.同時(shí)基于各譜圖峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的大小可以看出，樣品之間多糖含量差異明顯，從多糖成分多寡上體現(xiàn)出板藍(lán)根顆粒質(zhì)量參差不齊，提示其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)亟待完善.

0.內(nèi)標(biāo)；1～16.低聚糖；17.木糖；18.阿拉伯糖；19.葡萄糖；20.鼠李糖；21.甘露糖；22.半乳糖.圖1 14個(gè)廠家板藍(lán)根顆粒多糖部分降解產(chǎn)物的CZE譜Fig.1 CZE spectra of partial degradation products of polysaccharide from Banlangen Granules of 14 manufacturers

0.內(nèi)標(biāo)；1～16.低聚糖；17.木糖；18.阿拉伯糖；19.葡萄糖；20.鼠李糖；21.甘露糖；22.半乳糖.圖2 板藍(lán)根多糖部分降解產(chǎn)物(a)、單糖對(duì)照品溶液(b)的CZE譜Fig.2 CZE spectra of partial degradation products of R. isatidis polysaccharide (a) and monosaccharide standards(b) derivatization solutions.

2.5 方法學(xué)考察

圖3 板藍(lán)根顆粒的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of Banlangen Granules

取板藍(lán)根顆粒(編號(hào)S5)，按照上述方法制備供試品并測定，計(jì)算各降解產(chǎn)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD，其中精密度為1.8%～4.6%(n=5)，重復(fù)性為1.3%～4.9%(n=5)，12 h內(nèi)穩(wěn)定性的RSD為2.9%～5.1%，各項(xiàng)結(jié)果符合要求.

2.6 板藍(lán)根顆粒的聚類分析

采用SPSS 20.0軟件，參考板藍(lán)根藥材譜圖，選取板藍(lán)根顆粒譜圖中的相應(yīng)峰，取峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為變量，選用組間連接法，以夾角余弦為測度進(jìn)行聚類分析.由聚類結(jié)果(圖3)可知，同一廠家產(chǎn)品可很好地聚為一類，表明批次之間并無明顯差異，能反映出質(zhì)量的真實(shí)狀況.板藍(lán)根顆?？梢跃蹫?類，其中樣品S1、S2、S3、S4、S5為一類，樣品S11、S12、S16為一類，其余樣品聚為一類.觀察各樣品色譜圖和峰面積比值可發(fā)現(xiàn)，S1、S2、S3、S4、S5在低聚糖和單糖含量上都具有較高的表現(xiàn)，因此歸為一類.S11、S12、S16雖在低聚糖成分上較低，但單糖含量上具有高度相似性，可聚為一類.提示多糖含量的差異可能是造成不同廠家產(chǎn)品療效差異的原因之一，也提示各廠家所使用板藍(lán)根藥材的質(zhì)量和生產(chǎn)工藝可能存在顯著差異.

3 討論

3.1 糖化酶法去除糊精條件優(yōu)化

板藍(lán)根顆粒中所含輔料為糖類輔料，雖然參照文獻(xiàn)[19]在料液比為(g∶mL)1∶18時(shí)，使用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液進(jìn)行醇沉、離心后棄去上清液可有效排除蔗糖的影響，但難以去除糊精的干擾.因此本文在考察了糖化酶對(duì)板藍(lán)根多糖基本不具有酶解作用后，首先以板藍(lán)根多糖全降解[20]后葡萄糖的含量為指標(biāo)并參考其他單糖的含量優(yōu)化酶解條件，利用糖化酶去除糊精，得到最優(yōu)酶解條件為料-酶液比(g∶mL)5∶8、酶解時(shí)間1 h.

3.2 板藍(lán)根多糖部分降解條件優(yōu)化

對(duì)影響板藍(lán)根多糖部分降解效果較大的因素包括鹽酸濃度、降解溫度和降解時(shí)間進(jìn)行考察，選擇低聚糖峰數(shù)目及低聚糖峰面積之和與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià).從優(yōu)化結(jié)果中可以看出，每個(gè)因素中都出現(xiàn)了低聚糖峰數(shù)目和峰面積比值先增加后減少的趨勢.綜合考慮，板藍(lán)根多糖部分降解的最優(yōu)條件為鹽酸濃度0.5 mol/L，溫度80 ℃，時(shí)間4 h.

同時(shí)，對(duì)堿性電泳條件下PMP糖衍生物的分離機(jī)制也進(jìn)行了一定探討.根據(jù)PMP衍生醛糖的機(jī)理，1個(gè)醛糖可衍生2個(gè)PMP分子[21]，但C-2、C-3位羥基為順式結(jié)構(gòu)的單糖，如甘露糖,只能與1個(gè)PMP成環(huán)而存在烯醇互變結(jié)構(gòu)[22]，堿性條件下烯醇基解離，提升了帶負(fù)電荷能力；而C-2、C-3位羥基為反式結(jié)構(gòu)的單糖(如葡萄糖)能與2個(gè)PMP成環(huán)，對(duì)其帶負(fù)電荷能力提升幅度較小.由此推知，C-2、C-3位羥基順式的單糖衍生物比C-2、C-3位羥基反式的單糖衍生物負(fù)電性大，得到葡萄糖先于甘露糖出峰，與實(shí)際測定情況一致.同時(shí)在堿性條件下糖衍生物與硼酸根離子具有絡(luò)合作用，推測由于低聚糖具有較長的糖鏈，鏈的彎曲纏繞會(huì)阻礙其結(jié)構(gòu)上鄰羥基與硼酸根離子的絡(luò)合，使其負(fù)電性低于單糖，因此低聚糖遷移時(shí)間短于單糖.而這種阻礙作用與鏈長呈正相關(guān)，即聚合度越大，則絡(luò)合越弱，帶負(fù)電的荷質(zhì)比越小則先出峰，故聚合度排列順序應(yīng)為由大至小，相關(guān)問題尚待更深入地探討.

另外，為了更全面考察板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量，并嘗試驗(yàn)證板藍(lán)根多糖部分降解產(chǎn)物測定結(jié)果反映出的該制劑的質(zhì)量差異問題，筆者還采用CZE法對(duì)所有樣品中的小分子化合物進(jìn)行了指紋圖譜測定，并參考板藍(lán)根顆粒藥典標(biāo)準(zhǔn)，運(yùn)用薄層色譜法對(duì)其氨基酸成分進(jìn)行了分析.結(jié)果表明，3個(gè)方面測定所反映的板藍(lán)根顆粒質(zhì)量差異情況整體趨勢吻合，進(jìn)一步證明了多糖部分降解產(chǎn)物在板藍(lán)根顆粒多糖類成分質(zhì)量分析中應(yīng)用的可行性.

4 結(jié)論

本文在去除了板藍(lán)根顆粒中輔料蔗糖和糊精干擾的基礎(chǔ)上，采用CZE法測定了板藍(lán)根多糖的部分降解產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)了該制劑的有效鑒別，并結(jié)合聚類分析，完善了其質(zhì)量控制，并發(fā)現(xiàn)不同廠家板藍(lán)根顆粒多糖類成分含量差異顯著.該方法專屬性強(qiáng)，并對(duì)其他中藥制劑多糖類成分的分析具有一定的參考價(jià)值.本文也為該制劑的質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)提供了更多依據(jù).