多糖部分降解產物在板藍根顆粒多糖成分分析中的應用

張建，盧凱，石晶，郭懷忠

(河北大學 藥學院，河北省藥物質量分析控制重點實驗室，河北 保定 071002)

板藍根顆粒作為傳統(tǒng)中藥制劑，生產廠家眾多，其處方為板藍根單味藥材，主要經水提醇沉工藝，并加入適量蔗糖粉和糊精制粒而得，但其藥效物質尚無定論.板藍根顆粒質量標準收載于2015年版《中華人民共和國藥典》一部[1]，僅見氨基酸類成分的薄層鑒別，缺乏專屬性指標成分的定性、定量方法，無法有效對其進行質量控制，而文獻報道對靛藍、靛玉紅[2]、氨基酸[3]、腺苷[4]和表告依春[5]等成分進行測定來控制板藍根顆粒的質量.靛藍、靛玉紅屬脂溶性成分，水提工藝不易提取，且其藥理作用與板藍根顆粒主要功效不符[6]，而氨基酸和腺苷的專屬性低，表告依春有時又含量較低甚至不能檢出[7].從生產工藝考慮，該制劑中應含有一定量的多糖成分.有研究表明，板藍根多糖具有抗菌、抗病毒[8]和免疫調節(jié)等廣泛的藥理作用[9]，符合板藍根顆粒的功效，但僅見陳吉業(yè)等[6]對板藍根顆粒中多糖的單糖組成和含量進行了測定.近年來，多糖成為中藥藥效物質基礎研究的重要對象[10]，然而多糖因相對分子質量大、結構特征復雜導致其分析困難，而其部分降解產物不僅具有生物活性，并且可反映原多糖的結構特征.李曉霞等[11]采用內切-1，4-β-半乳聚糖酶將黃芪多糖進行部分降解，通過熒光輔助糖電泳(FACE)獲得了多糖部分降解產物指紋圖譜，利用糖片段的組成差異實現了不同種質黃芪的鑒定；Jing等[12]采用PMP柱前衍生高效液相色譜法建立了金針菇子實體多糖部分降解產物指紋圖譜，并結合化學計量學方法評價了不同來源金針菇子實體多糖的質量；本課題組利用多糖部分降解產物特征，也探討了易混中藥材的鑒定[13-14]，但采用多糖部分降解產物對板藍根顆粒等中藥制劑的分析尚未見報道.

糖化酶[15]即葡萄糖淀粉酶(glucoamylase EC3.2.1.3)，主要作用是在糖鏈的非還原端裂解α-1，4糖苷鍵，水解淀粉、糊精等，同時可保證中藥多糖的完整性，如黃芪多糖[16]、枸杞多糖[17]及蟲草多糖[18]等.本實驗首先利用糖化酶去除板藍根顆粒中的輔料糊精，所得板藍根多糖部分降解后采用毛細管區(qū)帶電泳法(CZE)測定，對照板藍根藥材相應譜圖，通過對顆粒劑譜圖的分析實現了板藍根顆粒的有效鑒別，并結合聚類分析(CA)從多糖及其部分降解產物角度對14個廠家的24批次產品質量進行評價，論證了多糖部分降解產物在中藥制劑多糖類成分定性分析中應用的可行性.

1 儀器與試劑

1.1 儀器

CL1020型高效毛細管電泳儀(北京彩陸科學儀器有限公司)；未涂層彈性石英毛細管柱(河北永年銳灃色譜器件有限公司)；ZD-85型氣浴恒溫振蕩器(常州市國旺儀器制造有限公司)；BT25S型電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；pHS-3C型酸度計(上海理達儀器廠).

1.2 試劑

D-半乳糖(Gal，質量分數99.0%)、D-甘露糖(Man，質量分數99.0%)和D-阿拉伯糖(Ara，質量分數99.0%)對照品均購自北京索萊寶科技有限公司；L-鼠李糖(Rha，質量分數99.0%)對照品購自合肥博美生物科技有限責任公司；D-木糖(Xyl，質量分數99.0%)對照品購自保定市化工二廠；D-葡萄糖(Glu，質量分數99.0%)對照品購自天津市福晨化學試劑廠；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP，質量分數99.0%)購自日照力德士化工有限公司；糖化酶(BR級，100 U/mg，最適溫度58～65 ℃，最適pH值4.2～4.6)購自上海藍季生物科技有限公司；其余試劑均為分析純.

板藍根顆粒均為市售，編號S1～S24(表1，其中S1規(guī)格5 g/袋，其余規(guī)格10 g/袋)；板藍根藥材經河北大學藥學院徐紅欣老師鑒定為十字花科植物菘藍IsatisindigoticaFort.的干燥根.

表1 板藍根顆粒樣品的生產廠家和批號

2 方法與結果

2.1 電泳條件

色譜柱：未涂層彈性石英毛細管柱(70 cm×50 μm i.d，有效長度61 cm)；運行緩沖液：40 mmol/L硼砂緩沖液(pH 10.1)；檢測波長：245 nm;運行電壓：17 kV；進樣量：重力進樣10 cm×15 s；柱溫：室溫.

2.2 樣品溶液制備

取板藍根顆粒適量，研勻，精密稱取1.0 g，加入20 mL醋酸鈉緩沖液(pH 4.5)，按料-酶液比(g∶mL)5∶8加入糖化酶溶液(10 000 U/mL)1.6 mL，密閉，60 ℃恒溫振蕩1 h，沸水浴5 min對酶進行滅活.以4 000 r/min離心5 min，取上清液加入一定量的乙醇(乙醇體積分數為80%)，靜置過夜.4 000 r/min離心5 min，取沉淀(必要時平行提取多份合并)用適量的體積分數80%乙醇洗滌3次，熱水復溶并定容至10 mL，搖勻.

量取上述溶液2.0 mL，加入1 mol/L鹽酸溶液2.0 mL，使鹽酸濃度達到0.5 mol/L，溫度80 ℃，降解4 h，放冷，10 mol/L氫氧化鈉溶液調pH至中性，移至5 mL量瓶中，加入0.2 mL硫脲溶液(內標，5 mg/mL)，水定容，搖勻，得多糖部分降解液.

精密量取0.2 mL降解液，依次加入0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液0.1 mL和0.5 mol/L的PMP甲醇溶液(衍生試劑)0.1 mL，70 ℃恒溫反應0.5 h進行衍生，放冷，加入0.3 mol/L鹽酸溶液0.1 mL中和，再加入三氯甲烷1 mL，渦旋混勻，4 000 r/min離心3 min，取上清液，12 000 r/min離心3 min，即得.

2.3 對照品溶液制備

稱取Xyl、Ara、Glu、Rha、Man和Gal對照品各0.05 g，置50 mL量瓶中，水溶解并定容，搖勻，制得1 mg/mL的6種單糖混合對照品溶液.量取2.0 mL置于5 mL量瓶中，加入0.2 mL硫脲溶液，水定容，搖勻.精密量取上述已加入內標的單糖混合對照品溶液0.2 mL，按照“2.2”方法進行衍生，即得.

2.4 板藍根顆粒多糖部分降解產物CZE圖譜的測定及定性分析

將上述樣品溶液和單糖對照品溶液按照“2.1”項的電泳條件進行CZE測定.14個廠家板藍根顆粒樣品測定譜圖見圖1，板藍根藥材相應譜圖和單糖對照品譜圖見圖2.通過分別添加單一單糖對照品，依據相應峰面積的變化和遷移時間，確定出樣品譜圖中各單糖峰的歸屬.由此可以看出峰序號1～16為低聚糖成分，17～22為單糖成分，分別為Xyl、Ara、Glu、Rha、Man、Gal.不同廠家產品低聚糖峰差別明顯，反映出產品質量差異較大，而單糖組成相對穩(wěn)定，但只利用單糖鑒別中藥專屬性差.因此本文利用板藍根顆粒中多糖部分降解產物圖譜所具有的特征性，以板蘭根藥材相應譜圖為對照，從低聚糖和單糖上進行比對，可實現板藍根顆粒的鑒別，既保證了鑒別的專屬性，又體現出單糖組成的穩(wěn)定性，可較全面反映多糖類成分的定性信息.同時基于各譜圖峰面積與內標峰面積比值的大小可以看出，樣品之間多糖含量差異明顯，從多糖成分多寡上體現出板藍根顆粒質量參差不齊，提示其質量標準亟待完善.

0.內標；1～16.低聚糖；17.木糖；18.阿拉伯糖；19.葡萄糖；20.鼠李糖；21.甘露糖；22.半乳糖.圖1 14個廠家板藍根顆粒多糖部分降解產物的CZE譜Fig.1 CZE spectra of partial degradation products of polysaccharide from Banlangen Granules of 14 manufacturers

0.內標；1～16.低聚糖；17.木糖；18.阿拉伯糖；19.葡萄糖；20.鼠李糖；21.甘露糖；22.半乳糖.圖2 板藍根多糖部分降解產物(a)、單糖對照品溶液(b)的CZE譜Fig.2 CZE spectra of partial degradation products of R. isatidis polysaccharide (a) and monosaccharide standards(b) derivatization solutions.

2.5 方法學考察

圖3 板藍根顆粒的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of Banlangen Granules

取板藍根顆粒(編號S5)，按照上述方法制備供試品并測定，計算各降解產物峰面積與內標峰面積比值的RSD，其中精密度為1.8%～4.6%(n=5)，重復性為1.3%～4.9%(n=5)，12 h內穩(wěn)定性的RSD為2.9%～5.1%，各項結果符合要求.

2.6 板藍根顆粒的聚類分析

采用SPSS 20.0軟件，參考板藍根藥材譜圖，選取板藍根顆粒譜圖中的相應峰，取峰面積與內標峰面積比值為變量，選用組間連接法，以夾角余弦為測度進行聚類分析.由聚類結果(圖3)可知，同一廠家產品可很好地聚為一類，表明批次之間并無明顯差異，能反映出質量的真實狀況.板藍根顆?？梢跃蹫?類，其中樣品S1、S2、S3、S4、S5為一類，樣品S11、S12、S16為一類，其余樣品聚為一類.觀察各樣品色譜圖和峰面積比值可發(fā)現，S1、S2、S3、S4、S5在低聚糖和單糖含量上都具有較高的表現，因此歸為一類.S11、S12、S16雖在低聚糖成分上較低，但單糖含量上具有高度相似性，可聚為一類.提示多糖含量的差異可能是造成不同廠家產品療效差異的原因之一，也提示各廠家所使用板藍根藥材的質量和生產工藝可能存在顯著差異.

3 討論

3.1 糖化酶法去除糊精條件優(yōu)化

板藍根顆粒中所含輔料為糖類輔料，雖然參照文獻[19]在料液比為(g∶mL)1∶18時，使用體積分數80%乙醇溶液進行醇沉、離心后棄去上清液可有效排除蔗糖的影響，但難以去除糊精的干擾.因此本文在考察了糖化酶對板藍根多糖基本不具有酶解作用后，首先以板藍根多糖全降解[20]后葡萄糖的含量為指標并參考其他單糖的含量優(yōu)化酶解條件，利用糖化酶去除糊精，得到最優(yōu)酶解條件為料-酶液比(g∶mL)5∶8、酶解時間1 h.

3.2 板藍根多糖部分降解條件優(yōu)化

對影響板藍根多糖部分降解效果較大的因素包括鹽酸濃度、降解溫度和降解時間進行考察，選擇低聚糖峰數目及低聚糖峰面積之和與內標峰面積的比值為指標進行綜合評價.從優(yōu)化結果中可以看出，每個因素中都出現了低聚糖峰數目和峰面積比值先增加后減少的趨勢.綜合考慮，板藍根多糖部分降解的最優(yōu)條件為鹽酸濃度0.5 mol/L，溫度80 ℃，時間4 h.

同時，對堿性電泳條件下PMP糖衍生物的分離機制也進行了一定探討.根據PMP衍生醛糖的機理，1個醛糖可衍生2個PMP分子[21]，但C-2、C-3位羥基為順式結構的單糖，如甘露糖,只能與1個PMP成環(huán)而存在烯醇互變結構[22]，堿性條件下烯醇基解離，提升了帶負電荷能力；而C-2、C-3位羥基為反式結構的單糖(如葡萄糖)能與2個PMP成環(huán)，對其帶負電荷能力提升幅度較小.由此推知，C-2、C-3位羥基順式的單糖衍生物比C-2、C-3位羥基反式的單糖衍生物負電性大，得到葡萄糖先于甘露糖出峰，與實際測定情況一致.同時在堿性條件下糖衍生物與硼酸根離子具有絡合作用，推測由于低聚糖具有較長的糖鏈，鏈的彎曲纏繞會阻礙其結構上鄰羥基與硼酸根離子的絡合，使其負電性低于單糖，因此低聚糖遷移時間短于單糖.而這種阻礙作用與鏈長呈正相關，即聚合度越大，則絡合越弱，帶負電的荷質比越小則先出峰，故聚合度排列順序應為由大至小，相關問題尚待更深入地探討.

另外，為了更全面考察板藍根顆粒的質量，并嘗試驗證板藍根多糖部分降解產物測定結果反映出的該制劑的質量差異問題，筆者還采用CZE法對所有樣品中的小分子化合物進行了指紋圖譜測定，并參考板藍根顆粒藥典標準，運用薄層色譜法對其氨基酸成分進行了分析.結果表明，3個方面測定所反映的板藍根顆粒質量差異情況整體趨勢吻合，進一步證明了多糖部分降解產物在板藍根顆粒多糖類成分質量分析中應用的可行性.

4 結論

本文在去除了板藍根顆粒中輔料蔗糖和糊精干擾的基礎上，采用CZE法測定了板藍根多糖的部分降解產物，實現了該制劑的有效鑒別，并結合聚類分析，完善了其質量控制，并發(fā)現不同廠家板藍根顆粒多糖類成分含量差異顯著.該方法專屬性強，并對其他中藥制劑多糖類成分的分析具有一定的參考價值.本文也為該制劑的質量一致性評價提供了更多依據.