中藥材桔梗及其易混品的DNA條形碼分子鑒定

趙新悅，劉蕊，馮紅，毛雯雯，曹飛，張?zhí)m蘭

(1.河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北 保定 071002；2.數(shù)字本草檢測(cè)科技有限公司，河北 保定 071002)

中藥桔梗[1]為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum的干燥根，具有宣肺、祛痰、利咽、排膿之功效.研究表明，桔梗中主要活性成分桔梗皂苷D可明顯降低白色念珠菌對(duì)口腔黏膜的感染.皂苷D、D3和遠(yuǎn)志皂苷 D可抑制人癌細(xì)胞株的增殖[2]，桔梗多糖對(duì)宮頸癌實(shí)體瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)有顯著的抑制作用[3].此外，桔梗還具有降血糖、抗氧化的功效[4].豐富的藥理作用，使得桔梗藥材被廣泛應(yīng)用.然而，桔梗市場(chǎng)一直存在真?zhèn)位祀s現(xiàn)象.因外形相似不易區(qū)分，有些不良商家以南沙參(Adenophoratetraphylla)、霞草(Gypsophilaoldhamiana)摻入或冒充桔梗售賣[5]，但南沙參清熱養(yǎng)陰，霞草活血散淤，作為桔梗應(yīng)用于臨床時(shí)不能宣肺利咽，很大程度上延誤患者病情，如若將霞草誤認(rèn)為桔梗使用時(shí)，可能引起患者出血增多，為臨床增加了不必要的風(fēng)險(xiǎn).目前，徐優(yōu)芬[6]、王千枝[7]、萬(wàn)秋娥[8]等采用植物形態(tài)、藥材性狀、顯微鑒別、激光拉曼光譜等方法對(duì)桔梗及其易混品進(jìn)行鑒別，其方法本身對(duì)技術(shù)人員的專業(yè)技術(shù)能力要求較高，其結(jié)果重復(fù)性差、工作量大.

目前，DNA條形碼技術(shù)已成為中藥材鑒定的重要方法[9].2010年中國(guó)學(xué)者提出將ITS2(internal transcribed spacer 2)作為藥用植物標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼[10]，且已成功應(yīng)用于豆科等多個(gè)科屬藥用植物及藥材鑒定[11-13].已有研究表明[14]，基于ITS基因序列的桔梗及其偽品的基源植物構(gòu)建鄰接法(NJ) 聚類樹，桔梗樣品可聚成一個(gè)單系，但對(duì)其位點(diǎn)特異性PCR鑒定未見相關(guān)報(bào)道.

本文以桔梗、南沙參、霞草為研究對(duì)象，優(yōu)化DNA提取方法和設(shè)計(jì)桔梗特異性引物，對(duì)桔梗進(jìn)行特異性PCR鑒定.本方法操作簡(jiǎn)單，快速，無(wú)需測(cè)序，可特異性鑒別桔梗及其易混品，為桔梗藥材的基原鑒定提供科學(xué)依據(jù)，并進(jìn)一步完善桔梗藥材質(zhì)量控制系統(tǒng).

1 儀器和材料

1.1 儀器

LDZM-20KCS Ⅲ立式壓力滅菌鍋(上海申安)；Scientz-48高通量組織研磨器(寧波新芝生物)；Legend Micro 17離心機(jī)(Thermo Fisher Scienific)；Epoch酶標(biāo)儀(伯騰)；ABI profile梯度PCR儀(Life Technologies)；DYCP31DN電泳儀(北京六一生物)；JS-680D凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海培育科技).

1.2 材料

本實(shí)驗(yàn)所用樣品均購(gòu)自藥材市場(chǎng)，收集后放置于硅膠中常溫干燥保存，備用；樣品共計(jì)17批，均經(jīng)本公司鑒定人員鑒定，樣品信息詳見表1.

表1 實(shí)驗(yàn)所需植物材料

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 基因組DNA的提取

隨機(jī)選擇桔梗、南沙參、霞草樣品各2批，采用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇對(duì)樣品表面擦拭消毒并置于潔凈處揮干，使用高通量組織研磨儀研磨，稱取樣品粉末30 mg于2 mL離心管中，采用植物基因組DNA提取試劑盒法、改良CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)法、SDS(sodium dodecyl sulfate)法3種DNA提取方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(表2).并以通用引物ITS 2F/3R進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15]，以DNA濃度、純度與PCR擴(kuò)增成功率為評(píng)判指標(biāo)，選擇最適合桔梗及其易混品藥材DNA提取的方法.

表2 基因組DNA提取方法比較

2.2 序列分析

將測(cè)序獲得和NCBI網(wǎng)站下載的桔梗、南沙參、霞草的ITS基因序列(登錄信息見表3)用MEGA 7.0軟件進(jìn)行序列查看，用Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)，刪除前后兩端多余的序列，并計(jì)算種間和種內(nèi)的遺傳距離.基于Kimura-2-parameter雙參數(shù)模型用NJ將比對(duì)過(guò)的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用自舉檢驗(yàn)法(bootstrap 1 000次)檢驗(yàn)各分支的支持率.

表3 NCBI下載的各基因序列信息

2.3 特異性引物設(shè)計(jì)

通過(guò)MEGA7.0分析比較桔梗及其易混品的ITS序列差異，查找桔梗的特異性位點(diǎn).基于特異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)桔梗特異性引物，并送至北京美吉桑格生物有限公司進(jìn)行合成.利用該引物對(duì)各藥材DNA進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證引物的可用性.

2.4 桔梗位點(diǎn)特異性PCR方法建立

基于本研究提取的桔梗及其易混品的基因組DNA和設(shè)計(jì)的桔梗特異性引物U1/D1，建立桔梗位點(diǎn)特異性PCR方法，并對(duì)其進(jìn)行PCR條件優(yōu)化.

本研究分別考察了引物U1/D1的退火溫度、循環(huán)次數(shù)、DNA模板濃度以及引物濃度等因素對(duì)PCR反應(yīng)效率的影響，篩選最適PCR擴(kuò)增條件.各因素具體參數(shù)設(shè)計(jì)如下：

退火溫度考察分別設(shè)置為56、58、60、62 ℃;循環(huán)次數(shù)考察分別設(shè)置為33、35、37、39個(gè)循環(huán);DNA模板考察分別設(shè)置為50、100、200、400 ng;最適引物濃度考察分別設(shè)置為0.5、1.0、2.5、5.0 μmol/L.

最后，為了進(jìn)一步檢驗(yàn)桔梗位點(diǎn)特異性，將所有樣品基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置未加模板DNA的PCR反應(yīng)為空白對(duì)照.

3 結(jié)果與分析

3.1 基因組DNA的提取

DNA純度常以A260/A280來(lái)表示，1.8～2.0表示所提取的DNA純度較好，小于1.8說(shuō)明有蛋白質(zhì)污染，大于2.0說(shuō)明有RNA殘留.從表4可知，3種方法提取的DNA均有污染，試劑盒法提取基因組DNA平均純度為0.76，所提DNA中含有較多蛋白質(zhì)，改良CTAB法為2.13，SDS法為2.20，有少量RNA殘留.而選取相同樣品量時(shí)，改良CTAB法和SDS法所提DNA質(zhì)量濃度均在120 ng/μL以上，而試劑盒法提取DNA質(zhì)量濃度只有20 ng/μL.就提取DNA的純度和質(zhì)量濃度而言，改良CTAB法≈SDS法>試劑盒法.

表4 3種方法所提取的DNA質(zhì)量匯總

PCR擴(kuò)增成功率見圖1，試劑盒法和改良CTAB法顯示條帶6條，成功率為100%，但試劑盒法顯示條帶彌散，SDS法顯示條帶4條，成功率為66.7%.就擴(kuò)增成功率而言，改良CTAB法>試劑盒法>SDS法.

綜上對(duì)3種常用基因組DNA提取方法的比較可知，改良CTAB法提取的桔梗及其易混品的DNA含有少量RNA，質(zhì)量濃度在150 ng/μL，且PCR擴(kuò)增成功率為100%，最適于桔梗及其易混品的DNA提取.

M.Marker； J.桔梗；N.南沙參；X.霞草.圖1 試劑盒法(a)、改良CTAB法 (b)、SDS法(c)提取DNAFig.1 DNA extraction by kit method (a)、modified CTAB method (b)、SDS method (c)

3.2 聚類分析和遺傳距離計(jì)算

將28條ITS序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2.

圖2 基于ITS序列的桔梗及易混品的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(bootstrap 1 000 次重復(fù))Fig.2 NJ of Platycodon grandiflorum and miscible based on ITS sequence (bootstrap 1 000 replicates)

從圖2可以看出：3種植物的ITS序列分別聚為一支，不同來(lái)源的桔梗樣品聚為一個(gè)單系，支持率高達(dá)99.但測(cè)序所得序列與下載序列未單獨(dú)聚在一起，而是分別聚為一個(gè)分支.易混品南沙參與霞草均各自聚為一個(gè)單系，支持率分別為97和93，其中霞草為石竹科植物，與另外兩者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，南沙參與桔梗的親緣關(guān)系較近.

將處理好的ITS序列導(dǎo)入MEGA 7.0軟件，基于Kimura-2-parameter模式計(jì)算種內(nèi)種間遺傳距離：所有樣品之間的平均遺傳距離為0.378，桔梗種內(nèi)遺傳距離為0.004，南沙參種內(nèi)遺傳距離為0.016，霞草種內(nèi)遺傳距離為0.007，桔梗與易混品南沙參之間的遺傳距離為0.264，與霞草間的遺傳距離為0.893.種內(nèi)最大遺傳距離均小于種間最小遺傳距離，該結(jié)果與趙月梅等[14]研究結(jié)果一致，由此可見，基于ITS基因序列的DNA條形碼技術(shù)能夠有效地鑒定桔梗及其易混品.

3.3 特異性引物設(shè)計(jì)與鑒別

比對(duì)桔梗及其易混品霞草、南沙參的ITS序列，查找在293位依次為G、C、A，在538位為G、T、T，見圖3.采用Primer Primier 5.0 軟件設(shè)計(jì)桔梗特異性引物U1/D1(U1：5' GCTGTGACCGCTCCTCG 3'；D1：5' CCTGTATCCGCTCCACCTG 3')，并送至北京美吉桑格生物有限公司進(jìn)行引物合成.使用此引物對(duì)上節(jié)所得DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見圖4，發(fā)現(xiàn)僅桔?？梢蕴禺愋詳U(kuò)增出264 bp大小的條帶.

圖3 293位(a)和538位(b)序列比對(duì)Fig.3 293 position(a) and 538 position(b) sequence alignment

M.Marker； J.桔梗；N.南沙參；X.霞草.圖4 桔梗特異性引物鑒別結(jié)果Fig.4 Platycodon grandiflorum specific primer identification results

3.4 桔梗位點(diǎn)特異性PCR方法建立

通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶的清晰明亮程度作為PCR擴(kuò)增效率的評(píng)判指標(biāo)，見圖5.退火溫度在56 ℃條件下桔梗擴(kuò)增條帶較為清晰；37～39個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增條帶均清晰明亮，且程度相當(dāng)；DNA模板在50～400 ng，隨著DNA濃度增加，擴(kuò)增條帶由暗到亮到暗的過(guò)程，100 ng條件下桔梗擴(kuò)增條帶最為清晰且明亮；最適引物濃度考察時(shí)，引物在5.0 μmol/L條件下，桔梗擴(kuò)增條帶最為清晰，且無(wú)非特異性擴(kuò)增；PCR特異性考察時(shí)，僅10批桔?？蓴U(kuò)增出特異性單一條帶，其他樣品均未擴(kuò)增出特異性條帶，從而驗(yàn)證此方法可以特異性地鑒別桔梗藥材.優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：2×Taq PCR Mix需12.50 μL，正反向引物(5.0 μmol/L)各1.00 μL，模板(基因組DNA約0.1 μg/μL)需2.00 μL，ddH2O補(bǔ)至25.00 μL.PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min后，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，37個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min.

M.Marker；J.桔梗；N.南沙參；X.霞草.圖5 退火溫度 (a)、循環(huán)次數(shù) (b)、 DNA模板量 (c)和引物濃度優(yōu)化 (d)及特異性驗(yàn)證結(jié)果 (e)Fig.5 Annealing temperature (a),cycling number (b),amount of DNA (c)and optimize primer concentration (d),specificity verification results (e)

4 討論

桔梗是中國(guó)常見的中藥材之一，分布于東北、華北、華東、華中各省以及兩廣、云南、四川等地.朝鮮、日本、蘇聯(lián)的遠(yuǎn)東和東西伯利亞地區(qū)的南部也有分布，范圍較廣.由于地理環(huán)境的差異，導(dǎo)致桔梗藥材外觀無(wú)法統(tǒng)一，質(zhì)量也參差不齊，不僅使傳統(tǒng)鑒別增加了難度，更是增加了易混品相互混淆的幾率.目前市場(chǎng)上因外形無(wú)法區(qū)分的桔梗易混品主要是南沙參和霞草2個(gè)品種[16].三者在藥效和藥性上具有一定差異，藥材的混用將直接影響到桔梗臨床用藥的安全和療效.因此，對(duì)桔梗及其易混品進(jìn)行深入的鑒定研究，對(duì)規(guī)范桔梗藥材市場(chǎng)以及臨床用藥有重要意義.

植物DNA提取一般先后經(jīng)歷細(xì)胞壁和細(xì)胞膜裂解、蛋白質(zhì)分離變性、核酸沉淀及DNA濃縮等多個(gè)步驟.桔梗藥材在加工、貯藏過(guò)程中會(huì)造成DNA不同程度的降解，且自身含有的大量多糖，會(huì)與DNA結(jié)合形成黏稠的膠狀物，使DNA難以溶解.本文通過(guò)比對(duì)3種提取方法，以DNA純度、濃度和擴(kuò)增成功率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得出改良CTAB法更適于桔梗及易混品的DNA提取，原因?yàn)镃TAB是一種去污劑，可與核酸形成復(fù)合物，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度(<0.3 mol/L NaCl)時(shí)，復(fù)合物從溶液中沉淀，通過(guò)離心就可將CTAB與核酸的復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開[17]，可以有效防止桔梗多糖對(duì)DNA提取過(guò)程的干擾.基于ITS基因序列的DNA條形碼技術(shù)能夠有效地鑒定桔梗及其易混品，在此基礎(chǔ)上，分析挖掘穩(wěn)定的特異性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)桔梗特異性鑒別引物，并對(duì)特異性PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確地鑒別桔梗及其易混品.

本文設(shè)計(jì)的桔梗特異性引物具有專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，建立的方法操作簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，耗時(shí)較短，無(wú)需測(cè)序，降低檢測(cè)成本，只需通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳條帶即可將正品桔梗與其易混品區(qū)分.本文建立了快速區(qū)分桔梗及其混偽品的分子鑒定方法，為桔梗DNA條形碼技術(shù)研究進(jìn)行補(bǔ)充與完善，并有望得到廣泛的推廣應(yīng)用.