GmGSL7c在大豆抗SMV過程中的作用

王夢(mèng)璇，孫希哲，孫天杰，張潔，王冬梅

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001)

大豆Glycinemax(L.) Merr.是中國(guó)主要的糧食作物，而由大豆花葉病毒(Soybeanmosaicvirus, SMV)引起的大豆花葉病毒病在大豆主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生.大豆葉片感染SMV后，會(huì)出現(xiàn)花葉、皺縮等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致大豆品質(zhì)和產(chǎn)量降低.探索大豆抗SMV機(jī)制對(duì)保護(hù)大豆生產(chǎn)具有指導(dǎo)作用[1].

胞間連絲(plasmodesmata, PD)是由相鄰細(xì)胞的質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相互連接形成的納米通道[2]，SMV通過PD這一共質(zhì)通道來完成胞間轉(zhuǎn)運(yùn)[3].PD的通透性受到多種因素的調(diào)節(jié).Lee等[4]證明在質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜之間存在由肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白形成的輻，這種結(jié)構(gòu)也說明PD的孔徑大小具備可調(diào)節(jié)性. Guseman等[5]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，胼胝質(zhì)的合成一旦受到抑制，PD的通透性也會(huì)發(fā)生明顯變化；Vatén等[6]也證明胼胝質(zhì)的合成影響根發(fā)育過程中的共質(zhì)運(yùn)輸.隨著對(duì)PD研究的逐步深入，胼胝質(zhì)對(duì)PD孔徑調(diào)控的重要性也逐漸被揭示；Sivaguru等[7]在研究重金屬與植物的關(guān)系過程中發(fā)現(xiàn)胼胝質(zhì)的代謝受Ca2+調(diào)節(jié)，外源施加鋁離子會(huì)導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)的局部變化，使PD因胼胝質(zhì)沉積而閉合.胼胝質(zhì)主要由β-1,3-葡聚糖構(gòu)成，這一多糖的代謝受到胼胝質(zhì)合酶(callose synthase，GSL)和胼胝質(zhì)水解酶(β-1,3-glucanases，BG)的共同控制[8]. Chen和Kim[9]提出胼胝質(zhì)由GSL產(chǎn)生而被BG降解.本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，胼胝質(zhì)在大豆抵御SMV侵染中發(fā)揮重要作用.使用胼胝質(zhì)合成抑制劑(2-DDG)抑制胼胝質(zhì)積累，可在未接種的上位葉片中檢測(cè)到SMV外殼蛋白基因SMV-CP.而本文主要關(guān)注在大豆抵御SMV過程中GSL的作用.

GSL最早在酵母中發(fā)現(xiàn)，隨后在植物中也陸續(xù)得到GSL與胼胝質(zhì)合成相關(guān)的證據(jù)：Hong等[10]在擬南芥數(shù)據(jù)庫中通過酵母GSL的保守結(jié)構(gòu)域FKS1_dom1鑒別了12種GSL,分別命名為AtGSL1-AtGSL12，并發(fā)現(xiàn)這些AtGSL還同時(shí)具有Glucan_synthase結(jié)構(gòu)域(pfam∶PF02364)，在12種AtGSL中僅發(fā)現(xiàn)3種與PD上的胼胝質(zhì)沉積有直接關(guān)系的胼胝質(zhì)合酶，分別為AtGSL8、AtGSL7和AtGSL12. Guseman等[5]發(fā)現(xiàn)在gsl8突變體中，PD處的胼胝質(zhì)變少且通透性增加；Xie等[11]發(fā)現(xiàn)在gsl7突變體中篩板和篩孔處胼胝質(zhì)減少，最終導(dǎo)致莖發(fā)育異常；Vatén等[6]研究發(fā)現(xiàn)，GSL12的表達(dá)可以調(diào)控PD上胼胝質(zhì)的沉積，進(jìn)而影響細(xì)胞間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn).

本實(shí)驗(yàn)室的前期工作證明了在大豆抵抗SMV侵染的過程中，一氧化氮(NO)作為重要的信號(hào)分子對(duì)胼胝質(zhì)在PD上沉積有正調(diào)控作用[12]，并建立了抑制NO前后大豆品種‘冀豆7號(hào)’與SMV株系N3互作的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫. 本研究結(jié)果表明了大豆胼胝質(zhì)合酶GmGSL7c是SMV侵染大豆過程中影響PD上胼胝質(zhì)合成的關(guān)鍵GSL，為揭示PD上胼胝質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大豆品種‘冀豆7號(hào)’(J7)與SMV株系N3組成不親和組合，‘南農(nóng)1138-2’與N3組成親和組合，用于SMV的擴(kuò)繁.‘南農(nóng)1138-2’由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)智海劍教授惠贈(zèng)；J7為河北省農(nóng)林科學(xué)院張孟臣研究員惠贈(zèng)；SMV株系N3由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆改良中心提供.

大豆培育在有高壓鈉燈的防蟲溫室內(nèi)培育，溫度控制在(25±2) ℃，光照為10 000 lx，光照時(shí)間為14 h/d，以滅菌蛭石栽培.大豆接種SMV參考Li等[13]的方法：將帶有明顯花葉表型的南農(nóng)1138-2的新鮮葉片加入適量0.1 mol/L磷酸緩沖液和金剛砂進(jìn)行充分研磨，用滅菌毛刷蘸取研磨液均勻刷在大豆葉片葉脈較少的區(qū)域，并在接種后0、4、12、24、48、96 h對(duì)接種葉片進(jìn)行取樣，120 h對(duì)未被接種的上位葉取樣分析.

1.2 載體與菌株

大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞和根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存.克隆載體pEASY-Blunt Zero購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，TRV-VIGS載體(Tobaccorattlevirus，TRV)由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院王省芬教授惠贈(zèng).

1.3 試劑及耗材

反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、高保真酶PrimeSTAR MAX DNA polymerase、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(TaKaRa)；Taq酶、克隆載體pEASY-Blunt Zero、熒光定量試劑SYBR qPCR Mix購(gòu)自全式金(北京)生物技術(shù)有限公司；表面活性劑Silwet L-77購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，牛肉浸粉、胰蛋白胨、卡那霉素、利福平、氨芐青霉素、Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；乙酰丁香酮購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；本文所用其他藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

1.4 大豆葉片藥物學(xué)注射

選取約2周齡的J7幼苗的第1輪真葉進(jìn)行藥物學(xué)實(shí)驗(yàn).對(duì)真葉葉片側(cè)脈間隙注射100 μmol/L c-PTIO (NO清除劑)，并以注射ddH2O幼苗葉片作為對(duì)照.植株恢復(fù)培養(yǎng)24 h后，在注射部位進(jìn)行SMV株系N3的摩擦接種.本實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù).

1.5 生物信息學(xué)分析

用HMMER軟件構(gòu)建AtGSLs Glucan_synthase保守結(jié)構(gòu)域模型.TBtool軟件在大豆蛋白庫內(nèi)檢索與HMMER模型相符的蛋白序列，提取E-value < 10-5的基因編號(hào)及蛋白序列，提交至NCBI CDD數(shù)據(jù)庫繪制保守結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ葓D.

利用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，聚類方法使用Neighbor-Joining (NJ)，泊松回歸分析選用pairwise deletion，bootstrap設(shè)置為1 000次.

1.6 TRV-VIGS載體構(gòu)建及病毒接種

SoyKB (http://soykb.org)內(nèi)提取基因序列，并利用NCBI Blast檢索基因的特異性區(qū)段，Primer6.0軟件根據(jù)特異性區(qū)段設(shè)計(jì)引物(表1).以J7葉片cDNA作為模版擴(kuò)增特異性片段(引物見表1).瓊脂糖凝膠電泳分離純化基因片段后，使用限制性BamHI ，EcoRI內(nèi)切酶處理擴(kuò)增片段及pTRV2載體，T4 DNA連接酶連接處理后的擴(kuò)增片段和pTRV2載體，重組載體轉(zhuǎn)化Top10大腸桿菌后送華大基因科技有限公司北京測(cè)序部進(jìn)行檢測(cè).對(duì)測(cè)序正確克隆提取質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101.

參照Senthil等[14]的方法，在1周齡大豆幼苗第1輪真葉初步形成時(shí)，切除大豆頂芽保留子葉.將攜帶pTRV1和pTRV2載體(或pTRV2重組載體)的農(nóng)桿菌菌株分別在含有卡那霉素(Kana，50 μg/mL)和利福平(Rif，50 μg/mL)的YEB培養(yǎng)基中28 ℃搖至OD600≈0.5后，轉(zhuǎn)移至50 mL的塑料離心管中5 000g離心3 min，富集菌體棄去上清培養(yǎng)基，無菌蒸餾水漂洗2次后用侵染緩沖液(50 mmol/L MES，2 mmol/L Na3PO4，28 mmol/L葡萄糖，0.1 mmol/L乙酰丁香酮，4.1 mmol/L L-Cys，0.2 g/L Silwet L-77)重懸洗滌后菌體，重懸液OD600≈0.5.將帶有pTRV1和pTRV2載體(或pTRV2重組載體)的農(nóng)桿菌等體積混合，澆灌大豆根莖處，每株澆灌5 mL侵染混合液.此后間隔5 d重復(fù)侵染1次，總計(jì)3次，最后一次侵染后等待7 d，對(duì)植株的第1輪3葉接種SMV株系N3，按需求進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)樣品制備.

1.7 RT-qPCR分析大豆與SMV互作過程中目的基因表達(dá)模式

使用Primer6.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR引物(表1).RT-qPCR反應(yīng)按照SYBR premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明書指導(dǎo)在IQTM5多重實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-Rad)上運(yùn)行，樣品設(shè)3次技術(shù)重復(fù).RT-qPCR體系：Mix 5 μL，去離子水3 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板1 μL. RT-qPCR程序：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s后檢測(cè)熒光信號(hào)，45個(gè)循環(huán).得到的CT值采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析，EF1b(表1)作為內(nèi)參基因[15].

1.8 RT-qPCR檢測(cè)基因沉默效率

從GmGSL7c基因的5’UTR特異性區(qū)段設(shè)計(jì)引物(表1).利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)目的基因的沉默效率，以澆灌攜帶pTRV1和pTRV2載體的農(nóng)桿菌植株葉片為對(duì)照組，以澆灌攜帶pTRV1和pTRV2重組載體的農(nóng)桿菌植株葉片為實(shí)驗(yàn)組，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù).

沉默效率的計(jì)算公式為

(對(duì)照組基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平-實(shí)驗(yàn)組基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平)/對(duì)照組基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平×100%.

1.9 胼胝質(zhì)熒光觀察

參照Li等[13]的方法，取接種部位約1 cm2的大豆葉片用2倍乙醇稀釋的乳酚油(ddH2O、丙三醇、苯酚和乳酸的質(zhì)量比為1∶2∶2∶1)煮沸3 min，ddH2O洗滌3次，每次5 min.在0.1 g/L苯胺藍(lán)(pH7.4 0.1 mol/L PBS配制)中染色15 min，ddH2O洗滌3次，每次10 min.將大豆葉片正面向上置于載玻片上，蓋玻片輕輕蓋壓排除氣泡.使用OLYMPUS BX-53型熒光顯微鏡(波長(zhǎng)為385 nm激發(fā)光)觀察胼胝質(zhì)熒光，每個(gè)樣品觀察30個(gè)單侵染點(diǎn).

表1 引物序列信息

1.10 SMV-CP基因的檢測(cè)

使用RT-PCR檢測(cè)大豆葉片中SMV外殼蛋白基因特異性片段SMV-CP. PCR體系為：3 μL樣品cDNA，1 μL SMV-CP PCR F/R(表1)，5 μL 10× EasyTaq?Buffer for PAGE，4 μL 2.5 mmol/L dNTPs，1 μL EasyTaq?DNA Ploymerase for PAGE，35 μL Nuclease-fress Water. PCR程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，35個(gè)循環(huán).反應(yīng)結(jié)束后加入5 μL 10×Loading buffer(TaKaRa)，瓊脂糖凝膠電泳分離產(chǎn)物，EB染色后用紫外線照射顯示條帶位置.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大豆胼胝質(zhì)合酶的分析

利用生物信息學(xué)手段在大豆蛋白庫中得到24個(gè)大豆胼胝質(zhì)合酶(GmGSL)，并對(duì)這些蛋白序列進(jìn)行CDD繪圖(圖1).圖1顯示，GmGSL包含Glucan_synthase合酶結(jié)構(gòu)域，多數(shù)GmGSL中還包含F(xiàn)KS1_dom1和Vta1結(jié)構(gòu)域.

圖1 大豆中胼胝質(zhì)合酶的保守結(jié)構(gòu)域Fig.1 Conserved domains of callose synthase in soybean

圖2 擬南芥和大豆中胼胝質(zhì)合酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of callose synthase in Arabidopsis and soybean

2.2 RT-qPCR分析大豆胼胝質(zhì)合酶基因的表達(dá)

使用RT-qPCR驗(yàn)證GmGSL7c在清除NO前后轉(zhuǎn)錄水平上的變化(圖3).結(jié)果表明，GmGSL7c的表達(dá)趨勢(shì)與數(shù)據(jù)庫表達(dá)趨勢(shì)基本一致.注射H2O和c-PTIO后24 h和48 h檢測(cè)植株中的GmGSL7c基因表達(dá)量，結(jié)果如圖3b所示：清除NO后GmGSL7c的表達(dá)顯著降低，說明GmGSL7c在轉(zhuǎn)錄水平上受NO的調(diào)控.

a.GmGSL7c在預(yù)注射H2O和c-PTIO后接種SMV不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫;b.RT-qPCR檢測(cè)得到的表達(dá)水平.圖3 GmGSL7c基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)模式Fig.3 Expression pattern of GmGSL7c

2.3 GmGSL7c的沉默對(duì)胼胝質(zhì)的影響

按照1.6方法對(duì)大豆幼苗進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染處理，接種SMV株系N3后取48、96 h的葉片，利用RT-qPCR技術(shù)分析基因沉默效率(圖4)并對(duì)接種葉片進(jìn)行胼胝質(zhì)苯胺藍(lán)染色. 經(jīng)過TRV-VIGS處理的植株中GmGSL7c基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)明顯較對(duì)照組低，說明GmGSL7c基因得到有效的沉默.

圖4 RT-q-PCR檢測(cè)基因沉默效率Fig.4 RT-q-PCR detection of gene silencing efficiency

為了研究GmGSL7c基因的沉默對(duì)SMV誘發(fā)胼胝質(zhì)積累的影響，利用苯胺藍(lán)染色法觀察沉默GmGSL7c植株葉片的胼胝質(zhì)變化，接種SMV株系N3后48 h (圖5a)，實(shí)驗(yàn)組葉片胼胝質(zhì)面積明顯較對(duì)照組增加，但熒光強(qiáng)度更弱；接種后96 h(圖5b)，對(duì)照組中單浸染點(diǎn)的胼胝質(zhì)熒光強(qiáng)度和面積變化不大，而實(shí)驗(yàn)組葉片胼胝質(zhì)熒光強(qiáng)弱不一且面積增加.說明沉默GmGSL7c會(huì)影響葉片中胼胝質(zhì)的合成.

a.接種SMV-N3后48 h胼胝質(zhì)觀察；b.接種SMV-N3后96 h胼胝質(zhì)觀察(箭頭所指為單侵染點(diǎn)胼胝質(zhì)).圖5 GmGSL7c沉默后葉片的胼胝質(zhì)觀察Fig.5 Observation of the callose on the GmGSL7c gene silencing leaf

2.4 GmGSL7c的沉默促進(jìn)SMV在大豆體內(nèi)的運(yùn)輸

實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，胼胝質(zhì)在大豆抵御SMV侵染中發(fā)揮重要作用.為了探討GSL沉默是否影響植株的抗病性，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證沉默GmGSL7c基因的植株P(guān)D上胼胝質(zhì)的合成是否直接影響SMV病毒的細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn).利用PCR技術(shù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)組上部未接種的葉片中是否包含SMV外殼蛋白的特異性片段，以此來證明受基因GmGSL7c調(diào)控的胼胝質(zhì)對(duì)SMV病毒侵染的影響及相應(yīng)的沉積部位.如圖6顯示，實(shí)驗(yàn)組上位葉檢測(cè)到了SMV-CP特異性片段條帶(其中Control為以接種SMV-N3病毒的南農(nóng)1138-2葉片RNA為模版擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，SMV-CP保守片段為500 bp)，而對(duì)照組的上位葉并沒有檢測(cè)到類似的條帶.持續(xù)培養(yǎng)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組植株，接種SMV15 d時(shí)觀察上位葉(圖7).可以在實(shí)驗(yàn)組植株上位葉觀察到花葉表型且葉片有明顯皺縮現(xiàn)象，而對(duì)照組上位葉沒有觀察到類似表型且葉片狀態(tài)良好.進(jìn)一步證實(shí)GmGSL7c基因調(diào)控PD上的胼胝質(zhì)沉積，并在大豆抵御SMV過程中起到關(guān)鍵作用.

M.Marker;1.Control;2.TRV：GmGSL7c;3.TRV:00.圖6 沉默GmGSL7c植株上位葉SMV-CP檢測(cè)Fig.6 SMV-CP detection of the upper leaves of GmGSL7c gene silencing plants

圖7 沉默GmGSL7c的植株上位葉表型Fig.7 Upper leaves phenotype of GmGSL7c gene silencing plants

3 討論

胼胝質(zhì)是一種僅在高等植物中發(fā)現(xiàn)的多糖，其主要成分是β-1,3-葡聚糖[8]. Levy等[16]的結(jié)果顯示，PD頸部可以檢測(cè)到胼胝質(zhì)的沉積，且PD的通透性受到胼胝質(zhì)代謝的調(diào)節(jié).同時(shí)胼胝質(zhì)的代謝又受GSL和BG的嚴(yán)格調(diào)控，GSL參與胼胝質(zhì)的合成，而BG參與胼胝質(zhì)的水解過程.其中,GSL只有通過整合到高度特化的蛋白質(zhì)復(fù)合體才能正確合成和沉積胼胝質(zhì)，這也說明胼胝質(zhì)的合成過程可能受多種因素的調(diào)節(jié)[8].

Xiao等[12]的工作已經(jīng)證明，在由SMV株系N3和大豆‘J7’組成的不親和組合中，SMC-N3的侵染會(huì)引起NO信號(hào)的產(chǎn)生，并觀察到胼胝質(zhì)沉積在PD頸部；而在由SMV株系SC-8和大豆‘J7’組成的親和組合中沒有觀察到類似的現(xiàn)象.為探求NO信號(hào)能否影響GmGSL的表達(dá)，并最終影響胼胝質(zhì)的沉積問題設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn).首先利用AtGSL中的保守序列構(gòu)建HMMER保守結(jié)構(gòu)域模型，比對(duì)大豆蛋白質(zhì)組庫篩選出24個(gè)GmGSL (圖1)；將這一結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖2)，選取與擬南芥中PD相關(guān)的AtGSL相近的分支，同時(shí)參照轉(zhuǎn)錄組庫挑選出受NO信號(hào)調(diào)控的大豆胼胝質(zhì)合酶基因GmGSL7c.結(jié)果2.1顯示胼胝質(zhì)合酶基因GmGSL7c中包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中Glucan_synthase結(jié)構(gòu)域參與多糖合成[17]；FKS1_dom1為酵母中的保守結(jié)構(gòu)域[18]，以該結(jié)構(gòu)域作為參照篩選擬南芥中胼胝質(zhì)合酶；而GmGSL7c還包含1個(gè)非保守的Vta1結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域主要是通過調(diào)節(jié)ESCRT系統(tǒng)(endosomal-sorting complexes required for transport)中的ATPase，最終影響MVB (multivesicular body)的發(fā)生[19].結(jié)合De等[8]得出的GSL需要與多種蛋白組裝形成胼胝質(zhì)合酶復(fù)合體才能行使功能的結(jié)果，推測(cè)胼胝質(zhì)合酶基因GmGSL7c可能與多種蛋白形成的胼胝質(zhì)合酶復(fù)合體啟動(dòng)胼胝質(zhì)在PD上的合成.利用RT-qPCR檢測(cè)GmGSL7c基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平也可以發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫趨勢(shì)相近，基因GmGSL7c受NO信號(hào)調(diào)節(jié)，可能參與SMV誘導(dǎo)的PD上的胼胝質(zhì)沉積.

Li等[13]的結(jié)果證明，通過檢測(cè)未被接種的上位葉中是否含有SMV外殼蛋白的特異性區(qū)段的方法來鑒別SMV在植物葉片中的侵染進(jìn)程；TEM觀察親和組合PD發(fā)現(xiàn)，SMV侵染狀態(tài)下，PD頸區(qū)基本觀察不到胼胝質(zhì)的存在，并在未被接種的上位葉中檢測(cè)到了SMV-CP的保守區(qū)段；在不親和組合中觀察到接種葉片中胼胝質(zhì)被誘導(dǎo)表達(dá)，并在上位葉中未能檢測(cè)到SMV-CP的保守區(qū)段.本研究結(jié)果顯示在不親和組合中，對(duì)沉默GmGSL7c基因且效率較好的植株(圖4)接種SMV株系N3，觀察沉默組與對(duì)照組中接種葉片胼胝質(zhì)的變化.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默組胼胝質(zhì)面積隨著時(shí)間的推移逐步擴(kuò)展，而對(duì)照組中的胼胝質(zhì)面積變化不大；與對(duì)照組相比，沉默組中的胼胝質(zhì)熒光更弱(圖5).以上結(jié)果表明，當(dāng)基因GmGSL7c的表達(dá)被抑制時(shí)仍有部分胼胝質(zhì)合成，但合成的胼胝質(zhì)及其在PD上沉積的量無法阻礙SMV在胞間的擴(kuò)散，當(dāng)SMV從一個(gè)細(xì)胞進(jìn)入另一個(gè)細(xì)胞時(shí)，胼胝質(zhì)仍會(huì)被誘導(dǎo)合成以進(jìn)一步限制SMV的運(yùn)輸，最終觀察到實(shí)驗(yàn)組葉片胼胝質(zhì)面積不斷增加(圖5)，而順利逃逸的SMV最終侵入了未被接種的上位葉中，并能在實(shí)驗(yàn)組未接種上位葉片中檢測(cè)到SMV-CP片段(圖6)，觀察到被SMV感染后的花葉癥狀(圖7).

結(jié)合這些證據(jù)可以得出，SMV誘導(dǎo)NO信號(hào)的產(chǎn)生，并影響GmGSL7c基因的表達(dá)；而GmGSL7c作為PD上胼胝質(zhì)沉積的關(guān)鍵酶，當(dāng)GmGSL7c基因受到抑制時(shí)，PD上合成的胼胝質(zhì)不足以阻斷SMV，使得SMV向外逃逸并經(jīng)韌皮部擴(kuò)散到上位葉，最終在未被接種的上位葉觀察到花葉癥狀.這一基因功能的揭示說明PD通透性的調(diào)控受到多因素影響，為解釋植物體內(nèi)復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)提供了新證據(jù).