山羊精子形態(tài)異常的幾種檢測方法

林爾喜 許鵬 覃孝杰 鄧祝新 彭燕*

（1，廣西靈山縣動物疫病預(yù)防控制中心 535499；2，廣西畜禽品種改良站 530001）

精子形態(tài)分正常精子和異常(又稱畸形) 精子，在畸形精子中又分頭部畸形、尾部畸形和其他類畸形（比如粘連）。據(jù)報道，精子形態(tài)與受精關(guān)系密切，精子形態(tài)異常（畸形），受精能力下降。公羊鮮精畸形率超過15%，受胎率下降，畸形率超過50%，受胎率急劇下降（羊冷凍精液畸形率超過20%，受胎率下降，畸形率超過55%，受胎率急劇下降）[1]。筆者結(jié)合長期的工作實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，介紹幾種山羊精子形態(tài)異常的檢測方法，供同行參考。

1 檢測藥品、儀器設(shè)備等的準(zhǔn)備

顯微鏡、帶動物用精子分析儀[SMAS]軟件的電腦、5～10μl 移液槍、定量采血管、血細(xì)胞計數(shù)板、計數(shù)器、小試管、滴管、載玻片、22×26mm 蓋玻片、18×18mm 蓋玻片、載玻片架、染色平槽、姬姆薩染液（預(yù)先配制好）、2%伊紅溶液、中性福爾馬林固定液（預(yù)先配制好）、3%氯化鈉溶液、稀釋好的羊精液樣品[2]。

2 檢測方法

2.1 常規(guī)檢測法

2.1.1 抹片

準(zhǔn)備好寫有羊號的載玻片，用移液槍取稀釋好的羊精液樣品10μl 至載玻片一端，用另一片載玻片的一端與樣品呈35°夾角，將精液樣品均勻拖于載玻片上，自然風(fēng)干15min，制成抹片，每個精液樣品制備2 個抹片。

2.1.2 固定

在每個風(fēng)干的抹片上滴2ml 中性福爾馬林固定液，固定15min 后用清水緩緩沖去固定液，然后置于載玻片架上自然風(fēng)干或吹干。

2.1.3 染色

將固定好的抹片反扣在染色平槽上，用滴管取適量姬姆薩染液充滿染色平槽中，使染液與抹片接觸，染色1.5h 后用清水緩緩沖去染液然后置于載玻片架上自然風(fēng)干或吹干。

2.1.4 鏡檢

將制好的抹片在200 倍顯微鏡下選擇多個區(qū)域，用計數(shù)器計數(shù)正常精子數(shù)和畸形精子數(shù)，每個抹片計數(shù)精子200 個以上，算出畸形率，兩片抹片畸形率檢測結(jié)果的平均值為該樣品的精子畸形率；同一個精液樣品制備的2 個抹片計數(shù)差值大于6 則需重做。

2.2 快速抹片法

2.2.1 抹片

準(zhǔn)備好寫有羊號的載玻片，用移液槍吸取稀釋好的羊精液樣品5μl 至載玻片一端，加5μl 預(yù)先配制好的2%伊紅染液混合均勻，用另一片載玻片的一端與樣品呈35°夾角，將精液樣品均勻拖于載玻片上，自然風(fēng)干15min，制成抹片，每個精液樣品制備2 個抹片。

2.2.2 鏡檢

方法同上（2.1.4 鏡檢）。

2.3 抹片油鏡檢測法

2.3.1 抹片

方法同上（2.2.1 抹片）。

2.1.2 鏡檢

打開連接顯微鏡帶動物用精子分析儀[SMAS]軟件的電腦，將制好的抹片在顯微鏡油鏡下，選擇上下、左右、中等多個區(qū)域，用計數(shù)器計數(shù)正常精子數(shù)和畸形精子數(shù)，每個抹片計數(shù)200 個以上，算出畸形率，兩片抹片檢測結(jié)果的平均值為該樣品的精子畸形率；同一個精液樣品制備的2 個抹片計數(shù)差值大于6 則重做。沒有動物用精子分析儀[SMAS]軟件也可以在普通顯微鏡油鏡下1000 倍鏡檢。

2.4 血細(xì)胞計數(shù)法

2.4.1 樣品準(zhǔn)備

用定量采血管吸取10μl 稀釋好的羊精液樣品至盛有3%氯化鈉溶液990μl 的小試管內(nèi)，混均使之成為100 倍稀釋的精液樣品，待用。

2.4.2 制片

將血細(xì)胞計數(shù)板洗凈風(fēng)干，用22×26mm 蓋玻片將計數(shù)板的計數(shù)室蓋好，用移液槍取稀釋100 倍的羊精液樣品10μl 至蓋玻片邊緣，輕輕打出，使精液樣品自行流入計數(shù)室，并均勻充滿，同樣方法給另一側(cè)的計數(shù)室加樣，靜置5min 后鏡檢。加樣時有氣泡或充不滿需重新做。

2.4.3 鏡檢

將制好的計數(shù)板置于顯微鏡下100 倍鏡檢，計算正常和畸形精子數(shù)，每個計數(shù)室計數(shù)200 個以上的精子，算出畸形率，上下兩個計數(shù)室的檢測結(jié)果的平均值為該樣品的精子畸形率。

2.5 壓片法

2.5.1 制片

先取2%伊紅溶液2μl 于載玻片上，加2μl 稀釋好的羊精液樣品混均，用18×18mm 蓋玻片蓋好，一片載玻片上可做3個壓片，靜置1min 后鏡檢。

2.5.2 鏡檢

將制作好的玻片置于顯微鏡下100 倍鏡檢，計算正常和畸形精子數(shù)，每個壓片計數(shù)精子200 個以上，算出畸形率，3 個壓片的檢測結(jié)果的平均值為該樣品的精子畸形率。

3 5 種方法對比

5 種常規(guī)檢測法對比，參見附表。

附表 5 種具體方法

4 小結(jié)與討論

在羊業(yè)生產(chǎn)中，定期對種公羊精液品質(zhì)進(jìn)行檢查，隨時掌握用種公羊的精液品質(zhì)情況，對提高母羊繁殖率意義重大。檢測公羊精子畸形率是精液品質(zhì)中的一項(xiàng)重要檢查，目前羊精液形態(tài)常規(guī)檢測法主要用于正規(guī)質(zhì)檢；快速抹片法操作方法簡單、出結(jié)果時間短，在生產(chǎn)上比較實(shí)用；其他方法在實(shí)際生產(chǎn)上只作參考用。