嬰兒膽汁淤積性肝病腸道菌群的特征性分析*

李 紅 江治霞 湯建橋 鄧玉萍

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院(武漢市婦幼保健院)中西醫(yī)結(jié)合科 (湖北 武漢， 430016)

嬰兒膽汁淤積性肝病(ICH )是嬰兒肝病中就診和入院治療的首要原因[1]，也是中國(guó)兒童終末期肝病肝移植的主要 適應(yīng)癥[2]，是嬰兒期致死或致殘的重要原因 。肝臟與腸道，在胚胎階段均起源前腸，通過(guò)門(mén)靜脈相互關(guān)聯(lián)，是解剖上的“遠(yuǎn)親”，功能上的“近鄰”。腸道菌群是調(diào)節(jié)肝臟生理、病理功能的重要參與者[3]。本研究擬通過(guò)細(xì)菌16S rRNA高通量測(cè)序，初步探索ICH患兒腸道菌群特征，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年7月至2019年7月武漢兒童醫(yī)院收治的10例ICH患兒為研究對(duì)象，并選取健康嬰兒10例作為對(duì)照。兩組兒童間的性別和年齡(88.3±39.85)vs(72.7±27.11)d均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)，家長(zhǎng)知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn) ICH的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4,5]：①1歲以內(nèi)發(fā)??；②直接膽紅素(DBil)>17 μmol/L(1 mg/dl)；血丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和(或)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)增高；③臨床伴有黃疸、糞便顏色變淺或白陶土樣便、尿色加深、肝臟質(zhì)地變硬或腫大(肋下可觸及>2.0 cm)。ICH組患兒納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合ICH的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4,5]；②近1個(gè)月內(nèi)未接受微生態(tài)制劑或抗生素治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合納入標(biāo)準(zhǔn)；②其母孕期及哺乳期有長(zhǎng)期用藥及益生菌制劑應(yīng)用史。健康對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①足月健康兒；②年齡1歲以內(nèi)；③體格檢查及生化指標(biāo)均正常；④近期無(wú)感染性腹瀉、腸炎等病史；⑤近4周無(wú)抗生素及益生菌制劑等應(yīng)用史。健康對(duì)照組的排除標(biāo)準(zhǔn)與ICH組一致。

1.3 研究方法 將糞便標(biāo)本送至天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行高通量16SrRNA基因測(cè)序技術(shù)分析，其分析技術(shù)方法如下：①無(wú)菌器皿收集ICH患兒和健康兒童的新鮮糞便，分裝至滅菌凍存管后儲(chǔ)存到-80℃冰箱備用。②用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取糞便樣本DNA。③PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化：標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌16SrRNA基因V4區(qū)的PCR擴(kuò)增。引物信息：520F(5-AYTGGGYDTAAAGNG-3) 802R(5-TACNVGGGTATCTAATCC-3)。④文庫(kù)制備與庫(kù)檢：采用標(biāo)準(zhǔn)的Illumina Miseq PE250文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序流程。⑤測(cè)序及分析：Miseq上機(jī)測(cè)序，將所有分離的高質(zhì)量樣本序列做聚類分析，選取同源性≥97%的序列作為一個(gè)操作分類單位(OTU)。然后，以單個(gè)樣本中獲取的最低序列數(shù)作為OTU豐度的參照標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)QIIME2分析α多樣性。LEfSe差異分析(LEfSe)采用Python LEfSe包進(jìn)行(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy)。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒糞菌Alpha多樣性分析 ICH組患兒糞菌豐度顯著低于對(duì)照組，兩組間糞菌多樣性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表 1。

表1 兩組兒童糞菌 Alpha多樣性比較

2.2 兩組患兒糞菌物種構(gòu)成及豐度差異情況

2.2.1 兩組患兒糞菌門(mén)水平結(jié)構(gòu)差異 在門(mén)水平上共檢測(cè)到23個(gè)菌門(mén)，所測(cè)到的菌門(mén)中99.95%以上由變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)構(gòu)成。其中放線菌門(mén)、變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)是健康對(duì)照組糞群的三大主要菌門(mén)，三者共占糞菌的99.77%。變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)是ICH組中最具優(yōu)勢(shì)的兩大門(mén)類，其所占比例達(dá) 81.48%(見(jiàn)圖1 )。

圖1 兩組兒童糞菌間門(mén)水平結(jié)構(gòu)差異

2.2.2 兩組患兒糞菌屬水平結(jié)構(gòu)差異 在屬水平上共測(cè)得284個(gè)屬，前10位的菌屬為雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、鏈球菌屬(Streptococcus)、巨球型菌屬(Megasphaera)、梭狀桿菌屬(Clostridium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、埃希氏菌屬(Escherichia)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)。與健康對(duì)照組兒童比較，ICH組患兒糞菌中雙歧桿菌屬、腸桿菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬存在差異 (見(jiàn)圖 2) 。

圖2 兩組兒童糞菌間屬水平結(jié)構(gòu)差異

2.3 兩組患兒糞菌間LEfSe差異性分析 在糞菌門(mén)水平上，與健康對(duì)照組比較，ICH組患兒糞菌中放線菌門(mén)豐度較低，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(LDA>4，P<0.05)，見(jiàn)表2。在糞菌屬水平上，與健康對(duì)照組比較，ICH組患兒糞菌中雙歧桿菌屬豐度較低，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(LDA>4，P<0.05)。而腸球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬豐度均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均LDA>4，P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 兩組患兒糞菌間相對(duì)豐度較高菌門(mén)的比較 (%)

表3 兩組患兒糞菌間豐度存在顯著改變的菌屬比較 (%)

3 討論

肝臟與腸道之間通過(guò)門(mén)脈循環(huán)形成緊密的解剖、功能雙向聯(lián)通網(wǎng)絡(luò)。在ICH的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，腸道菌群通過(guò)調(diào)節(jié)新陳代謝、免疫反應(yīng)、膽汁酸代謝發(fā)揮著重要的作用[6]。有研究表明[7]，腸道菌群可以直接參與到ICH的發(fā)病機(jī)制中，因此研究腸道菌群具有重要價(jià)值。

本研究采用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)分析兩組患兒腸道糞菌分布情況，能彌補(bǔ)傳統(tǒng)的微生物體外培養(yǎng)導(dǎo)致的敏感性差、準(zhǔn)確率低等不足，可較全面地研究ICH患兒腸道菌群的變化。結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，ICH組患兒腸道糞菌多樣性無(wú)明顯變化，但門(mén)屬水平糞菌豐度存在不同程度改變。在門(mén)水平上，ICH組患兒糞菌中放線菌門(mén)豐度顯著降低。變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)豐度增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在屬水平上，ICH組患兒糞菌中雙歧桿菌屬豐度顯著降低，腸球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬豐度顯著增高。該結(jié)果表明ICH患兒腸腔正常優(yōu)勢(shì)菌屬(雙歧桿菌屬)受抑制，而條件致病菌屬(腸球菌屬、鏈球菌屬及腸桿菌屬)過(guò)度生長(zhǎng)。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)定植于腸道黏膜上皮細(xì)胞表面的雙歧桿菌屬，不僅能在定植區(qū)形成物理性菌膜屏障，而且能上調(diào)上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的表達(dá)，發(fā)揮腸道屏障功能，從而抑制潛在致病菌過(guò)度增長(zhǎng)。ICH患兒腸道糞菌雙歧桿菌屬豐度減少伴多種條件致病菌屬增長(zhǎng)，存在腸道菌群失衡，這一結(jié)論與江鈴等[9]采用一代測(cè)序技術(shù)研究結(jié)論基本一致，但本研究分析了腸道菌群在門(mén)、屬不同水平的異同，所得結(jié)果相對(duì)全面準(zhǔn)確。在成人常見(jiàn)的膽汁淤積型肝病原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)患者中也發(fā)現(xiàn)存在腸道菌群失衡。Rossen等[10]發(fā)現(xiàn) PSC患者腸道梭菌目豐度降低，可能通過(guò)影響膽汁酸代謝及腸道微環(huán)境參與PSC發(fā)病。Sabino等[11]發(fā)現(xiàn)PSC患者糞便腸球菌、梭菌屬及乳桿菌豐度明顯增加。Torres等[12]發(fā)現(xiàn)PSC患者Blautia及Barnesiellaceae明顯增加，主要是梭菌目發(fā)生改變。盡管與成人膽汁淤積型肝病患者腸道菌群“種和屬”層面上的研究結(jié)果存在著不同，但不可否認(rèn)ICH嬰幼兒期患兒腸道菌群也發(fā)生了紊亂。研究證實(shí)腸道微生態(tài)紊亂能導(dǎo)致腸道致病菌釋放大量?jī)?nèi)毒素等各種毒素，嚴(yán)重?fù)p傷腸道屏障結(jié)構(gòu)和功能，誘導(dǎo)大量促炎細(xì)胞因子釋放，促進(jìn)慢性肝病的發(fā)生發(fā)展[13]，因此調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡可能成為輔助治療ICH的新靶點(diǎn) 。

綜上所述，本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)明確了ICH存在腸道菌群紊亂，表現(xiàn)為腸道菌群物種的豐度降低，有益菌大量減少，條件致病菌增多，為后期ICH微生態(tài)學(xué)研究提供了部分依據(jù)。 至于其腸道菌群中是否存在標(biāo)志性差異菌種，以及調(diào)控其菌群失衡對(duì)改善臨床療效方面作用如何，有待后期進(jìn)一步大樣本研究。