枯草芽孢桿菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的促進(jìn)因子篩選及條件優(yōu)化

官雪芳 王琦 徐慶賢 孫美玲 林斌 黃菊青

摘 要：為提高枯草芽孢桿菌內(nèi)切葡聚糖酶的分泌水平，對(duì)枯草芽孢桿菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的促進(jìn)因子進(jìn)行了篩選，并通過正交試驗(yàn)進(jìn)行條件優(yōu)化，結(jié)果表明：MgSO4、VB1、VB2和大豆多糖對(duì)菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶均有顯著的促進(jìn)作用，各因子對(duì)菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的最佳促進(jìn)濃度分別為（w/v）：MgSO4 0.6%、VB1 0.2%、VB2 0.4%和大豆多糖 0.8%，正交試驗(yàn)法L934表明菌SB13最優(yōu)促酶因子組合為VB1 0.2%、VB2 0.5%、Mg2+ 1.6%、大豆多糖0.4%，優(yōu)化獲得最優(yōu)促進(jìn)溫度為30℃、pH值為7.0。通過對(duì)促進(jìn)因子的篩選及條件優(yōu)化，最終使菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶活力分別提高了200%，為高內(nèi)切葡聚糖酶水平的芽孢桿菌制劑生產(chǎn)及應(yīng)用提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌;內(nèi)切葡聚糖酶;大豆多糖;豆清水;維生素B2

中圖分類號(hào)：TQ 920.6?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：0253-2301（2021）12-0038-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.12.007

Screening of the Promoting Factors and Optimization of the Conditions forthe Production of Endoglucanase by Bacillus Subtilis SB13

GUAN Xue-fang1，2， WANG Qi1，2， XU Qing-xian1， SUN Mei-ling1， LIN Bin1*， HUANG Ju-qing1，2

[1. Institute of Agricultural Engineering Technology， Fujian Academy of Agricultural Sciences，

Fuzhou， Fujian 350002， China; 2. Fujian Key Laboratory of Agricultural Products

（Food） Processing， Fuzhou， Fujian 350002， China]

Abstract： In order to improve the secretion level of endoglucanase from Bacillus subtilis， the promoting factors for the production of endoglucanase by Bacillus subtilis SB13 were screened， and the condition optimization was carried out by orthogonal test. The results showed that MgSO4， VB1， VB2 and soybean polysaccharides all had significant promoting effects on the production of endoglucanase by Bacillus subtilis SB13. The optimal promoting concentrations of each factor for the production of endoglucanase by Bacillus subtilis SB13 were （w/v）： 0.6% MgSO4， 0.2% VB1， 0.4% VB2， and 0.8% soybean polysaccharides， respectively. The orthogonal test L934 showed that the optimal combination of enzyme-promoting factors for Bacillus subtilis SB13 was 0.2% VB1， 0.5% VB2， 1.6% Mg2+， and 0.4% soybean polysaccharides. The optimal promotion temperature was 30℃ and pH value was 7.0. By screening the promoting factors and optimizing the conditions， the activity of endoglucanase produced by Bacillus subtilis SB13 was increased by 200%， which provided reference for the production and application of Bacillus preparations with high level of endoglucanase.

Key words： Bacillus subtilis; Endoglucanase; Soybean polysaccharide; Soybean whey; Vitamin B2

內(nèi)切葡聚糖酶（endoglucanase，EC 3.2.1.4）是纖維素酶的重要組成部分，該酶主要作用于纖維素的非結(jié)晶區(qū)域，通過隨機(jī)切斷β1，4糖苷鍵，從而降解纖維素釋放出不同長(zhǎng)度的短鏈低聚糖，如纖維寡糖、纖維三糖等[1-2]。在纖維素等物質(zhì)的開發(fā)利用過程中，內(nèi)切葡聚糖酶起著非常重要的作用[3]，同時(shí)內(nèi)切葡聚糖酶還可以應(yīng)用于飼料生產(chǎn)、瓶酒及果汁等的生產(chǎn)加工中[4-5]，是自然界纖維素類物質(zhì)降解及食品工業(yè)中不可或缺的重要酶系。

內(nèi)切葡聚糖酶主要由真菌和細(xì)菌分泌獲得，細(xì)菌由于生長(zhǎng)速度快，生長(zhǎng)周期短而備受青睞，但有限的產(chǎn)酶活力一直是制約細(xì)菌廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的主要因素，因此提高細(xì)菌產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的活力使其更適合于工業(yè)生產(chǎn)一直是研究的熱點(diǎn)[6]。為提高各菌產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶效率，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，目前主要以馴化篩選、誘變育種、基因工程、化學(xué)修飾的方法居多[7-9]，例如唐自鐘等[10]采用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis C-36 的內(nèi)切葡聚糖酶基因進(jìn)行定向進(jìn)化，獲得比親本酶活力提高4.2倍的大腸桿菌突變株 F-10;寶力德等[11]將菌Bacillus.sp.bs-1的內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行克隆并在大腸桿菌中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，獲得酶活力較高的工程菌;陸寧等[12]采用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)枯草芽孢桿菌celA 263丙氨酸殘基位點(diǎn)進(jìn)行了不同的替換，但替換后內(nèi)切葡聚糖酶的活力較野生型顯著下降?；蚬こ碳夹g(shù)無疑是國(guó)內(nèi)外近年來使用的提高菌酶活力的主流技術(shù)，在獲得能分泌更高活力的內(nèi)切葡聚糖酶的同時(shí)，加入內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)酶促進(jìn)因子則可使相關(guān)高產(chǎn)菌株產(chǎn)酶效率更進(jìn)一步提升，與高產(chǎn)菌種形成互補(bǔ)作用，目前關(guān)于內(nèi)切葡聚糖酶促進(jìn)因子的研究甚少，主要體現(xiàn)在添加特異金屬離子或者表面活性劑等方法以提高酶活力[13]，但提高的效率極其有限，因此尋找其他未知內(nèi)切葡聚糖酶促進(jìn)因子，以進(jìn)一步提高酶的活力，可為其更好的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)發(fā)揮無可替代的作用。

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis作為我國(guó)獲得批準(zhǔn)可用作飼料添加劑的一類益生細(xì)菌，由于其抗逆性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)要求低、易儲(chǔ)存等獨(dú)特的生物學(xué)特性已被廣泛研究[14]。本研究通過前期篩選工作，獲得可高產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的枯草芽孢桿菌SB13，同時(shí)發(fā)現(xiàn)單獨(dú)采用豆腐黃漿水即可培養(yǎng)菌SB13，且采用黃漿水為培養(yǎng)基時(shí)菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的活力都得到極大的提高[15]，為了進(jìn)一步提高菌產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的活力，本研究以有益生特性的枯草芽孢桿菌SB13為研究對(duì)象，以離子、多糖及從豆腐黃漿水中提取獲得的大豆多糖、大豆異黃酮等物質(zhì)為對(duì)象進(jìn)行內(nèi)切葡聚糖酶促進(jìn)因子的篩選，通過最優(yōu)促進(jìn)因子及組合篩選，獲得枯草芽孢桿菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的促進(jìn)因子。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來源 枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis SB13（CGMCC No.8867）為實(shí)驗(yàn)室自有菌種，并保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。

1.1.2 試劑與耗材 無水乙醇和丙酮（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;三氯乙酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;3，5二硝基水楊酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;VB1（天津市福晨化學(xué)試劑廠）;VB2（湖北廣濟(jì)藥業(yè)股份有限公司）;MgSO4（天津市大茂化學(xué)試劑廠）;羧甲基纖維素鈉和KH2PO4（西隴化工股份有限公司）;Na2HPO4·12H2O（西隴化工股份有限公司）;酒石酸鉀鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;苯酚（天津市大茂化學(xué)試劑廠）;亞硫酸鈉（聯(lián)試化工試劑有限公司）;Tween 20（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）;Tween 80（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;香菇多糖、黃芪多糖、普魯蘭糖、殼聚糖和幾丁質(zhì)均來自北京索萊寶科技有限公司，即用型透析袋購(gòu)自默瑞生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 pH計(jì) FE20[梅特勒托利多儀器（上海）有限公司]，電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、Neofuge 15R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（力康發(fā)展香港有限公司），雙層小容量空氣浴恒溫?fù)u床NS2102C（上海皓莊儀器有限公司），Cary50型紫外可見分光光度計(jì)（美國(guó)瓦里安技術(shù)中國(guó)有限公司），SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.1.4 試驗(yàn)材料 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨、0.5%牛肉膏、1% NaCl、純凈水調(diào)整至100%、pH 7.0、高壓滅菌后保存待用。大豆多糖：取豆腐廢水（自制）濃縮至10%，加入15%三氯乙酸晶體，混勻，4℃、8500 r·min-1離心5 min。去沉淀取上清液，加入4倍體積無水乙醇混勻，4℃、8500 r·min-1離心5 min，棄去上清液，向沉淀中加入適量丙酮混勻，洗滌2～3次，離心、風(fēng)干獲得粗多糖。大豆蛋白：取100 mL豆腐廢水加入76.75 g硫酸銨固體，使其均勻溶解，在25℃、8500 r·min-1離心5 min，棄去上清液，向沉淀中加入5 mL磷酸緩沖液混勻，透析袋透析去除硫酸銨。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 促進(jìn)因子篩選 以枯草芽孢桿菌SB13為對(duì)象，分別稱取各種離子、維生素、大豆多糖、大豆異黃酮、大豆蛋白及Se等因子溶于含有50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的錐形瓶中，以未加物質(zhì)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，調(diào)pH至7.0，121℃、20 min高壓滅菌，根據(jù)1%的量接種菌SB13母液，37℃、160 r·min-1恒溫培養(yǎng)20 h，每一處理3個(gè)重復(fù)，即獲得菌SB13發(fā)酵液。以發(fā)酵液內(nèi)切葡聚糖酶相對(duì)活性為指標(biāo)，分析各因子對(duì)菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖的促進(jìn)效果，其中內(nèi)切葡聚糖酶活力檢測(cè)方法為：吸取各樣品發(fā)酵液2 mL，10000 r·min-1，4℃離心10 min獲得胞外上清液，DNS法檢測(cè)上清液中內(nèi)切葡聚糖酶活力，酶活計(jì)算等參考Guan等[15]。基于多糖的種類繁多，研究同時(shí)分析香菇多糖、黃氏多糖、殼聚糖、普魯蘭糖和幾丁質(zhì)對(duì)菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的促進(jìn)效果，最終確定最佳促進(jìn)因子類型。

1.2.2 促進(jìn)因子的濃度篩選 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入VB1和VB2至終濃度分別為（w/v） 0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%，Mg2+（w/v 0.6%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0 %），多糖（w/v 0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%），接種枯草芽孢桿菌SB13，160 r·min-1、37℃培養(yǎng)20 h，檢測(cè)胞外液中內(nèi)切葡聚糖胞外酶活力，確定最佳促進(jìn)濃度。

1.2.3 正交試驗(yàn)篩選最優(yōu)促進(jìn)組合 采用L934正交法對(duì)MgSO4、VB1、VB2、大豆多糖四因子及濃度進(jìn)行枯草芽孢桿菌SB13產(chǎn)酶切葡聚糖酶活性檢測(cè)分析，篩選出菌產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的最優(yōu)發(fā)酵條件組合，各因素添加濃度見表1。

1.2.4 枯草芽孢桿菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶促進(jìn)溫度及pH值優(yōu)化 根據(jù)最優(yōu)促進(jìn)濃度、分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入各促進(jìn)因子，進(jìn)行不同溫度（15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃），不同發(fā)酵pH值（5～9）條件下菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的活力檢測(cè)分析，篩選出最優(yōu)產(chǎn)酶促進(jìn)溫度及pH值。

2 結(jié)果與分析

2.1 促進(jìn)因子篩選

2.1.1 各因子對(duì)枯草芽孢桿菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的影響 從表2可知，MgSO4、VB1、VB2、大豆多糖對(duì)菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的相對(duì)酶活分別為114.66%、111.24%、165.72% 和152.61%，說明以上物質(zhì)對(duì)菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶有極好的促進(jìn)作用，其中大豆多糖及VB2可提高對(duì)內(nèi)切葡聚糖的產(chǎn)酶率達(dá)50%以上。

2.1.2 多糖類物質(zhì)對(duì)菌產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的影響 由圖1可知，香菇多糖、黃氏多糖對(duì)菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶有顯著的促進(jìn)作用，相對(duì)酶活分別達(dá)到197.44%和186.95%，與大豆多糖（194.07%）效果相當(dāng)，最終挑選大豆多糖為產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的最佳促進(jìn)因子。

2.2 促進(jìn)因子最優(yōu)條件組合

2.2.1 各促進(jìn)因子最適促進(jìn)濃度優(yōu)化 由圖2可知，VB1（圖2a）、大豆多糖（圖2d）對(duì)菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的最佳促進(jìn)濃度分別為0.2%和0.8%;VB2（圖2b）、MgSO4（圖2C）對(duì)菌SB13最佳促進(jìn)濃度分別為0.4%和1.5%。由于濃度為0.6%～1.5%的MgSO4對(duì)菌SB13促進(jìn)效果差異不顯著，故選0.6%最為最佳促進(jìn)濃度。

2.2.2 正交試驗(yàn)篩選因子最佳條件組合 正交法L934分析促進(jìn)因子VB1、VB2、Mg2+、大豆多糖對(duì)菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶最佳促進(jìn)組合（表4）。極差R值大小可見，各因子對(duì)菌產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的影響為B>D>A>C（菌SB13），即VB2影響最大，大豆多糖次之，VB1、鎂離子影響最小;最優(yōu)促進(jìn)組合為A3B3C3D1（菌SB13），產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的最優(yōu)工藝條件為0.2%VB1、0.5%VB2、1.6%Mg2+、0.4%大豆多糖。

2.3 各因子對(duì)菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的最適發(fā)酵條件

2.3.1 最適溫度優(yōu)化 由圖3可知，溫度在30℃時(shí)，加入MgSO4、VB1、VB2、大豆多糖及最優(yōu)組合后，菌SB13的內(nèi)切葡聚糖酶活力分別為0.80、0.50、0.97、1.27和1.44 U·mL-1，均高于對(duì)照組的0.48 U·mL-1，各因子酶活力分別是對(duì)照的1.67、1.04、2.02、2.65和3倍，表現(xiàn)出極好的促進(jìn)作用，故選取30℃作為各因子促進(jìn)菌SB13的最佳促進(jìn)溫度。

2.3.2 最適pH值優(yōu)化 分析不同pH值條件下，各促進(jìn)因子對(duì)菌SB13的產(chǎn)酶效果，由圖4可知，當(dāng)pH值為7.0時(shí)，加入MgSO4、VB1、VB2、大豆多糖及最優(yōu)組合后，菌SB13的內(nèi)切葡聚糖酶活力分別為0.52、0.67、0.76、0.95和1.07（U·mL-1），均高于對(duì)照0.49 U·mL-1，各因子酶活力分別是對(duì)照的1.06、1.37、1.55、1.94和2.18倍，故選擇7.0為最適促進(jìn)pH值。

3 結(jié)論與討論

本研究系統(tǒng)地分析了各種離子、各種維生素、大豆蛋白、大豆異黃酮、EDTA、大豆多糖及其他部分物質(zhì)的多糖對(duì)枯草芽孢桿菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的影響，發(fā)現(xiàn)MgSO4、VB1、VB2、香菇多糖、黃氏多糖和大豆多糖對(duì)其產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，其中VB2、香菇多糖、黃氏多糖和大豆多糖促進(jìn)效果極顯著。為了進(jìn)一步提高菌SB13等產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的發(fā)酵工藝，本研究確定Mg2+、VB1、VB2和大豆多糖為主要內(nèi)切葡聚糖酶促進(jìn)因子進(jìn)行了因子組合優(yōu)化及條件優(yōu)化分析。

通過對(duì)各因子加入量的優(yōu)化，各因子對(duì)菌SB13促產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的最佳促進(jìn)濃度分別為（w/v）：MgSO4 0.6%、VB1 0.2%、VB2 0.4%和大豆多糖 0.8%，采用正交法L934對(duì)四因子進(jìn)行了最優(yōu)條件組合分析，確定菌SB13的最優(yōu)發(fā)酵條件組合為0.2 % VB1、0.5 % VB2、1.6% MgSO4、0.4% 大豆多糖，優(yōu)化獲得最優(yōu)促進(jìn)溫度為30℃，最優(yōu)促進(jìn)pH值為7.0。本研究通過對(duì)促進(jìn)因子的篩選及條件優(yōu)化，最終使枯草芽孢桿菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的活力提高了200%，為枯草芽孢桿菌SB13更好的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)提供研究基礎(chǔ)。

已有研究表明各種氮源、金屬離子、維生素的添加，會(huì)使纖維素分解酶的產(chǎn)生水平發(fā)生明顯的變化[16]，程旺開[17]研究金屬離子對(duì)纖維素酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)MgSO4對(duì)β葡萄糖苷酶活性具有一定的促進(jìn)作用，本次研究發(fā)現(xiàn)Mg2+對(duì)菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶有一定的促進(jìn)作用，是否Mg2+也通過影響內(nèi)切葡聚糖酶的活性而使內(nèi)切葡聚糖酶活力得到提高，還需進(jìn)一步研究。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)纖維素的酶解產(chǎn)物之一纖維二糖能被吸收進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)諸多真菌產(chǎn)纖維素酶[18]，這些水解的纖維二糖主要通過與定位于細(xì)胞膜上的纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Crtl相結(jié)合后形成纖維素酶誘導(dǎo)信號(hào)經(jīng)下游信號(hào)途徑的傳遞進(jìn)入細(xì)胞核激活纖維素酶的表達(dá)[19]。除了纖維二糖，多種其他類型的二糖也被證實(shí)能直接誘導(dǎo)真菌產(chǎn)纖維素酶：Mandels等[20]發(fā)現(xiàn)，從含有雜質(zhì)的試劑級(jí)的葡萄糖中分離出的槐糖（由2個(gè)葡萄糖分子經(jīng)過β1，2糖苷鍵連接所形成） 可直接誘導(dǎo)里氏木霉產(chǎn)纖維素酶，其誘導(dǎo)活性是纖維二糖的2500倍，是微晶纖維素等其他誘導(dǎo)物的幾十到幾千倍，但槐糖卻不能誘導(dǎo)其他菌如青酶、曲霉及枯草芽孢桿菌等產(chǎn)纖維素酶;乳糖（由葡萄糖及半乳糖經(jīng)過β1，4糖苷鍵連接形成）也可以直接誘導(dǎo)里氏木霉和其他真菌產(chǎn)纖維素酶，該糖對(duì)里氏木霉的誘導(dǎo)能力弱于槐糖，但可顯著促進(jìn)絲狀真菌Acremoniumcellulolyticus高效合成纖維素酶[21]。山梨糖則通過在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控6種纖維素酶基因的表達(dá)，影響細(xì)胞壁蛋白的糖基化，降低細(xì)胞壁的形成來提高內(nèi)切葡聚糖苷酶Ⅰ和外切葡聚糖苷酶Ⅱ的分泌和表達(dá)

[22-23]。本研究基于這樣的啟示，從豆腐黃漿水中提取分離了大豆多糖，并發(fā)現(xiàn)其同樣對(duì)菌SB13產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶有極顯著的促進(jìn)作用，是否大豆多糖通過其酶解產(chǎn)物促進(jìn)內(nèi)芽孢桿菌對(duì)內(nèi)切葡聚糖的分泌，其促進(jìn)機(jī)理有待進(jìn)一步探索。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）

收稿日期：2021-09-10

作者簡(jiǎn)介：官雪芳，女，1979年生，碩士研究生，助理研究員，主要從事微生物學(xué)應(yīng)用研究。

通信作者：林斌，男，1964年生，博士研究生，研究員，主要從事農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用（E-mail：linbin591@126.com）。

基金項(xiàng)目：福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目——省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)（2019R1032-4）;福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院“十三五”食品加工科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（CXTD2021032）。