建神曲發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè)分析

摘 要：為明確建神曲發(fā)酵過(guò)程中的微生物種類、優(yōu)勢(shì)群落組成及功能特征，采用高通量測(cè)序和分析技術(shù)對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的建神曲細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)和基因功能進(jìn)行分析。結(jié)果表明，建神曲發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌種類較少，主要由Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria等4個(gè)門細(xì)菌組成，不同發(fā)酵階段的建神曲共有1個(gè)核心菌群;在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，優(yōu)勢(shì)菌群的豐度出現(xiàn)明顯的變化趨勢(shì)，表明建神曲的發(fā)酵過(guò)程存在清晰的細(xì)菌演替過(guò)程;PICRUSt基因功能預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，在豐度排前50的KEGG功能基因KOs中，有22個(gè)KOs與酶相關(guān)，有49個(gè)KOs的豐度在不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)之間存在顯著性差異（P<0.05），說(shuō)明建神曲中的細(xì)菌含有豐富的與代謝途徑相關(guān)基因，且不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的生理功能不同。

關(guān)鍵詞：建神曲;發(fā)酵過(guò)程;高通量測(cè)序;細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu);基因功能預(yù)測(cè)

中圖分類號(hào)：Q 938?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：0253-2301（2021）12-0007-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.12.002

Analysis on Microbial Community Structure and Function Prediction Duringthe Fermentation of Jianshenqu

LIAO Qian

（Fujian Pharmaceutical Examination and Inspection Center， Fuzhou， Fujian 350001， China）

Abstract： In order to clarify the microbial species， dominant community composition and functional characteristics during the fermentation of Jianshenqu， the high-throughput sequencing and analysis techniques were used to analyze the bacterial community structure and gene function of Jianshenqu bacteria at different fermentation time points. The results showed that there were few bacterial species in the fermentation process of Jianshenqu， which were mainly composed of Firmicutes， Proteobacteria， Bacteroidetes and Actinobacteria. There was one core flora in Jianshenqu at different fermentation stages. During the whole fermentation process， the abundance of the dominant flora showed an obvious trend of change， indicating that there was a clear bacterial succession process in the fermentation process of Jianshenqu. The results of PICRUSt gene function prediction analysis showed that among the KEGG functional gene KOs with the top 50 abundances， 22 KOs were related to enzymes， and the abundance of 49 KOs was significantly different at different fermentation time points （P<0.05）， indicating that the bacteria in Jianshenqu contained abundant genes related to metabolic pathway， and the physiological functions were different at different fermentation time points.

Key words： Jianshenqu; Fermentation process; High-throughput sequencing; Bacterial community structure; Gene function prediction

建神曲，產(chǎn)自福建泉州，又名泉州神曲、范志曲、百草曲，主要為面粉、小麥、麩皮與砂仁、廣陳皮、廣藿香等藥物混合后發(fā)酵而成的加工品[1]。建神曲肇始于明、清年間，迄今已有400多年歷史，在《本草綱目拾遺》《蔡氏藥貼》《藥性考》等古今中醫(yī)書(shū)中均有詳載[2]。建神曲主要用于傷食胸痞，腹痛吐瀉，痢疾、外感風(fēng)寒，小兒傷饑失飽以及旅行中水土不服而引起的腸胃不和。《本草綱目拾遺》曰：氣味中和，清香甘淡，能搜風(fēng)解表，開(kāi)胸塊隔，調(diào)胃健脾，消積進(jìn)食，和中解酒，止瀉利水，治四時(shí)不正之氣，感冒發(fā)熱，頭?？人约皞掣雇?，痞滿氣痛，嘔吐瀉泄痢疾，飲食不進(jìn)等癥[3]。

根據(jù)《福建省中藥飲片炮制規(guī)范（2012年修訂）》記載，建神曲的制法是將麩皮、面粉、小麥與砂仁、廣陳皮、廣藿香等藥材經(jīng)處理后混勻，搗軟壓模制成長(zhǎng)方形小塊，蒸1 h，經(jīng)自然發(fā)酵后，取出曬干或低溫干燥，刷凈外表，包裝即得。從現(xiàn)代微生物學(xué)的角度來(lái)看，建神曲發(fā)酵過(guò)程的實(shí)質(zhì)為微生物生長(zhǎng)、演替、互作和代謝的過(guò)程，通過(guò)微生物和酶的催化分解作用，使藥物發(fā)泡、生衣，產(chǎn)生微生物次生代謝產(chǎn)物、消化酶、低聚糖等新的活性成分協(xié)助消化系統(tǒng)發(fā)揮正常功能[4-5]。自然發(fā)酵工藝由于不同發(fā)酵周期的溫濕度條件存在差異且發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，造成參與發(fā)酵的微生物的數(shù)量和種類不確定，會(huì)導(dǎo)致同一產(chǎn)地不同批次的產(chǎn)品質(zhì)量存在差異。利用優(yōu)勢(shì)菌種建立現(xiàn)代混合發(fā)酵炮制工藝，可以改善自然發(fā)酵過(guò)程雜菌多、時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端[6]。但目前對(duì)建神曲發(fā)酵過(guò)程中的菌群結(jié)構(gòu)組成的研究報(bào)道較少。因此，本研究采用高通量測(cè)序和分析技術(shù)明確建神曲發(fā)酵過(guò)程中的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能特征，為后續(xù)建神曲建立穩(wěn)定可控的現(xiàn)代發(fā)酵工藝提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本試驗(yàn)建神曲樣品采自泉州中僑藥業(yè)有限公司的“老范志萬(wàn)應(yīng)神曲”，發(fā)酵周期約為12 d。本試驗(yàn)選擇發(fā)酵前（0 d）、發(fā)酵中期（6 d）和發(fā)酵結(jié)束（12 d）時(shí)進(jìn)行取樣，編號(hào)分別為D0、D6、D12。每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)分別隨機(jī)取3個(gè)建神曲長(zhǎng)方形小塊，為減少外界環(huán)境雜菌的干擾，用無(wú)菌手術(shù)刀切取建神曲長(zhǎng)方形小塊中心樣品2～3 g，切下的樣品放置于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增

保存的建神曲樣品DNA采用土壤微生物DNA提取試劑盒（Mobio，USA）提取，提取步驟依據(jù)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取后的基因組DNA采用16S rRNA基因V3～V4區(qū)片段通用引物對(duì)341F和805R擴(kuò)增。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用PCR純化試劑盒（Qiagen， Germany）純化，再用Qubit 3.0 熒光定量?jī)x（Invitrogen， USA）進(jìn)行定量。

1.3 IlluminaMiSeq測(cè)序與高通量數(shù)據(jù)分析

純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Illumina MiSeq平臺(tái)高通量測(cè)序，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。測(cè)序得到的高通量原始數(shù)據(jù)先去除測(cè)序時(shí)加入的正反向引物[7]，再根據(jù)序列之間的overlap關(guān)系將成對(duì)的reads拼接成一條完整的序列[8]，對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾[9]。得到的有效序列再去除嵌合體和冗余序列以及劃分分類操作單元（OTUs）[10]，將OTU代表序列與Ribosomal Database Project（RDP）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)進(jìn)行物種注釋。利用Mothur軟件和QIIME軟件對(duì)生物樣本的alpha多樣性和beta多樣性進(jìn)行分析[11-12]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

在本研究中平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和P-values采用SPSS軟件計(jì)算，多重比較分析采用Tukey′s HSD檢驗(yàn);柱狀圖、韋恩圖和熱圖采用R軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析

從表1可知，3個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的9個(gè)建神曲樣品獲得的16S rRNA基因有效序列數(shù)為48372～67995條，OTUs數(shù)為156～199個(gè)且OUTs覆蓋率（Good′s coverage）均>99%，表明建神曲中的細(xì)菌種類較少，且高通量測(cè)序獲取的數(shù)據(jù)量能夠真實(shí)地反映樣品的細(xì)菌多樣性情況。Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，發(fā)酵前和發(fā)酵結(jié)束樣品中的Simpson指數(shù)顯著高于發(fā)酵中期樣品（P<0.05），而發(fā)酵前和發(fā)酵結(jié)束樣品中的Shannon指數(shù)顯著低于發(fā)酵中期樣品（P<0.05），表明建神曲在發(fā)酵前和發(fā)酵結(jié)束時(shí)的樣品細(xì)菌個(gè)體數(shù)目在群落中分配的均勻程度比發(fā)酵中期差，也反應(yīng)建神曲發(fā)酵過(guò)程存在細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群的演替過(guò)程。根據(jù)Beta多樣性距離矩陣進(jìn)行PCoA分析，結(jié)果（圖1）表明相同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)樣品的微生物結(jié)構(gòu)和組成十分相似，不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)樣品的微生物組成結(jié)構(gòu)存在明顯差異。

2.2 建神曲發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征及演替分析

在門水平，建神曲主要由Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria等4個(gè)細(xì)菌門組成（圖2）。從整個(gè)發(fā)酵過(guò)程來(lái)看，4個(gè)細(xì)菌門的豐度都出現(xiàn)明顯的變化，發(fā)酵前期與發(fā)酵結(jié)束時(shí)4個(gè)細(xì)菌門的差異均達(dá)到顯著（P<0.05）或極顯著水平（P<0.01）。發(fā)酵前期最優(yōu)勢(shì)菌門Proteobacteria的豐度逐漸下降，次優(yōu)勢(shì)菌門Firmicutes的豐度逐漸上升，到發(fā)酵結(jié)束時(shí)建神曲中的最優(yōu)勢(shì)菌門變?yōu)镕irmicutes。

在屬水平，建神曲中主要由Lactobacillus、Pseudomonas、Bacillus、Pseudoxanthomonas、Pediococcus、Streptomyces、Flavobacterium、Weissella、Acinetobacter、Clostridium_sensu_stricto、Sphingobacterium、Paenibacillus、Chitinophaga、Comamonas、unclassified_Alcaligenaceae等12個(gè)細(xì)菌屬組成（圖3）。發(fā)酵前期最優(yōu)勢(shì)菌群為Pseudomonas（75.43±12.34）%，發(fā)酵中期和發(fā)酵結(jié)束時(shí)下降為（2.32±1.31）%和（6.12±1.32）%;發(fā)酵中期的優(yōu)勢(shì)菌群為L(zhǎng)actobacillus、Pseudoxanthomonas和Pediococcus，其豐度分別達(dá)到（25.62±14.58）%、（25.55±16.64）%和（19.96±9.02）%，發(fā)酵結(jié)束時(shí)Lactobacillus成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，豐度達(dá)到（71.98±12.16）%，說(shuō)明整個(gè)發(fā)酵過(guò)程存在明顯的細(xì)菌演替過(guò)程。

2.3 不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)建神曲細(xì)菌群落組成比較分析

通過(guò)構(gòu)建韋恩圖對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)建神曲所共有的和特有的OTU數(shù)目進(jìn)行分析（圖4）。從分析結(jié)果可以看出，9個(gè)建神曲樣品中細(xì)菌OTUs總共258個(gè)，其中共有OTUs數(shù)為166個(gè)，分別占發(fā)酵前期、發(fā)酵中期和發(fā)酵結(jié)束時(shí)OTUs總數(shù)的75.11%、74.44%和80.19%;而發(fā)酵前期、發(fā)酵中期和發(fā)酵結(jié)束時(shí)的建神曲中的特有OTUs數(shù)分別為19、8和4個(gè)，分別占OTUs總數(shù)8.60%、3.59%和1.93%;說(shuō)明盡管不同發(fā)酵時(shí)期建神曲中的優(yōu)勢(shì)菌群不同，但不同發(fā)酵時(shí)期建神曲中的菌群種類基本一致。

2.4 建神曲細(xì)菌群落功能PICRUSt預(yù)測(cè)分析

對(duì)細(xì)菌的基因功能進(jìn)行預(yù)測(cè)有助于理解建神曲中化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化過(guò)程。通過(guò)PICRUSt分析，9個(gè)建神曲樣品共鑒定出5605個(gè)KEGG功能基因KOs，對(duì)應(yīng)于41個(gè)2級(jí)功能層和328個(gè)3級(jí)功能層。選擇豐度前50的KEGG功能基因KOs繪制熱圖（圖5）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，50個(gè)優(yōu)勢(shì)KOs中有22個(gè)KOs與酶相關(guān)，且除K09687外剩余49個(gè)KOs豐度在不同發(fā)酵點(diǎn)均存在顯著性差異（P<0.05）;表明建神曲中含有豐富的與代謝途徑相關(guān)的細(xì)菌功能基因以及不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)微生物所起的功能不同。

3 結(jié)論與討論

自然界中蘊(yùn)藏著大量未被人們熟知的微生物資源，使用傳統(tǒng)鑒定方法只能對(duì)可培養(yǎng)微生物進(jìn)行鑒定，由于嚴(yán)格的專性厭氧環(huán)境和特殊的營(yíng)養(yǎng)需求，使得其很難得到樣本中的整個(gè)微生物結(jié)構(gòu)組成情況[13]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，這一問(wèn)題得到了解決。近幾年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)高通量技術(shù)在多種環(huán)境樣品中的微生物多樣性方面都取得了初步進(jìn)展[14]。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)建神曲發(fā)酵樣品中微生物菌落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，確定了建神曲樣品中的細(xì)菌主要由Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria等4個(gè)細(xì)菌門組成。從高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析，建神曲中的細(xì)菌種類相對(duì)簡(jiǎn)單，但核心菌群基本一致，這可能與建神曲中的藥物成分對(duì)細(xì)菌物種存在自然選擇作用有關(guān)。

優(yōu)勢(shì)菌種發(fā)酵技術(shù)是利用傳統(tǒng)發(fā)酵菌種中的某種單一特定的有益菌株進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間短、容易形成規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)酵，同時(shí)可減少雜菌的產(chǎn)生[6]。從菌群結(jié)構(gòu)和PICRUSt基因功能預(yù)測(cè)分析結(jié)果來(lái)看，各發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的建神曲細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群和生理功能存在顯著的差異（P<0.05），說(shuō)明在建神曲發(fā)酵過(guò)程中不同階段的細(xì)菌所起的作用不同;從差異變化趨勢(shì)分析，發(fā)酵結(jié)束時(shí)的優(yōu)勢(shì)菌群在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的豐度是逐漸增加的，說(shuō)明建神曲在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中存在清晰的細(xì)菌演替過(guò)程，而優(yōu)勢(shì)菌群是需要在合適的環(huán)境下逐步演替顯現(xiàn)出來(lái)。因此，如果僅采用某種單一的特定菌種進(jìn)行發(fā)酵并不能達(dá)到混合菌種發(fā)酵的互補(bǔ)優(yōu)勢(shì)[5]。因此，分階段探索建神曲中發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌株及功能，采用多種益生菌混合接力發(fā)酵的生產(chǎn)工藝，或能達(dá)到更好的效果。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）

收稿日期：2021-10-12

作者簡(jiǎn)介：廖茜，女，1985年生，主管藥師，主要從事藥物微生物方面的研究。