重癥急性胰腺炎大鼠CARD9的早期表達(dá)及柴芩承氣湯的干預(yù)研究*

門昌君，張平平，劉 鈺，張國梁△，王東強(qiáng)

(1.天津市第一中心醫(yī)院消化科，天津 300192；2.天津市第一中心醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，天津 300192；3.天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是一種以胰腺自身消化、壞死為主要特征引起的消化道組織水腫、胃腸道蠕動(dòng)功能減退、黏膜屏障功能受損，并可引起全身炎性反應(yīng)或?qū)е露嗥鞴俟δ苷系K的一種臨床綜合征[1]。因其病情進(jìn)展快速、病死率高達(dá)30%～40%、預(yù)后差，易出現(xiàn)多器官衰竭(multiple organs dysfunction syndrome,MODS)，是臨床上常見的危重急腹癥[2]，并有近20%的急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)被診斷為SAP[3]。SAP發(fā)生后多種炎癥細(xì)胞被激活，釋放出白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-10及其他炎性因子并啟動(dòng)全身炎性反應(yīng)，導(dǎo)致胰腺組織細(xì)胞凋亡即“炎性介質(zhì)瀑布樣級聯(lián)效應(yīng)”[4-5]。因此，在SAP早期控制炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，是提高患者的生存率和改善預(yù)后的重中之重。胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain-containing protein 9，CARD9)是在巨噬細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的一種新型蛋白，作為多數(shù)受體路徑的載體，可以激活多種炎性反應(yīng)信號傳遞路徑，促進(jìn)炎性因子的生成。有研究發(fā)現(xiàn)，在早期AP患者外周血中，CARD9 mRNA表達(dá)明顯增高，且磷酸化CARD9的表達(dá)水平與胰腺炎病情程度呈正相關(guān)[6]。柴芩承氣湯是在中醫(yī)“益活清下”治療思想下加用活血化瘀、行氣止痛化裁而成，以大黃、芒硝為主，輔以厚樸、黃芩、柴胡等中藥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，該方劑能清除腸道生物屏障，能清除腸源性內(nèi)毒素、抑制蛋白酶激活和腸道細(xì)菌移位，清除血漿和組織內(nèi)炎性反應(yīng)遞質(zhì)和氧自由基，阻斷感染作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，柴芩承氣湯作用于膽堿能通路上調(diào)巨噬細(xì)胞乙酰膽堿受體α7(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7-nAChR)的表達(dá)[8]，減少SAP炎性介質(zhì)釋放及胰腺的病理損害[9]。本研究重點(diǎn)檢測SAP大鼠胰腺組織CARD9早期表達(dá)并探討柴芩承氣湯對病情的干預(yù)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取健康SD大鼠60只，體重220～280 g，雌雄不限，待其適應(yīng)國家衛(wèi)生健康委員會(huì)危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津市第一中心醫(yī)院)的實(shí)驗(yàn)室條件生存1周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其食用的標(biāo)準(zhǔn)飼料由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，單籠飼養(yǎng)、自由飲食飲水，所有的實(shí)驗(yàn)操作均符合《中國動(dòng)物研究協(xié)會(huì)》的所有規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物模型制備

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前禁食12 h，稱重后通過行腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛3.5 mL/kg麻醉。待全身麻醉后備皮，保持仰臥位。于劍下沿腹壁正中線開腹、暴露胃及十二指腸，確定十二指腸乳頭位置，肝臟下墊無菌棉保護(hù)肝組織，于肝門處與小動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉膽管，于十二指腸乳頭開口插入1 mL注射器后將5%牛磺去氧膽酸鈉(1.0 mL/kg)逆行進(jìn)入膽胰管，注射速度約為0.2 mL/min。注射完畢待藥液擴(kuò)散2 min后松開小動(dòng)脈夾、拔出注射器、取出肝下無菌棉關(guān)閉腹腔。大鼠蘇醒后，可自由飲水、保持禁食的狀態(tài)，直至出現(xiàn)大鼠胰腺組織水腫、出血或壞死等改變時(shí)提示建模成功，見圖1。

A：開腹；B：夾閉肝門部膽管、保留胰膽管；C：逆行緩慢注入5%牛磺去氧膽酸鈉；D：SAP模型胰腺。

1.2.2分組

將SD大鼠分為假手術(shù)組(SHAM組)、SAP組、柴芩承氣湯組(CQCQD組)，每組20只。SAP大鼠建模完成3 h后，SHAM組于開腹后翻動(dòng)胰腺數(shù)次后縫合腹壁；按照10 mL/kg予CQCQD組柴芩承氣湯灌胃；SHAM組及SAP組均予生理鹽水灌胃。

1.2.3標(biāo)本采集及檢測

(1)血清淀粉酶(AMY)：建模24 h后麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血5 mL，離心后吸取上層透明血清標(biāo)本分裝標(biāo)記，—80 ℃保存檢測AMY。(2)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β：采用ELISA試劑盒檢測血清TNF-α、IL-1β水平。

1.2.4CARD9 mRNA表達(dá)水平檢測

采用RNA提取試劑盒提取胰腺組織中的總RNA，以其為模板逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。再按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) SYBR Green法步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增，qPCR條件：95 ℃預(yù)變性3 min；PCR循環(huán)為95 ℃ 5 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)周期。循環(huán)完畢后進(jìn)行熔解曲線分析。每個(gè)標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，經(jīng)過3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCt值計(jì)算CARD9 mRNA的表達(dá)水平。PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(日本TaKaRa公司)，熒光定量PCR儀(LightCycler 96,瑞士羅氏公司)。CARD9上游引物：5′-ATT GAC CCC TCA CGA ATC AC-3′；下游引物5′-AGG AGC ACA CCC ACT TTC C-3′。內(nèi)參U6上游引物：5′-TGC GGG TGC CTG CTT CGG CAG CAC-3′；下游引物：5′-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2.5計(jì)算病理評分

術(shù)后3、6和12 h分批處死大鼠，取部分胰腺組織置于—196 ℃液氮罐保存；剩余胰腺組織置入甲醛固定液中24 h后，予液體石蠟包埋后以2 μm連續(xù)切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察病理學(xué)特征。從細(xì)胞水腫、炎性細(xì)胞浸潤、出血和脂肪壞死4個(gè)方面進(jìn)行綜合評分。

1.2.6Western-blot法檢測CARD9蛋白磷酸化水平

50 μg蛋白上樣于10%聚丙烯酰胺凝膠上，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；半干法轉(zhuǎn)印分離蛋白到聚偏氟乙烯(PVDF)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜，1∶1 000一抗孵育PVDF膜，4 ℃過夜；二抗孵育PVDF膜1 h，ECL化學(xué)放光試劑發(fā)光顯色。

1.2.7中藥給藥方劑及配制

方劑組成：金銀藤30 g，蒲公英30 g，柴胡15 g，黃芩15 g，青香藤10 g，金鈴子10 g，陳皮10 g，大黃10 g，芒硝10 g。根據(jù)《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)給藥劑量折算公式》計(jì)算給藥量，本研究中所用藥材均為“江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司”生產(chǎn)的配方顆粒劑(批號：1701136)。顆粒劑混合后，加入蒸餾水800 mL攪拌直至溶解；后分裝為100 mL，于4 ℃冰箱保存，灌胃前給予37 ℃恒溫水浴鍋預(yù)熱。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 AMP、TNF-α及IL-1β水平變化

SAP組AMP、IL-1β水平隨造模時(shí)間延長而逐漸升高，TNF-α先升高后降低。與SHAM組比較，其炎性因子水平明顯升高(P<0.05)。同時(shí)間點(diǎn)CQCQD組AMP、TNF-α及IL-1β水平較SAP組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2 胰腺組織中CARD9 mRNA水平變化

SAP組CARD9 mRNA水平隨著建模時(shí)間延長而逐漸升高。與SHAM組比較，SAP組CARD9 mRNA水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)間點(diǎn)CQCQD組CARD9 mRNA較SAP組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組AMY、TNF-α、IL-1β及CARD9 mRNA水平變化

續(xù)表1 各組AMY、TNF-α、IL-1β及CARD9 mRNA水平變化

2.3 胰腺組織病理及評分

SHAM組胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，偶見紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤，未見腺泡小葉受損及腺泡細(xì)胞壞死。SAP組腺泡細(xì)胞變性壞死增多，小葉結(jié)構(gòu)破壞更為明顯，炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤增加，隨建模時(shí)間延長，胰腺病理評分增高。CQCQD組3、6、12 h胰腺組織病理損傷和評分[(5.9±0.4)、(8.9±1.7)、(10.1±1.1)分]均較SAP組[(9.9±1.9)、(11.6±2.5)、(12.8±2.4)分]低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

A：SHAM組；B：SAP組；C：CQCQD組。

2.4 胰腺組織中CARD9蛋白的磷酸化檢測

以磷酸化CARD9條帶與β-actin條帶灰度值之比表示CARD9蛋白的磷酸化水平，在3、6及12 h時(shí)間點(diǎn)CQCQD組蛋白磷酸化水平較SAP組明顯下降，較SHAM組有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

a：P<0.05，與SHAM組比較；b：P<0.05，與SAP組比較。

2.5 TNF-α、IL-1β、病理評分及CARD9 mRNA表達(dá)的ROC曲線分析

TNF-α表達(dá)水平的AUC值為0.842(P<0.05)，靈敏度和特異度分別為78.4%、68.5%；IL-1β表達(dá)水平的AUC值為0.887(P<0.05)，靈敏度和特異度分別為88.4%、91.0%；病理評分的AUC值為0.888(P<0.05)，靈敏度和特異度分別為85.4%、92.2%；CARD9 mRNA表達(dá)的AUC值為0.923(P<0.05)，靈敏度和特異度分別為89.9%、94.8%。SAP大鼠模型CARD9 mRNA表達(dá)水平靈敏度、特異度及AUC值最高，有較高的診斷準(zhǔn)確性，見圖4。

圖4 SAP大鼠模型ROC曲線

3 討 論

CARD9是1個(gè)重要的銜接蛋白，屬于包含CARD蛋白家族中的一員，定位于染色體9q34.3，CARD9 cDNA全長2 108 bp。其能與巨噬細(xì)胞內(nèi)2個(gè)含有CARD 結(jié)構(gòu)域的蛋白B細(xì)胞淋巴瘤因子10(B-cell lymphoma factor10，BCL10)、黏膜相關(guān)組織淋巴瘤易位蛋白(mucosa associated tissue lymphoma translocating protein，Maltl)結(jié)合，形成CARD9/Bcl10/Maltl復(fù)合體(CARD9復(fù)合體)。有研究發(fā)現(xiàn)，CARD9主要參與固有免疫炎性反應(yīng)，而巨噬細(xì)胞在固有免疫炎性反應(yīng)中起重要作用[10]。已有研究表明，CARD9作為核因子-κB (nuclear factor-kappa B,NF-κB)炎癥信號通路的上游分子，促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和釋放炎性因子，對激活巨噬細(xì)胞起到重要作用[11]。目前已經(jīng)證實(shí)，NF-κB與p38-絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是SAP發(fā)病機(jī)制中調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的兩條主要通道[12-13]。本研究通過建立SAP大鼠模型，檢測各組各時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-1β及CARD9 mRNA表達(dá)水平的變化，得出CARD9 mRNA隨建模時(shí)間延長的增高趨勢及與SAP的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)；同時(shí)，SAP組大鼠AMY、TNF-α、IL-1β水平及胰腺病理評分均明顯升高且隨建模時(shí)間延長逐漸增加，驗(yàn)證了CARD9等作為新靶標(biāo)在SAP發(fā)病早期的標(biāo)志性意義。

劉媛琪等[14]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大黃可降低內(nèi)毒素的吸收，抑制TNF-α和IL-1β的表達(dá)，有解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制胃酸和胰蛋白酶分泌等作用[15]。XUE等[16]研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷作用于SAP 大鼠時(shí)，可抑制NF-κB活化，減少TNF-α、IL-6表達(dá)，改善肝臟損傷。相關(guān)研究表明黃芩與柴胡配伍具有良好的保肝作用[17-18]。厚樸有抗病原微生物作用，芒硝可促進(jìn)腸內(nèi)毒素的排泄，枳實(shí)水煎液可促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)。柴芩承氣湯可排除胃腸積滯、清除腸道內(nèi)的細(xì)菌和內(nèi)毒素，保護(hù)腸道的機(jī)械和免疫屏障，減輕全身炎性反應(yīng)，減少M(fèi)ODS發(fā)生及病程，從而降低病死率[19-20]。本課題組將柴芩承氣湯引入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的對比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：大鼠的胰腺損傷程度隨建模時(shí)間延長逐漸加重，柴芩承氣湯可有效改善SAP早期病情；隨著病情進(jìn)展胰腺組織中的CARD9 mRNA表達(dá)及磷酸化CARD9蛋白亦隨之增加；CQCQD組大鼠胰腺組織中CARD9 mRNA表達(dá)及磷酸化CARD9蛋白明顯低于同時(shí)間點(diǎn)的SAP組。本研究證實(shí)：柴芩承氣湯不僅可以降低SAP模型大鼠血清淀粉酶水平及胰腺病理損傷，而且可以降低血清CARD9 mRNA、TNF-α及IL-1β水平。提示SAP血清促炎因子升高可能與巨噬細(xì)胞存在CARD9 mRNA表達(dá)上調(diào)有關(guān)；早期給予SAP模型大鼠柴芩承氣湯可降低其血清TNF-α及IL-1β水平，可能是其下調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)CARD9 mRNA表達(dá)，抑制信號傳導(dǎo)及炎性因子的釋放，從而減輕SAP時(shí)胰腺減輕胰腺的病理損傷。

綜上所述，本研究首次將ROC曲線引入大鼠SAP模型的研究，通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)SAP大鼠模型CARD9 mRNA表達(dá)水平較TNF-α、IL-1β、病理評分的靈敏度、特異度及AUC值高，提示有較高的診斷準(zhǔn)確性，可以將其作為評估SAP病情的新靶標(biāo)。但由于本研究樣本量有限，大鼠的個(gè)體性差異可能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響。此外，課題組應(yīng)同時(shí)制備多個(gè)臟器的病理切片來觀察柴芩承氣湯對多器官的保護(hù)作用。今后還應(yīng)繼續(xù)收集臨床病例，進(jìn)行大樣本量、多中心臨床實(shí)驗(yàn)研究對動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成果進(jìn)行驗(yàn)證。